基于静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器的研究

摘要

本论文可分为两部分：

一．生物传感器中生物分子固定化方法的研究．生物传感器中生物活性物质的固定是

改善传感器性能最关键的步骤之一．传统的ｆ司定方法如共价键合和包埋法等对同定

在传感界血ｉ上的生物活性物质的活性影响较大，如采用静电吸附或非特异吸附来实

现生物活性物质的同定，可以很大程度上解决上述问题．本文试利用壳聚糖，改性褐

藻酸钠和纳米二氧化钛等几种＝ｉ＿ｆｉ同性质的物质通过静电吸附或者非特异吸附来实

现生物活性物质的同定．

１）研制了一种基于壳聚糖和溴化氰改性褐藻酸钠凝集作用的日本血吸虫安培免

疫传感器。褐藻酸钠一抗体复合物通过静电吸附作用被凝集到含石墨一石蜡一壳聚

糖组分的电极表血，然后与抗原和酶标抗原进行竞争反应，以邻氨基酚为电子媒介，

通过测定酶催化下双氧水对其氧化的电流大小来间接测定抗原的浓度。响应电流与

血吸虫抗原在Ｏ．６４—４０

ｔｔｇ／ｍＬ之间呈准线性关系。线性回归方程为：

卜一１７．３０８ｃ＋３４．５７２，相关系数ｒ为Ｏ．９８５。

２）利用纳米二氧化钛颗粒与碳粉的协同作用，制备了一种高灵敏度的过氧化氢

传感器．辣根过氧化物酶通过与纳米二氧化钛之间的静电力和碳粉的非特异吸附而

同定在电极表面，以邻米二酚为电子媒介，对过氧化氧进行了测定．ＨＲＰ酶的响麻电

流在２．４×１０。４－－３×１０。７ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２０２的浓度范同内呈线性关系，灵敏度为ｏ．１１０１

ＡＬ

ｍｏｌ。ｃｍ～，校正系数为０．９９３（ｎ＝１３）。

二．酶联荧光免疫体系中底物的研究．酶联荧光免疫体系中的关键部分在于生物活性

物质的同定和荧光底物的选择．本文试发展几种新的荧光底物用于酶联荧光免疫体

系的榆测．

３）将纳米Ｔｉ０２颗粒用作固定抗体的载体，以辣根过氧化物酶标记ｃ３补体

（ＨＲＰ．ｃ３）．ＨＲＰ－Ｃ３与待测ｃ３发生竞争性免疫反应，反应的ＨＲＰ—Ｃ３可催化荧光底

物３，３’，５，５，．四甲基联苯胺（ＴＭＢ）转化为无荧光物质，由测得ＴＭＢ＋Ｈ２０２混合底物溶

液的荧光降低的大小判断待测ｃ３的浓度，荧光值与Ｃ３补体在６．５ｎｇ／ｍＬ到７５ｎｇ／ｍＬ

之间呈准线性关系，相关系数为０．９７３．

４）以聚苯乙烯（Ｐｓ）制成支持体，通过疏水性非特异吸附将ＩｇＧ同定在其表面，然后

与ＧａｌｇＧ和酶标ＧａｌｇＧ进行竞争免疫反应，以双氧水和甲哌氯丙嗪混台溶液为荧光

底液，通过测定３９５ｎｍ处荧光增强的多少来测定Ｇａ］【ｇＧ的浓度．荧光响应与ＧａｌｇＧ

浓度在２ｎｇ／ｍＬ到６０ｎｇ／ｍＬ之间呈准线性关系。相关系数为０．９８１

关键词

生物传感器，生物分子同定化，酶联荧光免疫体系，底物

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｔｈｉｓ

ｔｈｅｓｉｓ

ｗａｓ

ｃｏｍｐｏｓｅｄ

ｏｆｔｗｏ

ｐａｎｓ．

１．Ｓｔｕｄｙｉｎｇ

ｔｈｅ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ

ｉｎ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ

ｏｆ

ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ

ａｒｅ

ｏｎｅ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｍｏｓｔ

ｉｍｐｏｒｔａｎｔ

ｔｏ

ｉｍｐｒｏｖｅ

ｔｈｅ

ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ

ｏｆ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｔｏ

ｐｒｅｓｅｒｖｅ

ｔｈｅ

ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ

ａｃｔｉｖｉｔｙ

ｏｆｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｊＳ

ｐａｒａｍｏｕｎｔ．Ｔｈｅｒｅ

ａｒｅ

ｍａｎｙ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｍｅｔｈｏｄｓ

ｗｅ

ｃａｎ

ｕｓｅ，ｓｕｃｈ

ａｓ

ｃｏｖａｌｅｎｔ

ｂｏｎｄａｎｄ

ｎｏｎ—ｃｏｖａｌｅｎｔ

ｂｏｎｄ．Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ

ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｎｏｎ．ｓｐｅｃｉｆｉｃａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ

ｈａｖｅｂｅｔｆｅｒ

ｃｈａｒａｃｔｅｒ

ｔｏ

ｐｒｅｓｅｒｖｅ

ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎ

ｔｈｉｓ

ｐａｐｅｒ，ｃｈｉｔｏｓａｎ，ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ａｌｇｉｎａｔｅ

ａｎｄｎａｎｏ—ｔｉｔａｎｉｕｍｄｉｏｘｉｄｅ

ｗｅｒｅ

ＵＳｅｄ

ｔｏ

ｒｅａｌｉｚｅ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．

】）Ａ

ｎｏｖｅｌｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ

ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（ｓｊ）ｉｍｕｎｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｂａｓｅｄ

