刚地弓形虫组蛋白H2Bb及H2Bv的免疫保护作用

中国兽医科学 2021，51 (03): 296-304

Chinese Veterinary Science

网络首发时间：2021-01-20

DOI: 10.16656/.l673-4696.2021.0043

中图分类号：

S852.723

文献标志码：

A

文章编号：

1673-4696(2021)03-0296-09

刚地弓形虫组蛋白H2Bb及H2Bv的免疫保护作用

周天缘于正青、李纯静王茗悦刘军龙2,罗建勋2,徐立新

宋小凯严若峰李祥瑞

(1.

南京农业大学动物医学院教育部动物卫生与食品安全国际联合研究实验室，江苏南京

210095;

2.

中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室

甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州

730046)

摘要：为了探究刚地弓形虫组蛋白

H2Bb

及

H2Bv

的体外表达及其对小鼠的免疫保护作用，以刚地弓形

虫

RH

株的cDNA作为模板，利用原核表达技术表达弓形虫组蛋白

H2Bb

及

H2Bv

。

表达后的上述重组蛋白

纯化后免疫小鼠，采集免疫后小鼠的血清，测定血清中的总一氧化氮（NO)、抗体及免疫相关细胞因子，分离

小鼠脾，测定小鼠脾淋巴细胞的呑噬功能，最后小鼠腹腔接种弓形虫并绘制小鼠的生存曲线。结果显示，成

功表达了弓形虫重组蛋白

H2Bb(rTgH2Bb)

及重组蛋白

FKBvCrTgl^BvhWestern-blot

结果表明重组蛋白具

有良好的免疫原性。重组蛋白

rTgH2Bb

及

rTgH2Bv

免疫组小鼠血清中丨

gGl

的水平在一免和二免后均与对

照组差异显著

（

P<0.05),rTgH2Bb

及

rTgH2Bv

免疫组小鼠血清细胞因子7干扰素的水平在一免及二免后

均有显著提高

（

P<0.05)

。

rTgH2Bb

和

rTgH2Bv

免疫组小鼠血清中NO含量在

2

次免疫后均显著高于对照

组

（

PC0.05

)。

二免后重组蛋白

rTgH2Bb

免疫组和

rTgH2Bv

免疫组小鼠脾淋巴细胞的吞噬能力均显著高于

对照组

（

P<0.05

)。

攻虫感染后，

rTgH2Bb

和

rTgH2Bv

免疫组小鼠的生存时间较对照组相比有所延长。结论：

重组蛋白

rTgH2Bb

和

rTgH2Bv

有一定的抗弓形虫急性感染的作用，具有作为弓形虫疫苗候选抗原的潜在

价值。

关键词：刚地弓形虫；组蛋白；原核表达；免疫保护；疫苗

Immunity protection effect of Toxoplasma gondii histone

H2Bb and H2Bv

ZHOU Tian-yuan1, YU Zheng-qing1,LI Chun-jing1, WANG Ming-yue1 ,LIU Jun-long2,

LUO Jian-xun2,XU Li-xin1 ,S0NG Xiao-kai1, YAN Ruo-feng1,LI Xiang-rui1*

(1. MOE Joint International Research Laboratory of Animal Health and Food Sc^ety/Colle ge of Veterinary Medicine ,Nanjing

A gricultural University, Nanjing 21

0095

, China ； 2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Key Laboratory of

Veterinary Parcuiit()logyr of Gansu Province/Lanzhou Veterinary Research Institute , Chinese Academy of A gricultural

Sciences .Lanzhou

730046

, China)

Abstract

：

To explore the expression of

Toxoplasma gondii

histone H2Bb and H2Bv

in vitro

and their

protective efficacy on mice,using the cDNA of

T. gondii

RH strain as a template,prokaryotic expression

technology was used to express

T. gondii

histone H2Bb and H2Bv. The mice were immunized with the purified

收稿日期

：2020-l 1-05;修

回日期

：2020-11-26

基金项目：

国家重点基础研究发展计划（973)项目（2015CB150300);家畜疫病病原生物学国家重点实验室（中国农业科学

院兰州兽医研究所）开放课题（SKLVEB2019KFKT009)

