剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响

剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响

蛋白免疫印迹( Western blot) 是当前蛋白分析的一种常规

技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，

用于检测样品中特异蛋白存在与否、细胞中特异蛋白的半定量分析和

蛋白质分子相互作用的研究。在药理学研究中，使用蛋白免疫印迹分

析通常都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，常采用灰度

分析软件检测目的蛋白及内参条带的表达强度，以分析药物等处理因

素对目的蛋白的影响。但由于该检测方法步骤较繁琐，实验变量较多，

结果不稳定等特性，使得应用该法测定组织中的目的蛋白浓度时常常

会遇到困难，需花费大量的人力物力财力和时间去摸索实验条件。虽

然各种教科书和网络上都有讨论如何做好蛋白免疫印迹分析，并提出

各种注意事项，但作为药理学工作者，仅有这些常识仍不能很好完成

药理学评价，甚至做出相反的实验结果。本实验从实验实践分析出发，

讨论蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素及处理方

法，为广大药理学工作者提供参考。

1 实验材料

1. 1 细胞丙型肝炎

病毒( HCV) 感染的人肝传代细胞系Huh7. 5 细胞，用0.

05%-EDTA 胰酶消化传代，用含10%灭活胎牛血清及每毫升100 单位

青霉素和100 单位链霉素的DMEM 培养基正常传代和富集培养。

1. 2 主要生化试剂

DMEM、胎牛血清( 美国GiBco 公司) ; 细胞总蛋白提取试剂

CytobusterTM Protein Extraction Reagent( 美国Novagen 公司) ;

蛋白酶抑制剂Complete proteaseinhibitor cocktail tables( 德

国Roche Applied Science公司) ; Penicillin-Streptomycin 双抗、

PBS、0. 05%-EDTA 胰酶均( 中科迈晨科技有限公司) ;5 ×

Loading Buffer ( Lane Marker Sample Buffers ) 、PageRulerTM

Prestained Protein ladder、PierceTM BCAProtein Assay

Kit( Thermo Scientific 公司; 30% 丙烯酰胺溶液、1. 5 mol·L -

1 Tris-Cl ( pH 8. 8) 、1 mol·L - 1 Tris-Cl ( pH 6. 8) 、10%

SDS 溶液、TEMED、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷Tris 碱、甘氨酸、

十二烷基硫酸钠SDS( 北京普利莱基因技术有限公司) ; 聚山梨酯

20( 西陇化工股份有限公司) 。无水乙醇、浓盐酸、NaCl、甲醇、异

丙醇等均为分析纯; PVDF 膜和化学发光液ImmobilonTM Western

ChemiluminescentHRP Substrate ( 美国Millipore 公司) 。

1. 3 抗体

抗HCV Core 蛋白小鼠单抗( C7-50，ab2740 )( 英国Abcam 公

司) ; 小鼠抗Gapdh 和小鼠抗Tubulin单抗( 中杉金桥生物技术公

司) ; 抗小鼠IgGHRP-linked ( Cell Signaling 公司) 。

1. 4 主要仪器

Mini-Ⅲ型电泳系统、Bio-Rad 湿转系统和凝胶成像系统

( PowerPac 200、ChemiDocTM XRS + ) 均为美国BIO-RAD 公司。

2 实验方法

2. 1 实验步骤

2. 1. 1 细胞总蛋白的制备将3 瓶T75培养瓶内HCV 感染的

Huh7. 5 细胞用胰酶消化后，分别用6ml DMEM 吹散后收集并以1 000

× g 离心5 min，弃上清，细胞用600 μL 蛋白裂解液裂解

45 min ( 冰浴) 后在4 ℃条件下12 000 × g 离心20 min，

上清吸出混匀后分装，每管100 μL，取一管用于蛋白定量，其他

分别加25 μL 5 × Loading Buffer 煮沸10 min，- 20 ℃

保存等测。

2. 1. 2 蛋白免疫印迹分析操作步骤常规方法配置5% 积层

胶和10% 分离胶，胶厚1. 0 mm。上样后，恒压电泳( 冰浴条件) ，

积层胶55 V 40 min，分离胶115 V 60 min。以240 mA 转膜60 min

( 冰浴) ，在摇床上用5% 脱脂牛奶封闭60 min。用3% 脱脂牛奶将

一抗稀释到相应浓度和体积，并根据实验要求孵育相应时间。一抗孵

育后将膜用1 × TBST洗3 遍，10 min·次- 1。用1 ×

TBST 将二抗稀释到所需浓度和体积，摇床孵育60 min。将膜用1

× TBST 洗3 遍，10 min·次- 1。将发光液ImmobilonTM

Western HRP Substrate Luminol Regent和ImmobilonTM Western HRP

Substrate Peroxide Regent以1∶ 1 配制，根据实验所需，稀释发

光液以及选择曝光时间，在凝胶成像系统上进行曝光显影成像。

2. 2 实验条件控制为利于结果比较，严格控制实验条件，确

保前后实验条件一致，主要措施有: 采用比较准确的BCA 法测定总

蛋白浓度，相同条件电泳至少重复试验3 次，且多次测量求平均值;