Ｏｎ

ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｃｈｉｔｏｓａｎａｎｄ

ＣＮＢｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ａｌｇｉｎａｔｅ

ｉＳ

ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅ

ｃｏｍｐｌｅｘ

ｆｏｎＴｌｅｄｂｖ

ＣＮＢｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ａｌｇｉｎａｔｅ

ａｎｄ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｉｓ

ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ

ｔｏ

ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｐａｒａｆｆｉｎ—ｇｒａｐｈｉｔｅ－ｃｈｉｔｏｓａｎ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｂｙ

ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ

ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ（ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ）．Ｔｈｅ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｓｊＡｇ

ｃａｎ

ｂｅ

ｄｅｔｅｃｔｅｄ

ｂｙ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ

ｔｈｅｒｅｄｏｘ

ｃｕｒｒｅｎｔ

ｏｆ

Ｏ－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ，ｗｈｉｃｈ

ｏｘｉｄｉｚｅｄ

ｂｙ

Ｈ２０２

ｉｎ

ｔｈｅ

ｐｒｅｓｅｎｃｅ

ｏｆ

ＨＲＰ．ＭｏｒｅｏｖｅＬ

ｔｈｅ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓｈｏｗｓ

ｓｏｍｅ

ｉｍｐｒｏｖｅｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ

ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ

ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，

ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ

ａｎｄ

ｌｅｓｓ

ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ

ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｔｈｅ

ｓｅｎｓｏｒ

ｅｘｈｉｂｉｔｓ

ａ

ｌｉｎｅａｒ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

ｓｊＡｇ

ｉｎｔｈｅ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｒａｎｇｅ

０．６４

ｔｏ

４０

ｇｇｍＬ一．Ｔｈｅ

ｅｑｕａｔｉｏｎ

ｃａｎ

ｂｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ

ａｓ；

Ｉ＝一１

７．３０８ｃ＋３４．５７２．ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＣＯＣｆｎｃｉｅｎｔ０．９８５．

２）Ａ

ｎａｎｏ—ｔｉｔａｎｉｕｍ

ｄｉｏｘｉｄｅ

ｅｍｂｅｄｄｅｄ

ｃａｒｂｏｎ

ｐａｓｔｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｆｎ－Ｔｉ０２ＥＣＰＥ）ｗａｓ

ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ａｓ

ａ

ｍｏｄｅｌ

ｅｎｚｙｍｅ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ

ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ｆＨＰ．ｐ）ｗａｓ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ

ｔｏ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｓｕｒｆａｃｅ

ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｓｔｒｏｎｇ

ｓｙｎｅｒｇｉｃ

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｅｌｌｚｖｍｅ

ｗｉｔｈ

ｎａｎｏ－ｔｉｔａｎｉｕｍ

ｄｉｏｘｉｄｅ

ａｎｄ

ｇｒａｐｈｉｔｅ

ｐｏｗｄｅｒ．Ｔｈｅ

ｃｕｒｒｅｎｔ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

ｈｙｄｒｏｇｅｎ

ｐｅｒｏｘｉｄｅ

Ｏｉｌ

ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｗａｓ

ｍｅａｓｕｒｅｄ

ｉｎ

ａ

ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ

６．９）ｓｏｌｕｔｉｏｎ

ｕｓｉｎｇ

１．２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ

ｔｏ

ｂｅ

ｔｈｅ

ｍｅｄｉａｔｏｒ．Ｔｈｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｃｕｒｒｅｎｔ

ｏｆｔｈｅ

ＨＲＰ

ｅｎｚｙｍｅ

ｉｓｌｉｎｅａｒ

ｉｎｔｈｅ

ｒａｎｇｅ

ｂｅｔｗｅｅｎ

２．４×１０４ａｎｄ

３×１０“ｍｏｌ

Ｌ１

Ｈ２０２ｗｉｔｈ

ａ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ

ｏｆ０．１１０１

ＡＬｍｏｌ“ｃｍ。ａｎｄ

ａ

ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ

ｔｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ

ｏｆ

０．９９３（ｎ＝ｌ３１．

２．

Ｓｔｕｄｉｎｇ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅｉｎ

ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｏｆ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅｉｍｍｅｄｉａｔｅ

ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ

ｔｈｅ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ

ｏｆ

ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．

３，３１，５，５＇－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ

ａｎｄ

２－Ｃｈｌｏｒｏ一１０一［３一（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］

－１

ＯＨ—ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅｌ

ａｒｅ

ｕｓｅｄ

ｆｏｒ

ｔｈｅ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｆ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．

３）Ａ

ｎｏｖｅｌ

ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋ

ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｓｙｓｔｅｍ

ｕｓｉｎｇ

３，３’，５，５＇－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ

－ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ

ａｓ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅ

ｔｏ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ

ｔｈｅ

ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ

３（Ｃ３）ｗａｓ

ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．

ＨＲＰ—ｌａｂｌｅｄ

ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ

３

ｃａｎ

ｃａｔａｌｙｚｅ

ｔｈｅ

３，３’，５，５＇－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ

ｔｏ

ｆｏｒｍ

ｎｏｎ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｓｕｂｓｔｅｎｃｅ．Ｔｈｅ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ

Ｃ３

ｃａｎ

ｂｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ

ｂｙ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｄｅｃｒｅａｓｅｏｆ

ＴＭＢ

ａｆｔｅｒ

ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ

ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎｓ

ａｓ

ｆｌａＲｏ—ｔｉｔａｎｉｕｍ

ｄｉｏｘｉｄｅ

ｔｏ

ｂｅ

ｃａｒｒｉｅｒ．Ｔｈｅ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ

ｗａｓ

ｍｅａｓｕｒｅｄ

ｉｎ

ＰＢＳ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎ９２，５ｘ１０。Ｍ／ｍＬ

ＴＭＢ

ａｎｄ

５ｘ１

ｏ．。Ｍ／ｍＬ

Ｈ２０２ａｔｐＨ

６．８．Ｔｈｅ

ｓｅｎｓｏｒ

ｅｘｈｉｂｉｔｓ

ａ

ｌｉｎｅａｒ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

Ｃ３

ｉｎ

ｔｈｅ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｒａｎｇｅ

６．５ｎｇ／ｍＬ

ｔｏ

７５ｎｇ／ｍＬ，ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ

ＣＯＣｆｆｉｃｉｅｎｔ

０．９７３．

４）

Ａ

ｎｏｖｅｌ

ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋ

ｎｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｓｙｓｔｅｍ

ｕｓｉｎｇ

２－Ｃｈｌｏｒｏ－１０

ａｓ

一【３－（４一ｍｅｔｈｙｌ—Ｉ－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］１

ＯＨ－ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ）

ｓｕｂｓｔｒａｔｅ

ｔｏ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ

ｔｈｅ

Ｇｏａｔ

ａｎｔｉ－ｌｇＧ

ｗａｓ

ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ

ｂｙｕｓｉｎｇ

Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ（ＰＳ）ａｓ

ｃａｒｒｉｅｒ．Ｔｈｅ

ＨＲＰ．１ａｂｌｅｄ

Ｇｏａｔ

ａｎｔｉ—ｌｇＧ

ｔｏ

ｃａｕｓｅ

ｃａｎ

ｃａｔａｌｙｚｅ

ｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ

ｃａｎ

ｔｈｅ

ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ

ｏｆ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ

Ｇｏａｔ

ａｎｔｉ—ＩｇＧ

ｂｅ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ

ｂｙ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＰＣＰ

ａｆｔｅｒ

ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ

ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ

ｓｅｎｓｏｒ

ｅｘｈｉｂｉｔｓ

ａ

ｌｉｎｅａｒ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

Ｇｏａｔ

ａｎｔｉ·ＩｇＧ

ｉｎ

ｔｈｅ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｒａｎｇｅ

２ｎｇ／ｍＬ

ｔｏ

６０ｎＲｈｎＬ．ｅｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ

ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ

０．９８１．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．

ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋ

ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｏｆ

ｓｙｓｔｅｍ，

第一章

绪论

生物传感器是用生物活性材料（酶、抗体、抗原、ＤＮＡ等）与物理化学换能

器相结合所构成的一类传感器件，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测：［

具，各种生物传感器有以下共同的结构：包括讲或数种相关生物活性材料（生物

膜）及能把生物物质反应产生的信号转换为各种信号（如电，光，表面声波和体声波等１

的物理或化学换能器（传感器件），二者组合在一起，用现代微电子利自动化仪表

技术进行生物信号的再加Ｔ，构成各种可以使用的生物传感分析装置、仪器和系统。

生物传感器的作用原理是待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别，发

生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理

的信号，再经二次仪表放大并输出，便可间接知道待测物浓度。其优点包括：（１１

采用同定化生物活性物质作催化剂，使价值昂贵的生物制剂可以重复多次使用，克

服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。（２）专一性强，只对特

定的底物起反廊，而且卅ｉ受颜色、浊度的影响。（３）分析速度快，可以在较短时间

内得到结果。（４）准确度较高，通常测定的相对误差较小（５）操作系统比较简单，

容易实现自动分析（６）成本较低，在连续使用时所需费用较低。

（７）有的生物

传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。因此在生产

控制中能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。同时它们还指

明ｒ增加产物得率的方向。生物传感器用于分析具有选择性高、分析速度快、操作

简易、仪器价格低廉等特点，且可进行在线或活体内直接测定，因此长期以来受到

世界各国的广泛关注［１“。生物传感器在识别过程中使用的典型的成分包括：酶，抗体，

寡核苷酸以及整个细胞．因此可分为酶传感器、组织传感器、微生物传感器、ＤＮＡ

传感器、免疫传感器几大类ｕ４Ｊ．

１．１从免疫分析技术到免疫传感器

免疫在医学、生物学方面的概念是机体免疫系统对抗原物质的一种生物学应答

过程，其生理功能是识别和排除抗原性异性物质，以维持机体的生理平衡与稳定。

机体进行免疫应答反应产生抗体或致敏淋巴细胞。任何一种物质当其通过非肠道的

途径进入动物体后，能使该动物产生抗体，并和抗体特异性结合，被称为抗原。根

据抗原的来源和制备方法，通常可将抗原分成二类：天然抗原即包括细菌、病毒、

蛋白质、多糖和结合蛋白；人Ｔ抗原即指通过人Ｔ合成方法，将半抗原（有机小分

子）结合到蛋白质上形成的完全抗原；合成抗原即人工合成的多肽抗原。抗体是一

种特效试剂，具有与抗原发生特异性结合反应的球蛋白。抗原抗体结合的反应特点

是：特异性结合；按一定比例结合：结合具有可逆性、结合常数很高：结合具有阶

段性‘”。１”。随着单克隆技术及生物Ｔ程技术的发展，人们能够方便廉价地获得抗体，

基于抗原抗体特异性结合的免疫分析技术已广泛地应用在医学、临床、生物、化学、

环境、农业、工业、分析等领域ｌ”‘２７】。

免疫分析技术分为非标记免疫分析法和标记免疫分析法１２８“】。非标记免疫分析

包括凝聚反应分析法、免疫浊度测定法、琼脂扩散分析法、微量免疫电泳。标记免

疫分析法包括放射免疫分析法和非放射免疫分析法放射免疫分析法又分为放射免

疫分析法和免疫放射分析法，非放射免疫分析法又分为酶免疫分析法、酶联免疫吸

附分析法、酶标电化学分析法、荧光免疫分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ＦＩＡ）、荧

光偏振免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、电化学免疫分析（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ＥＣＩＡ）、化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析、流动注射免疫分