作者简介：周天缘（1996-)，女，江苏铜山人，硕士生，研究方向：寄生虫分子与免疫，日-〇^1:2018107049@咖1^(111.^*通

讯作者：李祥瑞（1958-)，教授，博士，博士生导师，主要从事寄生虫分子与免疫、兽医公共卫生和动物细胞因子

的基因克隆与应用研究，E-mail:*******************.cn。

第3期

周天缘等：刚地弓形虫组蛋白H2Bb及H2Bv的免疫保护作用

297

recombinant proteins. The serum of the immunized mice was collected to detect total nitric oxide (NO),

antibody and immune-related cytokines. The spleen of mice was separated and the phagocytosis of spleen

lymphocytes was determined. The mice were finally inoculated with

T

.

gondii in the abdominal cavity and

the survival curve of the mice was drawn. The recombinant protein H2Bb(rTgH2Bb) and recombinant protein

H2Bv(rTgH2Bv) of

T

.

gondii

were successfully expressed. Western-blot results showed that the recombinant

proteins have good immunogenicity. The levels of IgGl,cytokines interferon y(IFN-y) and NO expression

in the serum of mice immunized with recombinant protein rTgH2Bb and rTgH2Bv were significantly higher

than those in the control groups after the first and second immunizations (P<0. 05). After the second

immunization,the phagocytosis of mice spleen lymphocytes in the rTgH2Bb and rTgH2Bv immunized group

was significantly higher than those of the control groups (F<0. 05). After challenge infection, the su­

rvival time of mice immunized with rTgH2Bb and rTgH2Bv was longer than those of the control groups. In

conclusion,recombinant proteins rTgH2Bb and rTgH2Bv have a certain effect on acute infection of

T

.

gondii,which is conductive to as candidate antigens of toxoplasma vaccine.