溶液配制采用屈臣氏蒸馏水; 所有使用到的溶液均为一次性使用，且

现用现配，以避免溶液离子强度改变造成的影响; 均在冰水中进行电

泳和电转，以避免室温改变带来的影响等。

2. 3 数据处理蛋白浓度数据由灰度分析软件扫描产生，某一

目的蛋白的浓度采用相对定量，以内参进行校正( 即目的蛋白浓度/

内参蛋白浓度) 。3 次以上实验结果求平均值，数据用均数±

标准差表示。

3 实验结果

3. 1 蛋白浓度定量用BCA 定量试剂盒对从感染HCV 的Huh7.

5细胞内提取的总蛋白准确多次测定，计算出细胞裂解液总蛋白质量

浓度为( 3. 41 ± 0. 31) μg·μL - 1。

3. 2 蛋白上样量对检测结果的影响。

3. 2. 1 不同浓度但相同上样体积进行SDS-PAGE对检测结果

的影响为比较不同浓度但相同上样体积对半定量检测结果的影响，首

先对样品进行对倍稀释( 用1 × Loading Buffer 稀释1 ～

128 倍) 后，上样相同体积( 即均为20 μL) 进行SDS-PAGE。结

果显示，目的蛋白Core 及2 个内参蛋白Tubulin 和Gapdh的浓度

强度均与蛋白总上样量有剂量相关性，但只在一定上样量范围内有线

性关系，超过范围( 即上样量过高或过低) 其蛋白强度变化幅度变

小。通过用内参校正( 半定量方法，即Core /Tubulin或Core

/Gapdh) ，目的蛋白Core 也同样显示有一定的线性范围，超过上样

量范围其蛋白强度变化幅度也变小(，甚至变得不敏感。但用内参

Tublin 或Gapdh 作内参对照校正后却有相似的曲线，说明选用何种

内参作为对照不影响实验结果的分析。

3. 2. 2 相同浓度不同上样体积进行SDS-PAGE对检测结果的

影响为比较相同浓度但不同上样体积对半定量检测结果的影响，采用

原液浓度加不同体积( 0. 5 ～ 20 μL) 上样进行SDS-PAGE。结

果显示，通过用内参( Gapdh) 校正后的总蛋白浓度-相对强度曲线

( 图1C) 与不同浓度相同上样体积的曲线相似，提示这两种上样方

法不影响实验结果，实验结果主要影响因素为蛋白上样量。

3. 3 检测结果的平行性分析

在药学上，常分析药物处理后对某目的蛋白在含量上的影响，

但由于蛋白免疫印迹分析是半定量实验技术，有一定的误差，那么在

多大误差范围内可以接受呢? 为分析这个问题，根据上述实验结果，

我们选取线性较好实验结果较为敏感的浓度进行实验。采用相同浓度

( 原液用1 × Loading Buffer 4倍稀释，即0. 85 μg ·μL

- 1 ) 相同上样体积( 20μL) ，即相同蛋白量，每次8 孔，实验

重复3 次，分析其平行性( n = 24) 。结果发现，以内参校正后，

Core /Tubulin 为( 0. 556 ± 0. 065) ，误差为11. 76%; Core

/Gapdh 为( 0. 943 ± 0. 133) ，误差为14. 12%; Gapdh

/Tubulin 为( 0. 595 ± 0. 070) ，误差为11. 83% 。因此

本实验初步认为，蛋白免疫印迹分析对允许误差范围应控制在15% 以

内，超过这个误差，得出的实验结果在下结论时( 即处理因素上调或

降低某目的蛋白的结论) 应谨慎。

3. 4 一抗浓度和孵育时间对检测结果的影响

为分析一抗浓度和孵育时间是否对半定量实验结果造成影

响，本实验在SDS-PAGE 完成并转膜后采用不同一抗浓度( Core 抗

体的稀释倍数分别为500、2 500 和12 500; Gapdh 抗体的稀释倍数

分别为500、5 000 和50 000; Tubulin 的稀释倍数与Gapdh的相同)