析（ｆｌｏｗ

ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

Ｆ１１Ａ）、胶体金免疫分析、克隆酶给予体免疫分析、

多组分免疫分析、脂质体免疫分析、控温相分离免疫分析。

目前在临床上应用的免疫分析主要有：

１）放射免疫分析

２）免疫放射分析

３）均相酶免疫分析

４）酶增强免疫分析

５）酶免疫分析

２０世纪８０年代以来，生命科学的发展为免疫传感技术的发展提供了强有力的

帮助。将抗原抗体的特异性反应与酶联放大效应相结合，形成了酶联免疫传感器，

这种传感器是将免疫组分固定在信号转换器上，使免疫反应、酶催化反应、信号产

生、信号榆测集成在一起。由于抗原抗体反府的特异性和酶联反应的信号放大作用，

使得该类传感器较其它生物、化学传感器具有更高的选择性和灵敏度。

１．２免疫传感器的分类

免疫生物传感器按换能器分为光导纤维免疫生物传感器、压电免疫转感器、热

传导免疫传感器、电传导免疫传感器、电化学免疫传感器。

２

１．２．１光化学免疫传感器

光化学免疫传感器是测量免疫反应后引起的光学信号变化量的一类传感器。光

学信号包括光吸收、荧光、磷光、反，折儆射等，所以具有较大的发展空间。依发

射光信号的来源又可分为荧光免疫传感器、化学发光免疫传感器和电化学发光免疫

传感器。

１．２．１．１荧光免疫传感器

荧光免疫传感器是将荧光榆测与免疫分析相结合的高灵敏度分析技术，主要类

型有：直接荧光免疫传感器、酶促荧光免疫传感器、底物标记荧光免疫传感器、时

间分辨免疫传感器和荧光偏振免疫传感器等。Ｔｏｐｐｏｚａｄａ【３”等将抗体固定于光纤上，

以荧光素标记可卡冈，利用抗原抗体发生免疫反应后引起荧光淬灭从而测定了可卡

冈；Ｐｌｏｗｍａｎ

ｆ３８１小组用二种荧光素分别标记抗原、抗体，通过荧光激发传递使一种

荧光被吸收，其吸收量与样品中待测物质成正比，由标准曲线推算出含量；

Ｐｕｌｉｄｏ．Ｔｏｆｉｎｏ

Ｐ等用溶胶凝胶技术包埋抗体，把流动注射和荧光检测结合起来对

ｉｓｏｐｒｏｔｕｒｏｎ进行了检测‘”］；Ｒｉｃｏ

ＣＭ等用流动注射和荧光检测结合固定蛋白Ａ检测

ｒ茶碱，该过程可消除许多干扰物的干扰［４０ｌ；ＶｏｄｉｎｈＴ等成功的运用光纤免疫荧光传

感器测定人类胎盘中ＤＮＡ．苯核加和物””．Ａｏｙａｇｉ

Ｈ２１和Ｂａｒｔ【４３１分别研究了一种无试

剂荧光增强免疫估感器测定人体ｌｇＧ和荧光素标记抗原用于测定爆炸性的三甲撑

三甲硝基胺的流动免疫传感器。这类直接荧光免疫传感器一般灵敏度１ｉ高，受非特

异吸附影响较大。

酶促荧光免疫传感器是建立在酶联免疫传感器基础之上的一门高灵敏度传感

技术。Ｈｕｉｑｕａｎｚ

ｔ４４１等以对羟基苯丙酸作为辣根过氧化物的底物，酶催化产物具有荧

光，通过测定了底物荧光强度间接测定了ＭｏｒｑｕｉｏＡ综合症；Ｈｕａｎｇｌ４５ｊ研究了以３，

６．荧光素二磷酸酯为荧光底物，开发了一种高灵敏度测定２，４·硝基酚的新型ＥＬＩＳＡ

技术。这类方法是利用具有潜在荧光的底物作为酶标物催化放大的显示系统，由于

累积放大和荧光的高敏感性，使方法学的灵敏度提高很多，一般为ｐｇ级，对羟基

苯乙酸唧］，对羟基苯丙酸㈣】，阿魏酸旧１等都曾用作辣根过氧化物酶的荧光底物．但

是已有的辣根过氧化物酶的荧光底物存在以下不足：１）酶催化反廊速度慢，荧光产物

的荧光较弱且发射波长与蛋白质相近．２）对Ｈ２０２敏感，Ｈ２０２对荧光底物的影响很

大．３１荧光产物的ｓｔｏｃｋｓ位移小．开发新型酶联底物是发展该项技术研究的关键所

在。

由于一般荧光技术的缺点是荧光寿命短、背景荧光高，这些背景荧光主要来自

３

散射光（样品池中的胶体颗粒和溶剂分子引起）和非特异荧光（｜ｎ｜靖中蛋白质及其

他化合物），一种新型荧光免疫技术一时间分辨荧光免疫技术应运而生。Ｐｅｉｒｅａ［４６１

等以２一荼二氟丙酮酸酯为荧光载体，将Ｅｕ”通过一种很强的双功能螯合剂与抗体的

氨基相连，利用时问分辨荧光免疫技术测定＿『兔抗人ｌｇＧ；Ｊ魄”７１等利用对羟基苯

乙酸为ＨＲＰ底物，通过标记酶催化产物与稀土金属铽（Ｔ

ｂ２＿。）形成有时间分辨荧

光的螯合物从而测定了ｌｇＧ。稀土离子的荧光特点一是寿命长（比背景荧光长３－４个

量级）；二是Ｓｔｏｋｅｓ位移大：螫合物荧光强，可获得高信嘈比及高灵敏度。

ｌ

２．１．２压电免疫传感器

压电免疫传感器是以压电晶体（材料）为基体而制成的高灵敏度质量响应特性

的体声波传感器【４８－５１】。压电晶体的濒率变化与质量变化成正比，并符合如下关系：

△Ｆ＝ＣＱ产△ｍ／Ａ，具有建构简单、价格低廉、检测下限低等特点；但易受外界因素

如电磁场、溶液密度及粘度、流变特等影响；其检测准确度难以保证等缺陷。

１．２．１．３热传导免疫传感器

热传导免疫传感器是基于测量化学和生物反麻中热量变化的量热计原理而制

成的热电堆（ｔｈｅｒｍｉｓｔｏｒｓ）传感器１５２，５３１，同样具有建构简单、价格低廉等特点，但

榆测灵敏度低，所报到的热传导免疫传感器研究工作较少。

１．２．１．４电传导免疫传感器

电传导免疫传感器是基于检测换能器（电极）与溶液之间的导电性变化而建立

的［５４－５７】。可以采用酶标记技术，通过免疫反应和酶健化反应的放大效应，使溶液中

的离子种类或数日发生改变，从而改变溶液的导电性能达到检测的目的，如用尿酶

标记二抗【５８１，可用来放大溶液的电导率的变化来完成对ｈＣＧ的榆测；也可以通过

改变传感器表面的导电性能和影响离子在电极表面的迁移速度而达到检测的目的，

如在构建尿液中的甲基安菲他敏（ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎ，ＭＡ）的免疫传感器时【５…，用戊