Key

words

： Toxoplasma

gondi

i ； hi stone ； prokaryot i c expression ； immune protection ； vaccine

*

Corresponding

author

： LI Xiang-rui,E-mail ： lixiangrui@njau. edu. cn

弓形虫（Toxop/asma gone///)是一种专性的胞内

寄生性原虫，是一种具有人兽共患性的原生动物病

原，具有广泛的中间宿主范围，可感染大多数温血

动物,包括啮齿动物、鸟类和人类+2]。弓形虫对中枢

神经系统有一定的危害，可能导致精神分裂症[3]，在

胎儿、艾滋病患者等免疫反应缺陷人群中也常常引

起严重的感染，甚至引起死亡[1)。刚地弓形虫包囊等

在生肉中的存在引起严重公共卫生问题:5],成为人

类刚地弓形虫感染和刚地弓形虫病的传染源。动物

刚地弓形虫感染可以引起急性或慢性刚地弓形虫

病，造成严重的经济损失[6],常形成局部暴发流行，

严重影响畜牧业发展。

目前对于弓形虫病的治疗有很多报道，有些药

物具有较好的效果，如王帅发现磺胺氯吡嗪钠+

甲氧苄啶对人源（RH株〉和鸡源(JS株）弓形虫感染

都有较好的治疗效果，而且能够显著提高实验鼠和

鸡的存活率。然而，药物治疗也常常会伴随一些副

作用的产生，如使用某些磺胺类药物，往往引发机

体的过敏、毒性、骨髓抑制等不良反应[8]，且并不能

够完全治愈弓形虫病，复发率较高[9]。有关弓形虫的

疫苗仅有一款Toxovax曾在欧洲被批准用于预防绵

羊的流产，但由于其可能存在毒力返强风险，后也

不再使用™。因此，刚地弓形虫的防治工作十分重

要，疫苗免疫依然是预防该病的重要手段。

弓形体具有独特的核小体组成，核小体组织对

基因表达、复制和DNA修复的严格控制，保障了细

胞的发育、分化、生长和存活。目前对于组蛋白的研

究有大量报道，其不同的蛋白在进化上均呈现出高

度的保守性和种特异性[111。核心组蛋白是核小体的

组成部分。它们被分为2组：典型组蛋白和组蛋白

变体[121。核糖体的核心组蛋白包含H3、H4、H2A和

H2B™。在核糖体的组装过程中，这些核心组蛋白缠

绕于DNA之中，经过有序的相互作用，无论是体内

还是体外条件下，均可以抑制转录过程。组蛋白在

维持染色质结构方面也起着关键作用，此外，组蛋白

修饰介导的基因表达调控是目前表观遗传学研究的

热门领域[14]。

已有针对H2Bb蛋白及H2Bv蛋白的基因组位

置进行相关研究的报道％16]，且有文献表明弓形

虫独特的核小体含有一种非保守的H2Bv变异组蛋

白，可能是针对这种寄生虫的新疗法的靶点。本试

验探究了组蛋白H2Bb及H2Bv对弓形虫急性感染

免疫保护作用，以期对设计开发弓形虫疫苗提供理

论依据。

1材料与方法

1.1 实验动物

SD(SpragueDawley)品系大鼠（体质量为180〜

220 g)、BALB/c品系小鼠（体质量为18〜22g)，均

购自扬州大学兽医学院比较医学实验动物中心，并

饲养于南京农业大学实验动物中心。本研究中所有

试验方案均经南京农业大学实验动物福利与伦理委

员会审核批准，批准文件编号为PZ2019044。

1.2弓形虫虫株与细胞

刚地弓形虫人源国际标准株（RH株）保存于南

京农业大学兽医寄生虫病学实验室。人皮肤成纤维

细胞（human foreskin fibroblast，HFF)由华中农业大

学申邦教授赠送并保存于本实验室。

298

中国兽医科学

第51卷

1.3载体与主要试剂

原核表达载体pET-32a( + )和大肠杆菌DH5a、

BL21(DE3)均由本实验室保存。山羊抗大鼠（Goat

Anti-Rat) IgG(H+L)-HRP(产品批号：31470),青

霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin,产品货号:

15140-122),胎牛血清（产品货号：10099-141),均

由赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产。小鼠免疫

球蛋白G1 (IgGl )ELISA试剂盒（产品批号：JEB-

12870-201905)、小鼠免疫球蛋白 G2a(IgG2a)ELISA

试剂盒（产品批号：JEB-12877-201905)、小鼠7干

扰素（IFN-y)ELISA试剂盒（产品批号：JEB-12796-

201905)、小鼠白细胞介素4 (IL-4)ELISA试剂盒

(产品批号:JEB-12266-201905)、小鼠白细胞介素

17 (IL-17)ELISA 试剂盒（产品批号：JEB-12836-

201905)和小鼠白细胞介素10(丨L-10)ELISA试剂

盒（产品批号：JEB-12260-201905),均由南京金益

柏生物科技有限公司生产。总NO检测试剂盒（产品

批号：S0023)，购自上海碧云天生物技术有限公司。

TanonHigh-sig ECL Western Blotting Substrate 发光

液（产品批号：180-5001),购自上海天能科技有限公

司。异硫氰酸突光素-葡聚糖（FITC-dextran,分子

质量为40 000 u),购自西格玛奥德里奇（上海）贸易

表1蛋白的引物序列及酶切位点

Table 1 Primer sequences and restriction sites of two proteins

蛋白

Protein

H2Bb

GenBank ID

上游引物序列C —3')