分别孵育不同时间( 0. 5、2. 5 和14 h) 。实验结果显示，用Tubulin

校正后，Core 蛋白相对强度与一抗浓度和孵育时间不相关，其相对

强度约在( 0. 93 ± 0. 03) ，用Gapdh 作内参也有相似的

结果，其相对强度约在( 1. 11 ± 0. 08 ) ，用内参作相互

比较，也有相似的结果( 0. 84 ±0. 07)，即校正后的比值不

受一抗浓度和孵育时间的影响。结果提示，只要能得到清晰的实验条

带，可以适当增加一抗稀释度以节约成本，或缩短实验时间以提高工

作效率。

3. 5 发光液浓度对检测结果的影响

为分析发光液浓度是否对半定量实验结果造成影响，本实验

在显色成像时用TBST 对发光液进行稀释( 原液、2 倍、10 倍和50

倍稀释) ，由于50 倍稀释的发光液曝光条带不清晰，其他浓度的发

光液均能有质量好的条带，在条带质量较好的条件下，半定量结果没

有差别，但成像时间差别较大，发光液在原浓度时很快形成高质量的

条带( 1 ～ 10 s) ，而在浓度较低时，形成高质量的条带所需时间

相对较长( 30 ～ 40 s) ，而在更大稀释度( 如50 倍) 时，蛋白浓

度低时甚至不能形成高质量的条带。

4 讨论

蛋白免疫印迹分析常应用在药物药理学上的研究，因其结果

比较直观而颇受欢迎，成为经典实验方法，以内参作对照，分析药物

等处理因素对目的蛋白的影响。由于蛋白免疫印迹分析的实验步骤较

多，影响因素相对难于控制，因此做好相对定量需要摸索实验条件，

以便得出正确可靠的结论，这与定性的要求不完全一样，定性的结果

只要有清晰的实验条带就行，而半定量的要求更高。本实验以HCV感

染的细胞为例，以病毒编码的Core 蛋白为目的蛋白，以内参Tubulin

和Gapdh 作对照，分析蛋白免疫印迹分析在半定量分析中的影响因

素及注意事项。

首先是关于上样量的问题。本实验说明半定量的结果主要影

响因素是目的蛋白上样量，因此上样量需要根据目的蛋白的丰度作适

当的调整，不能只依据总蛋白含量确定，如果目的蛋白的丰度较高，

则应适当降低上样量，反之，则应增加上样量，以免导致假阴性( 即

药物处理后目的蛋白含量未发生明显变化)，因为超过检测线性范围，

导致检测敏感性降低( 即变化幅度变小) 。因此，在正式实验之前，

最好先做不同上样量的分析，找到合适的线性范围，以得到公正、客

观的半定量实验结果。

关于上样量的调整方法问题。在实验中，通常要做可比性，

如用药理处理后，细胞培养上清的病毒含量本身有一定的变化，但如

要分析相同病毒量的条件下某目的蛋白的变化，就要适当调整上样

量。本实验用稀释法或减少上样体积的实验结果说明上样方法对半定

量实验结果的影响不明显。因此，如果蛋白浓度较大时，直接减少上

样体积是行之有效的方法，反之则可直接适当增加上样体积，可有效

完成对比实验。

关于内参的选择。目前可选内参较多，有细胞骨架蛋白

β-actin 或β-tubulin，细胞总蛋白

Gapdh( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ，核蛋白

Histone、Rb、Lamin 系列、TATA binding protein( TBP) 、Pax-5、

PCNA 等。本实验以Gapdh 和Tublin 为例说明，选用何种内参对半

定量实验结果的影响不明显。因此根据实验需要和目的蛋白所在组织

中的位置，选择适当的内参即可。

关于一抗浓度和孵育时间的确定。理论上，为了做好蛋白免

疫印迹分析，这方面的要求比较明显，而在半定量分析上，这与蛋白

免疫印迹分析定性的要求基本一致，只要能得到清晰的实验结果，可

以适当增加一抗稀释度以节约成本，或缩短实验时间以提高工作效

率。

我们同时还分析了发光液浓度是否对半定量实验结果造成影

响。实验结果显示，在条带质量较好的条件下，不影响半定量的结果，

但成像时间差别较大，可以利于这点来改变条带质量，当蛋白浓度较

高或抗体的效价较高时，适当稀释发光液以免过曝，从而形成质量较

好的条带。关于药物处理后有效性问题。很多论文都做药理学评价，

如果药物作用后，某种目的蛋白上调或下降一定程度而且还有统计意

义则通常认为药物对靶蛋白有效，但由于蛋白免疫印迹分析只为半定

量，有一定的缺陷性，导致一定的误差。本实验通过多次实验分析提

示，如果处理因素作用后，目的蛋白尽管上调或降低，多次实验也有

统计意义，但如果只发生了较低幅度的变化( 如与处理因素相比，其

变化在15% 或以内) ，这种药理作用则难于令人信服，下这种结论

需要慎重。

总之，药理学上常用蛋白免疫印迹分析进行半定量，其主要

影响因素为目的蛋白的上样量; 为改变其上样浓度，应用稀释法或改

变上样体积调整蛋白上样量均可得到相似的结果; 在得到清晰的条

带的基础上，可以适当增加一抗稀释度以节约成本，或缩短实验时间

以提高工作效率; 同时还可适当稀释发光液以免过曝，形成质量较好

的条带。由于半定量有一定的缺陷，在分析处理因素有效或无效的时

候，目的蛋白的变化要有一定的幅度，否则即使有一定的统计学意义，

其结论仍需甄别。