二交联法将ＭＡ抗体圊定在销电极上，当ＭＡ与免疫传感器发生免疫反应时导致

免疫识别分子层与电极之间传导率降低。但是，这类传感器易受实测样品中的离子

强度影响和存在较高的背景，榆测灵敏度４ｉ够。

ｌ＿２．１．５电化学免疫传感器

电化学免疫传感器可分为：电位型和安培型免疫传感器。

（１）电位型电化学免疫传感器是基于离子选择电极原理而发展起来的５。锄。在

零电位下，酶催化反应生成离子产物，能引起电极表面电位发生改变，电位变化正

比于离子活度的对数值，其关系遵循能斯特方程：

Ｅ＝Ｅｏ＋ＲＴ／ｚＦｌｎ

ａ。。

把酶联免疫ｕ及附分析方法（ＥＬｔＳＡ）与ｐＨ敏感的场效应晶体管（ＰＥＴ）结合

构成了电位型场效应晶体管电化学免疫传感器，用来测定许多抗原，如ａ

－－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ抗原，和ｈｅｐａｔｉｔｉｓ

Ｂ病毒表面抗原等【６３４ｓ］；溶液的

多离子性及离子活度与离子浓度之间的复杂关系给电位型电化学免疫传感器在实

测样品中的应用带来了难以克服的结果的不确定性。同安培免疫传感器相比，１邑具

有灵敏度低（榆测限一般为微摩尔级）及线性范围上限低等缺点。

（２）电化学中的安培测定是在恒电位（电势）下，使电子从具有氧化还原特

的分子流向或流出电极，形成的电子流是一个动态过程，其大小可用三电极系统测

量了，即’１：作电极用来承载电化学反应；参比电极用来控制Ｔ作电极的工作电位：

对电极用来从参比电极上获取电流。实际操作中可采用两电极系统，即将工作电极

用做虚拟的参比电极。安培测量具有操作简便、仪器价格低廉、固有的准确度和快

速的特性，促使人们努力地发展竞争性及非竞争性电化学免疫传感器陋，６”。安培型

免疫传感器在生物免疫传感中ｒ宁有晕要的地位，是电化学生物传感器发展的罩要方

向。

１－３免疫分析定量方法

１．３．１竞争型免疫分析法

竞争型免疫分析法又称饱和分析法，它的原理建立在被测物质及其酶标记物同

某种特异试剂（抗原或抗体）进行竞争结合的基础上＿每周定抗体的传感器在用酶

标记抗原与对应的待测抗原的混合液培养，让它们竞争键合到固定的抗体上，酶标

记抗原量一定时，待测抗原浓度越高结合在传感器表面上的酶标抗原的量越少，从

而酶催化产物越少。

１．３．２竞争型酶抑制免疫分析法

这种方法是在竞争型免疫法基础上发展起来的，一般用于半抗原测定。其原理

是：如欲测定某一种小分子化合物（称半抗原Ｈ），先制备该药物抗体，其次使

药物与酶（Ｅａ）连结，成为酶标记药物（Ｅａ－Ｈ），同定抗体的传感器在酶标半

抗原溶液中培养后，酶标半抗原结合到传感器表面，结果，阻挡了底物进入酶的活

性位置，使酶失活（Ｅｉ）。当结合酶标半抗原的传感器又在待测半抗原溶液中培

养时，待测半抗原可置换传感器上酶标半抗原，使酶标释放出来，酶得以复性。待

测半抗原浓度越高，复性酶越多，其催化产物越多。

１．３．３夹心型免疫分析法

夹心型免疫分析过程：首先将抗体固定在传感器的表面，加入抗原培育后，形

成抗原抗体复合物，洗掉过量（或未反应）的抗原，再加入酶标抗体培育，使示踪

酶标结合到待测抗原上。最后在测试体系中加入底物，通过测定酶转化产物，从而

间接ｉｉ‘算待测抗原的含量。一般夹，１３，法适于榆测大分子抗原，灵敏度高，但较竞争

法繁琐。竞争法即可榆测大分子，其衍生的方法——竞争型酶抑制法适于检测半抗

原分子，分析过程相对简单快速，但灵敏度小投夹心免疫分析法。

１．３，４无分离竞争抑制法

近年来，在上述竞争免疫方法的基础上，发展了一种无分离步骤的异相免疫分

析技术‘６”。在这种方法的分析过程中，以酶及生物素标记抗体，它与待测的抗体竞

争地吸附到同定有抗原的乳胶板上。未参与免疫反应的示踪物由于生物素与亲和素

之间强烈的相互作用而结合到固定有亲和素的乳胶板上，这部分酶标物中的酶由于

生物素．亲和素之间互相作用而失活。在测试体系中加入溶液，只有参与免疫反应

的酶标物能催化底物的转化而产生响麻信号，未参与免疫反应的酶标物冈失活，无

需要分离洗脱。

１．４免疫传感器的固定方法

在免疫传感器的制作中，抗原或抗体同定在转换器上是一个非常重要的步骤。

这将直接影响传感器的重现性、检测限及其循环使用等性能。常用的固定方法有：

ｕ及附法、包埋法、共价键合法、分子自组装法等。

１．４．１吸附法

吸附法是一种通过物理吸附作用将免疫组分固定于转换器表面的方法，这是一