Forward primer sequence

GCTGATATCGGATCCGAATTC

KYF40372

TTATTTGCCAGTGTACTTGGTG

GCTGATATCGGATCCGAATTC

H2Bv

KYF41213

ATGGTGGCCAAGAAGTCC

有限公司。小鼠脾淋巴细胞分离液试剂盒（产品批

号：P8860),购自北京索莱宝科技有限公司。总RNA

提取试剂盒（产品批号：R6834-01),购自Omega生

物公司。

1.4细胞和虫体的培养

从液氮中小心取出HFF细胞，立即置于37 °C

水浴中进行复苏，使用提前配制好的含100 HL/mL

胎牛血清（FBS)、含100U/mL青霉素和100 /xg/mL

链霉素的DMEM(改良伊格尔培养基）培养液进行

培养和传代。待HFF细胞生长至铺满培养瓶底的

80%，从液氮中取出弓形虫RH株，立即置于37 °C

水浴复苏，离心后加人到HFF细胞中培养，第2天

更换新的培养基。培养3 d左右，待有少许虫体从细

胞中释出时，刮下培养瓶内的细胞，用1 mL注射器

吹打细胞使其全部破碎，释出虫体，用5 Mm滤器过

滤纯化虫体

。一

部分继续置于培养瓶中培养，一部

分用于提取虫体可溶性蛋白和制备大鼠抗弓形虫

血清。

1.5重组质粒的构建与表达

据NCBI查阅到的组蛋白H2Bb及H2Bv的基

因序列，运用Primer Premier 5.0设计引物及酶切位

点（见表1)。

下游引物序列C —3J

Reverse primer sequence

CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT

ATGTCAGGGAAAGGTCCG

CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT

CTATGCACCAGAAGTCGTGTAC

酶切位点

Restriction sites

EcoR

I

/Hindlll

EcoR

I

/HindlW

用总RNA提取试剂盒提取纯化后的RH株速

殖子RNA并反转录获得cDNA。以弓形虫cDNA为

模板进行PCR扩增并对PCR扩增产物进行纯化，

将PCR产物克隆到已用£coR I和/*

k

IIII酶切处理

的原核表达载体pET-32a( + )中并转化至大肠杆菌

DH5«感受态细胞。涂板，37 °C过夜培养，挑选单个

菌落进行扩大培养，之后提取质粒进行双酶切鉴

定，琼脂糖凝胶电泳结果正确的，保留阳性质粒。将

阳性质粒转人大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑选

单个菌落进行培养后，测序比对基因序列。阳性菌

落于含氨苄青霉素（终质量浓度为50/^g/mL)的

Luria-Bertani(LB)液体培养基大量培养约4 h,经浓

度为0.1 mmol/mL的异丙基-办-D-硫代吡喃半乳

糖苷（1PTG)诱导、离心收集菌体，经过3次反复冻

融、超声破碎，离心收集上清。上清经His(组氨酸标

签）蛋白纯化柱纯化后用无K+的PBS(磷酸盐缓冲

溶液）透析，用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电

泳（SDS-PAGE)分析纯化结果。纯化后的重组蛋白

经浓缩后，用0.22 的滤器除菌分装，于一80 °C

保存备用。

1.6重组蛋白抗血清和大鼠弓形虫感染血清的

制备

将纯化后的200 Mg的重组蛋白rTgH2Bb、rT-

gH2Bv分别与等体积的弗式完全佐剂混合后乳化，

皮下多点注射首次免疫大鼠。2周后，取同样200 Mg

的纯化后的重组蛋白分别与等体积的弗式不完全佐

剂混合乳化后，皮下免疫大鼠。之后分别在首次免

疫后第3、4、5周进行三免、四免和五免，方法同二

第3期周天缘等：刚地弓形虫组蛋卩i H2Bb及H2Bv的免疫保护作用

299

免。五免后1周，大鼠眼眶采血，分离血清，一80 °C

保存备用。每孔用100 ng的重组蛋白rTgH2Bb、

rTgH2Bv分别包被ELISA平板，检测抗体效价。

大鼠弓形虫感染血清的制备：将纯化后的弓形

虫速殖子用PBS稀释至1父10711^-取1 mL弓形

虫悬液腹腔注射大鼠，感染后第21天，采血分离血

清，于一 80°C冰箱保存备用。

1.7 重组蛋白

rTgH

2

Bb

和

rTgH

2

Bv

的免疫印迹

(

Western

-

blot

)分析

取20 Mg重组蛋白rTgH2Bb和rTgH2Bv分别

进行SDS-PAGE,电泳结束，将蛋白分别转印到已用

甲醇激活30 s的聚偏二氟乙烯（PVDF)膜上。将膜

放人含50g/L牛血清白蛋白（BSA)的PBST(含有

Tween-20的PBS)溶液中37 °C封闭2 h,以大鼠弓

形虫感染血清（1 : 100稀释）为一抗,4 °C过夜孵育。