种相对较简单的闶定方法。转换器表面经过适当地处理或修饰后，用抗体或抗原溶

液浸泡或涂覆，抗体或抗原由于分子间作用力而直接固定在转换器表面，形成具有

识别反应功能的生物敏感层。高分子膜吸附法：先在电极表面上修饰一层合成高分

子或生物高分子，然后将生物功能物质吸附到高分子膜上，制备成感应膜，再与转

换器结合，构成传感器【”】；无机材料吸附法：利用无机材料如分子筛或氧化铝等的

强烈的吸附特性，以次作为载体，先将分子筛用聚乙烯醇调制后固定于电极表面，

然后使生物功能物质吸附同定于分子筛膜内，即可构成生物传感器‘７“７１１：纳米颗

粒表面吸附法：Ｋａｒｙａｋｉｎ小组［７２１报道了利用抗体自身的巯基于金作用特点将其直接

同定在金表面的方法；静电自组装吸附法：静电自组装技术己广泛应用于生物识别分

子的固定，其圊定生物活性组分活性保持较高，通过适当处理，传感器可以重复使

用。采用廉价的微流管装置与静电自组装技术相结合，发展了基于流动注射的电化

学免疫传感器ｐ…。这类方法同定免疫组分无需使用化学试剂，对生物组分的活性影

响很小，同定化生物敏感层的稳定性较好，可经过酸碱处理后使表面再生从而达到

连续分析的需要

１．４．２包埋法

包埋法是将生物组分直接包埋在一些高分子载体，如电聚合物、碳糊、溶胶等

基质中，从而将免疫分子同定在转换器上的～种方法。高分子载体包埋法——将生

物功能物质与合成高分子Ｎａｔｉｏｎ或生物高分子丝素蛋白经溶剂混合而使酶包埋于

其中，制备成具有酶活性的感应膜，再把它覆盖到转换器表面，构成生物传感器

１７４，７５１；电聚合高分子包埋法一将单体和生物功能物质同时混合于电解液内，通电

使单体在电极表面电聚合成高分子，与此同时可以将酶或抗体包埋于高分子膜内，

直接同定于电极表面，构成生物传感器［７６－７８１；碳糊圊定法一将酶用石腊油等溶剂

调匀，再加入石翠粉调制成糊状物，填充于玻璃管内制备成碳糊电极［７９，８０］．这类方法

一般包埋的生物分子较牢同，聚合物膜的孔径和几何形状可以调控，并且可以固定

较高浓度的生物分子，稳定性较好，但该类方法对生物组分活性有影响，传感器使用

寿命较短的缺点

１４．３共价键合法

其价键合法是通过化学试剂将生物组分以共价键形式固定在转换器表面上的

一种同定方法…。要引入共价键合官能凼，首先必需对转换器表商进行处理或修饰，

然后将生物功能物质以共价、离子或配位等方式同定于转换器表面．如在转换器表

面经氨基硅烷化处理．电层积纳米金颗粒或在表面上自组装一层含氨基或羧基的硫

醇等都可以在转换器表面引入氨基或羧基官能团，然后用乙基－３－二甲基碳二证胺

作偶联剂，以羧酸氨基键的形式可以将生物组分同定于转换器件表面：或者用多功

能的试剂，如戊二：醛与酶蛋白分子相且结合，起着桥梁的作用，从而使酶固定于转

换器表旺【１ｆ８２－８５１：也可以使用成二醛以席夫碱形式将物质组分固定于换器上，此方法

比前述二种同定方法同定免疫组分稳定性都好，但操作较复杂，且化学试剂可能损

害生物组分的活性，导致特异性反应１ｉ能发生捧“。

１．４．４定向固定法

这类方法一般以同定于转换器表面的另外的分子作为桥梁将生物组分同定在

转换器上。如蛋白Ａ可以与免疫球蛋白（抗体）的Ｆｃ段结合，通过同定的蛋白Ａ，

可以将抗体同定于转换器表面‘”ｉ将相应抗体通过蛋白Ａ固定在可控多孔玻璃上可

对除草剂ａｔｒａｚｉｎｅ进行检测，检测限可达到ｌｏｎｇ，已成功用于环境检测［“】；又如，利

用过渡金属的螯合性质，以氧化钛和氧化锆处理纤维素、尼龙等有机物以及玻璃、

硅胶等无机物㈣，并经洗涤后，活化的载体放入免疫组分中反应。金属部分配位基

用于载体螯合外，｛：；｜｛留着的配位基可参予免疫组分的结合。如抗体中的羧基、氨基、

羟基等都可参加载体的连接。这种方法一般将免疫纽分如抗体定向同定后，有利用

于发挥其生物功能。

１．４．５其他方法

除了以上方法，近来有一＋些新的方法和技术应用于在转换器上同定生物识别分

子。利用聚合物材料的水溶性对ｐＨ值敏感的特点，用阳极电化学氧化或阴极还原

水使电极表面附近的ＰＨ值发生改变，而使聚合物沉积在电极表面，生物识别分子

可随聚合物沉积在电极表血ｊ而完成对生物组分的固定，具有重复性好、生物组分活

性高的特点∞】ｉ利用微型化的电喷涂（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｎｇ）技术，可用来进行生物分子

组分的同定，采用这种方法固定生物活性物质，具有微样量、多位点固定多种生物

活性物质、４；易发生交叉感染、活性高、熏复性好的特点叫１；基于光异构化的半抗

原单分子层电极，发展了可罩复性使用的安培免疫传感器‘”’９３】；利用碳糊电极吸附

蛋白质的特性，发展了安培和伏安型免疫传感器，在酸或碱性介质中对碳糊电极进

行氧化处理，可以去掉完成免疫反应测量的电极表面上的蛋白质分子，使电极重新

获得ｕ及附蛋白质的能力而用于下次免疫测定，具有良好的熏复性‘”矧；利用磁性纳

米颗粒，采用电磁性的电极，可以方便地完成对生物识别分子的同定，同定方法简

单、晕复性好‘…．

１．５酶传感器

除了在ｐＨ值灵敏性，离子强度稳定性以及对抑制剂的敏感性这些方面存在一些

限制条件外，酶已广泛的用于传感和探测酶的底物（并且ｒ分有用）．通过胆红素氧化

酶（Ｂｉｌｏｘ）以及当分解胆红素导致氧分压浓度值减少可检测胆红素．检测下限可达到

Ｏ．１

ｕ

Ｍ，但是胆红素酶并小是很稳定９”．另有人报道检测丙酮酸盐的双层酶传感器，

即把由乳酸氧化酶利乳酸脱氢酶构成的双酶层固定在光纤尖端，此反应的榆测是基

于反府中生成了荧光物质（还原态）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤＨ）．同样把谷氨酸脱

氯酶同定在微米大小的荧光传感器的末端上可定量检测谷氨酸，其浓度检测限为０．２

ｔｉ

Ｍ，质量检测限为３埃摩尔【９８１．基于葡萄糖氧化酶（Ｇｏｘ）氧化葡萄糖的动力学机制

所制备的几种新型的氧传感器已经运用在流动体系中葡萄糖氧化酶被直接固定在

氧传感膜Ｌ或者微柱反应器中的可控微孔玻璃上．耗氧量可通过氧气探针强度变化

或衰减时间来计算．葡萄糖和乳酸在各自的氧化酶作用下产生的过氧化氨诱导扩

散在玻碳电极表面的发光胺化学发光可用于测定过氧化氧，检测限可达到皮摩尔例．

基于辣根过氧化物酶为基础的酶传感器用于过氧化氯的测定已有详尽的报道．

陈小红等在热导石墨电极上以ＤＮＡ膜为电子媒介催化ＨＲＰ氧化过氧化氢．ＨＲＰ通

过共价键和到ＤＮＡ表面口ｏｏ］．将ＨＲ只二茂铁和卟啉在玻碳电极上滴干成膜可对过氧

化氢响应检测限为０．５

ｕＭ［１０１］协建军等将ＨＲＰ共价键和到金电极上的自组装单层

膜上做了研究‘”１用溶胶一凝胶碳糊电极包埋电沉积聚毗咯和ＨＲＰ制备的过氧化氢

传感器也有报道【１０”戡江红等用废弃的蚕丝蛋白成膜同定ＨＲＰ制各的过氧化氢传

感器对废弃物的回收利用提供，一个参考【ｌ”Ｊ．

１．６本论文的工作构思：

结合现有文献报道及在本实验摩的原有的基础上，拟进行新的生物分子固定方

法的研究，对以往同定方法进行改良或提高，利用几种传感原理，以发展几种免疫

传感器。

１１研制一种基于壳聚糖和溴化氰改性褐藻酸钠凝集作用的日本血吸虫安培免疫

传感器。褐藻酸钠一抗体复合物通过静电吸附作用被凝集到含右墨～石蜡一壳聚糖

组分的电极表面，然后与抗原和酶标抗原进行竞争反应，以邻氨基酚为电子媒介，

通过测定酶催化下双氧水对其氧化的电流大小来间接测定抗原的浓度。

２）利用纳米二氧化钛颗粒与碳粉的协同作用，制备一种高灵敏度的过氧化氢传感

器．辣根过氧化物酶通过与纳米二氧化钛之间的静电力和碳粉的非特异吸附而固定

在电极表面，以邻苯二酚为电子媒介，对过氧化氧进行测定．

３）用纳米Ｔｉ０２颗粒为同定抗体的支持体，以辣根过氧化物酶标记Ｃ３（ＨＲＰ—ｃ３），

ＨＲＰ．Ｃ３与待测ｃ３发生竞争性免疫反应，ＨＲＰ—Ｃ３催化荧光底物３，３’，５，５’一四甲基联

苯胺（ＴＭＢ）转化为无荧光物质，由ＴＭＢ＋Ｈ２０２混合成的底物溶液的荧光降低的大小

判断待测Ｃ３的浓度，

４）以聚苯乙烯（Ｐｓ）制成立持体，通过疏水性非特异吸附将ｌｇＧ同定在其表面，然后与

羊抗人ｌｇＧ和酶标羊抗人ＩｇＧ进行竞争免疫反应，以双氧水和甲哌氯丙嗪混合溶液

９

为荧光底液，通过测定３９５ｎｍ处荧光增强的多少来测定羊抗人ＩｇＧ的浓度

Ｏ

第二耄基于壳聚糖一改性褐藻酸钠凝聚作用的

Ｂ本血吸虫安培免疫传感器

２．１前言

日本【山吸虫病是一种广泛传播且威胁人类健康和生命的寄生虫疾病，近期研

近年来，电化学免疫传感器用来实现对目的物的检测己引起人们较大的兴趣

町更新的免疫传感器ｉ…１，刘国东等【姗也报道了一种基于石墨一石蜡一抗原作敏

奉文利用壳聚糖和溴化氰改性的褐藻酸钠间的静电吸附作用，制备了一种新

究发现。匕可能与多种癌症和某些疾病有关。血吸虫病主要流行于弧洲，非洲，

拉丁美洲等地区，每年约有超过５亿人口受到这种疾病的威胁。目前诊断血吸虫

病的方法主要包括：酶联免疫（ＥＬＩＳＡ）、电泳免疫、放射免疫及斑点免疫法‘…。０７】