表

2

试验分组与免疫程序

第2天弃孵育液，PBST漂洗5次，每次6 min。以辣根

过氧化物酶（HRP)标记的山羊抗大鼠lgG(l : 6 000

稀释）为二抗对所有膜进行孵育，37 °C作用1.5 h，

PBST漂洗5次，每次6 min。最后，加入ECL发光液

曝光拍照。正常的大鼠血清作为阴性对照。

1.8小鼠免疫保护试验的分组、免疫程序及感染

将100只BALB/c小鼠随机分成5组（每组20

只），分别为 rTgH2Bb、rTgH2Bv、pET-32a(+ )、PBS

和Blank对照组。分别按表2中的免疫程序进行皮

下免疫。试验的第7、14天，每组分别取5只小鼠，

摘眼球采血分离血清

，一

80°C冻存，用于抗体和细

胞因子的检测；另取脾分离淋巴细胞。在第14天，

感染所有小鼠，每只小鼠腹腔感染1X103个弓形虫

RH株速殖子。每天观察小鼠的生活状态并记录小

鼠的存活时间。

Table 2 The immunization strategy and groups of experimental mice

组别

Groups

rTgH2Bb

rTgH2Bv

pET-32a( + )

PBS

Blank

一免(第0天）/免疫数量

Immunization program (Day 0)/Quantity

20 Mg rTgH2Bb/20

20 Mg rTgH2Bv/20

20 Mg pET-32a/20

20 yLPBS/20

无/20

二免（第7天）/免疫数量

Immunization program (Day 7)/Quantity

20 MgrTgH2Bb/15

20 MgrTgH2Bv/15

20 Mg pET-32a/15

20

m

LPBS/15

无/15

1.9抗体及细胞因子的检测

用南京金益柏生物科技有限公司生产的试剂

盒，定量检测小鼠血清中抗体丨gGl、IgG2a及细胞因

子 IFN-y、IL-4、IL-10JL-17。

1.10

NO

的检测

小鼠血清中NO的检测，按照总NO检测试剂

盒说明书进行。

1.11小鼠脾淋巴细胞吞噬功能的流式细胞术检测

1.11.1小鼠脾淋巴细胞的分离试验的第7、14

天，分别每组取5只小鼠，从小鼠体内分离出脾，参

照小鼠脾淋巴细胞分离液试剂盒（P8860)的说明分

离淋巴细胞。

1.11.2 小鼠脾淋巴细胞呑噬功能的流式细胞术检

测调整“1.11.1”中分离得到的淋巴细胞浓度至1〇7

mL-1，取100 "L(艮P 106个细胞）至1.5 mL离心管

中；加人100 PL异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖

(FITC-dextran,分子质量40 000 u,质量浓度为1

mg/mL),轻轻混匀，操作过程中注意避光；37 °C避

光孵育 60 min。2 500 r/min 离心 5 min,用含 20

mL/L FBS的预冷的PBS再洗涤3次，500 y L PBS

重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。

1.12数据分析

使用GraphPadPrism6软件进行分析，采用One-

way ANOVA比较组间差异显著性，P<0.05表示差

异性显著。

2结果

2.1

TgH

2

Bb

及

TgH

2

Bv

的克隆

琼脂糖凝胶电泳结果（见图1)显示，PCR产物

的长分别为 348 bp(TgH2Bb)、372 bp(TgH2Bv)左

右，与预期结果相同。

2.2 重组表达质粒

pET

-32

a

(+) -

H

2

Bb

和

pET

-

32

a

( + )-

H

2

Bv

的构建和鉴定

重组表达质粒 pET-32a (+ )-H2Bb、pET-32a

(+ )-H2Bv分别经EcoR I和H/ndIII双酶切后，得

到大小约348、372 bp的目的片段（见图2)。测序结

果也与预期一致。

2.3重组蛋白的纯化

将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE,得到清

晰单一的条带（见图3)。

300

中国兽医科学

第51卷

A B

图

1 TgH2Bb

和

TgH2Bv PCR

产物的琼脂糖凝胶电泳

检测

Figure 1 Agarose gel electrophoresis detection of TgH2Bb

and TgH2Bv PCR products

M: DNA 分子质量标准；1: TgH2Bb (A)和 TgH2Bv (B)的 PCR 产物

M ：DL2000 DNA Marker； 1 ： PCR products of TgH2Bb(A) and TgH2Bv

(B).

Ml M2

5 000 bp

3 000 bp

2 000 bp

1 500 bp

1 000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

100 bp

图

2 pET-32a (+) -H2Bb

和

pET-32a (+) -H2Bv

的双酶切

鉴定

Figure 2 Identification of recombinant plasmids pET -32a

( + )-H2Bb and pET-32a ( +)-H2Bv by restriction en­

zyme digestion

M:DNA 分子质量标准；l:pET-32a(+)-H2Bb 的 EcoR I 和 M/idlll

双酶切产物；2:pET-32a( + )_H2Bv的EcoR I和HhdIII双酶切产物，

M：DL5000 DNA Marker；1 ：pET~32a(+ )~H2Bb digested by

EcoR

I

and H//idIII ；2 ：pET-32a( )~H2Bv digested by

EcoR

I and

HindUl.

2.4 重组蛋白

rTgH

2

Bb

和

rTgH

2

Bv

大鼠抗血清

效价的检测

五免后第6天用间接ELISA法检测大鼠血清

中 pET-32a-H2Bb、pET-32a_H2Bv 蛋白抗体的效价

分别为222、224。

M 1

UU ku

75 ku

75 ku

63 ku

63 ku

48 ku

48 ku

35 ku

35 ku

25 ku

25 ku

17 ku

17 ku

11 ku

11 ku

B

图

3

重组蛋白

TgH2Bb

及

TgH2Bv

的纯化产物的

SDS-

PAGE

分析

Figure 3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant

TgH2Bb and TgH2Bv

M:蛋白质分子质量标准；1:纯化后的TgH2Bb(A)和TgH2Bv(B)。

M：Protein molecular weight Marker； 1 ：TgH2Bb (A) and TgH2Bv(B)

purified through Ni2+ charged column chromatography and after dialysis,

respectively.

2.5 重组蛋白

rTgH

2

Bb

和

rTgH

2

Bv

的

Western

-

blot

分析

TgH2Bb、TgH2Bv蛋白的大小分别约为12.7、

13.6 1〇1，标签蛋白的大小约为18 1^11。^^316171-匕1〇1

结果如下：图4A显示一条大小约为30 ku的条带，

表明rTgH2Bb能被弓形虫感染大鼠的血清识别；图

4B显示一条大小约为31 ku的条带，表明rTgH2Bv

能被弓形虫感染大鼠的血清识别。

2.6

BALB

/

c

小鼠的免疫保护试验

2.6.1 小鼠血清中抗弓形虫特异性抗体的检测

如图5A所示，在2次免疫后，采集的小鼠血清中免

疫组均可检测到较高水平的IgGl抗体。其中rT-

gH2Bv免疫组在第1次免疫后IgGl抗体水平极显

著高于3个对照组（P<0.01),3个对照组间IgGl

抗体水平无显著差异（P>0.05)。然而，小鼠血清中

的IgG2a在免疫前后并无明显变化（见图5B)。

2.6.2 小鼠血清中细胞因子的检测试验第7天、

第14天分别收集血清样品，用于测定血清中细胞

因子 IFN-7、IL-4、IL-10JL-17 的含量。血清中 IFN-y

的含量如图6A所示，各免疫组小鼠血清中IFN-y

的含量均显著高于3个对照组，空白对照组、PBS对

照组及空载体蛋白对照组间并无显著差异（P >

mBb免疫组小鼠血清的IFN-7含量在二

免后极显著高于3个对照组（P<0.01)。其他细胞因

子含量与对照组差异不显著（见图6B、C、D)。

2.6.3 小鼠血清中NO的检测如图7所示，一免及

第3期

周天缘等：刚地弓形虫组蛋白H2Bh及H2Bv的免疫保护作用301

M

2

180 ku

130ku

180 ku

I 130 ku

95

7〇

ku

ku mm

Z

95 ku

55 ku …

70 ku

43 ku

55 ku

43 ku

33 ku

33 ku

25 ku

17 ku

^

10 ku

〜

图

4 rTgH2Bb

和

rTgH2Bv

的

Western-blot

分析

Figure 4 Western-blot analysis of rTgH2Bb and rTgH2Bv

A:rTgH2Bb的Western-blot分析（M:蛋白质分子质量标准；1 :rTgH-

2Bb与人工感染的抗刚地弓形虫的大鼠血清的Western-blot分析；

2 :rTgH2Bb与大鼠空白血清的Westem-blot分析）；B :rTgH2Bv的

Western-blot分析（M:蛋白质分子质量标准；1: rTgH2Bv与人工感

染的抗刚地弓形虫的大鼠血清的Western-blot分析；2 :rTgH2Bv与

大鼠空白血清的Western-b丨ot分析）

A：Western-blot analysis of rTgH2Bb (M：Standard protein molecular

weight Marker； 1 ：Recombinant protein TgH2Bb probed by serum from rats

experimentally infected with

T. gondii as

primary antibody ；2： Recombinant

protein TgH2Bb probed by serum of normal rats as primary antibody) ；B：

Western-blot analysis ofrTgH2Bv (M ： Standard protein molecular weight

Marker； 1 ：Recombinant protein TgH2Bv probed by serum from rats ex­

perimentally infected with

T. gondii

as primary antibody；2：Recombinant

protein TgH2Bv probed by serum ofnormal rats as primary antibody).

A

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图

5

小鼠免疫前后特异性抗体的变化

Figure 5 The dynamics of specific antibody level in BALB/c

mice induced by rTgH2Bb and rTgH2Bv vaccination

0501 001.下图同 The same as follows.

二免后从rTgH2Bb和rTgH2Bv免疫组采集的小鼠

血清中NO的含量较对照组相比均有显著升高，且

对照组间无显著差异(P>0.05h其中rTgH2Bb免疫组

小鼠血清中NO的含量极显著高于对照组(PC0.01)。

2.6.4 小鼠脾淋巴细胞吞噬能力的检测试验第7

天（见图8A),各免疫组小鼠脾淋巴细胞的吞噬能力

与对照组相比差异不显著（P>0.05);但在试验

第14天（见图8B)，重组蛋白rTgH2Bb和rTgH2Bv

免疫组小鼠脾淋巴细胞的吞噬能力显著高于对照

组（P<0.05,P<0.01)，对照组之间差异不显著

(P>0.05)o

2.6.5攻虫试验在腹腔感染1X103个弓形虫速

殖子后的5 d里，各组小鼠均正常采食饮水，小鼠状

态与感染前无明显区别。在感染后第7天，对照组

小鼠活动能力有所下降，畏寒蜷缩并抱团，背毛竖

立且食欲不佳，精神状态差。对照组的小鼠均在10

d之内死亡（见图9)。rTgH2Bv免疫组小鼠存活时

间稍有延长，在第11天全部死亡，而rTgH2Bb免疫

组小鼠的存活时间延长至第12天。

3讨论

本研究成功克隆了弓形虫TgH2Sb基因和

基因，且均在大肠杆菌中获得成功表达。

Western-blot 结果表明 rTgH2Bb、rTgH2Bv 蛋白具

有良好的免疫原性。分别用重组蛋白rTgH2Bb、

rTgH2Bv经皮下免疫注射的方式对BALB/c小鼠进

行免疫保护试验，通过检测抗弓形虫特异性抗体、

相关的细胞因子、小鼠血清中NO的含量、小鼠脾淋

巴细胞的吞噬能力以及小鼠存活时间来评价重组

蛋白的保护效果。

抗原不同将会诱导不同的免疫应答，DNA疫苗

诱导Thl型免疫应答，即高水平lgG2a和低水平

IgGl的异质性IgG应答™。某些重组抗原可引起

Thl型和Th2型混合反应，产生高水平的抗原特异

性IgGl和IgG2a抗体#'本试验结果显示，重组

蛋白rTgH2Bb及rTgH2Bv免疫组的小鼠在一免后

第7天均可产生较高水平的丨gGl抗体，且显著高于

对照组；在第14天时，免疫组小鼠的IgGl抗体水平

显著高于对照组。IgG2a的水平则各组间无显著差

异，且IgGl的水平高于IgG2a的水平，这表明重组

蛋白rTgH2Bb、rTgH2Bv能诱导小鼠产生以Th2型

为主的体液免疫反应。

Thl细胞主要分泌IFN-y、lL-2、TNF-a等来调

节细胞免疫反应；Th2细胞主要分泌IL-4JL-5、

IL-6JL-9、丨L-10和IL-13等，调节体液免疫和超敏

302

中国兽医科学

第51卷

IFN-y

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时间

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图

6

小鼠免疫前后细胞因子的变化

14

时间

/d Time

Figure 6 The dynamics of cytokine production in BALB/c mice induced by rTgH2Bb and rTgH2Bv vaccination

80-1

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14

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图

7

免疫后小鼠血清中

NO

的含量

图

9

感染弓形虫

RH

株后小鼠的生存曲线

Figure 7 The content of NO in serum of immunized mice Figure 9 Survival curve of mice after challenge infection

with Toxoplasma gondii RH strain

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组别

Group

图

8

免疫后小鼠脾淋巴细胞的吞噬能力

>

组别

Group

Figure 8 Phagocytic capacity of splenic lymphocytes in mice after immunization

A:试验第7天小鼠脾淋巴细胞的吞噬能力；B:试验第14天小鼠脾淋巴细胞的吞噬能力。

A ：The phagocytic ability of mouse splenic lymphocytes on day 7 ；B ：The phagocytic ability of mouse splenic lymphocytes on day 14.

第3期

周天缘等：刚地弓形虫组蛋内H2Bb及H2Bv的免疫保护作用

303

反应；IL-17能够引起生成炎性细胞因子|22]。对抗弓

形虫的细胞因子主要有IFN-y和1L-4。在试验第7

天及第14天采集的小鼠血清中，rTgH2Bb和rT-

gH2Bv免疫组的IFN-y水平均显著高于对照组，但

免疫组细胞因子IL-4的水平较对照组相比，在免疫

前后无显著差异，且1L-4水平较低。这与Costa-

Silva等18]的研究结果一致。细胞因子IL-10和IL-

17 的水平在小鼠免疫前后无明显变化。这表明重组

蛋白rTgH2Bb、rTgH2Bv能够引起Thl型细胞免疫

反应。

-•氧化氮（Nitric oxide,NO)被广泛认为在对控

制或杀灭弓形虫速殖子方面起着重要作用〜，且有

研究表明，NO生成的增加可以抑制寄生虫的增殖@]。

rTgH2Bb和rTgH2Bv免疫组小鼠血清中NO含量

在第7天和第14天与对照组相比，均有显著增长。

这可能会对急性感染弓形虫后的小鼠提供一定的

保护。

吞噬试验在第14天时，重组蛋白免疫组小鼠

的脾淋巴细胞吞噬能力较对照组相比均显著增强，

这表明重组蛋白可以显著增强淋巴细胞的吞噬能

力，有利于宿主对弓形虫的清除。

小鼠腹腔感染弓形虫速殖子后，rTgH2Bb和

rTgH2Bv免疫组小鼠的存活时间有所延长，表明重

组蛋白rTgH2Bb和rTgH2Bv在低剂量免疫时，仍

可以在对抗弓形虫急性感染的过程中起到一定的

保护作用。

综上所述，重组蛋白rTgH2Bb和rTgH2Bv可

以诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反

应，对于经人源（RH株）弓形虫急性感染的弓形虫

小鼠模型有一定的免疫保护作用，具有作为弓形虫

疫苗的潜在价值，在之后的研究中，可以调整免疫

剂量、选择合适的佐剂或改进免疫策略〜261等以提

高重组蛋白的免疫保护效果。

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(责任编辑胡志敏）