等，近年来还有采用ＰＣＲ扩增技术测定血吸虫ＤＮＡ的方法［…”。但这些方法大多

繁琐费时，且需要使用一些昂贵的实验仪器。此外在实际检测中上述方法大多为

定性和半定量的测定，有些方法的灵敏度欠佳，常常出现漏检和错检的情况。

［ｉ０９１。在免疫传感器的实际应用中，传感器的重复使用性和维持生物组分活性是

这类传感器的两个关键的问题。传感器的生物组分可采取直接包埋或共价周定的

方法。由于抗原抗体间免疫反应的亲和常数较大，通常传感器活性界面的再生需

在高离子浓度和强酸性条件下进行，闲而易使固定在电极表面的抗原（抗体）失

活。为克服上述缺陷，Ｆａｂｒｅｇｓ等【ｌ州报道了一种磁性颗粒的免疫测定方法，但制

备过程较复杂，且所须时间较长。此外，还提出了一种基于刚性导电生物组分的

化层的可更新的电化学免疫传感器，这些传感器均需通过抛光电极表血使传感器

的活性界向得以更新。由于生物组分被长时间包埋和物理抛光打磨过程均易导致

生物组分的活性降低，罔此，上述方法都存在一定的缺陷。

的电流型免疫传感器。利用壳聚糖和褐藻酸钠之间有较强的静电吸附作用，且在

一定条件下可以成膜【１１２］Ｉ如将壳聚糖掺入石蜡一石器电极中，与褐藻酸钠偶联

后的抗体所形成的复合物可被吸附到石蜡一石墨一壳聚糖复合组分的电极表面

形成较牢周的抗体层，再与ＨＲＰ酶标抗原作用，以邻氨基酚为电子媒介，通过

测定酶催化下双氧水对其氧化的电流大小来间接测定抗原的浓度。这样可避免包

埋在电极材料中的抗体在长时间放置后失活。由于壳聚糖和褐藻酸钠可以在电极

表面形成一层可使小分子通透的极性薄膜｝””，冈此４ｉ影响电极的导电性，也可

减少电极的非特异性吸附。由于电极材料中＝，ｆｉ直接包埋生物组分，使用后的电极

可以通过简单的表面处理进行再生。

２．２试验部分

２．２．１

仪器

电化学系统２７３（ＥＧ＆Ｇ

ＰＡＲＣ，美国）用于循环伏安及计时安培测量，

所连接的电脑采用４．３０版的Ｍｏｄｅｌ

２７０研究软件。实验中采用二电极体系，饱

和甘求电极为参比电极，铺电极为对电极，所有电位均参照饱和甘汞电极电位。

进行计时安培电化学测定时，电解池中溶液麻采用磁力搅拌器不断搅拌：ＣＳＳ５０１

型恒温槽用于控制孵育温度。

２．２．２材料

日本血吸虫抗原（ＳｊＡｇ）及抗体（ＳｊＡｂ）均取自湖南医科大学寄生虫研究所；

所提取的分子量为３２

ｋＤ的日本血吸虫成虫抗原进行一步纯化后其浓度为２．８

ｍｇ／ｍＬ。日本山吸虫抗原水溶液在Ｏ℃下经真空蒸发得到淡黄色粉末状同体。

用２５００条ＬＪ本【【ｌ｜吸虫免疫成年兔子３５

ｄ，被感染的兔血清中的日本血吸虫抗体

用饱和硫酸铵沉淀法提纯。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ，１０００

Ｕ／ｍｇ，Ｒｚ＝３．０）、石墨

粉、二羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）及壳聚糖均购白上海申索生物试剂公一Ｊ；切片石

蜡购自中国人民解放军８９９４２部队试剂厂，使用前未进一步纯化：褐藻酸钠购自

Ｓｉｇｍａ公司。所用溴化氰按文献［１１４］方法制备。其余试剂均为分析纯；实验用水

为二次蒸馏水。

２．２＿３酶标抗原的制备

酶标抗原的制备按文献［１０５１方法进行。将５．０ｍＬ

ＨＲＰ溶解于Ｏ．５

ｍｏｌ／Ｌ

ｐＨ值为

５．０的醋酸钠缓冲溶液中，加入Ｏ．２５

ｍＬ

０．Ｉ

ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｌ０４溶液，在４℃下反应

３０

ｍｉｎ。而后自Ｕ入０．５

ｍＬ

２．５％（ｖ／ｖ）的乙二醇溶液，室温Ｆ放置３０ｒａｉｎ，用

碳酸钠缓冲溶液（ｐＨ

９．５）调ｐＨ值至９．０，

然后加入５．０

ｍｇ曰本血．吸虫抗原，

将溶液于４℃下放置过夜。在４℃下放置２ｈ后，４℃下置于ｐＨ值为７．４的０．１

ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液中透析过夜，将所得透析残留液于ＧＳ－２５过柱，即得纯化的

ＨＲＰ—Ｓ１Ａｇ（０．５

ｍｇ／ｍＬ）。

２．２．４溴化氰改性褐藻酸钠的制备

取适量的溴化氰（０．０８

ｇ）加入到定量的褐藻酸钠溶液中（Ｏ．１２ｇ溶于１．０ｍＬ

水中）于Ｏ℃下反应３０ｒａｉｎ。然后加入预先用冰水冷却的冰醋酸调节ｐＨ值至８．８，

立即加入０．１１

ｇ

Ｔｒｉｓ，４。Ｃ下不断搅拌反应２４

ｈ；将混合物的ｐＨ值调节到８．０，

所得溶液在０．０ｌ

ｍｏｌＬ～ｐＨ＝７．５的Ｎａ２８４０７一Ｈ３８０３缓冲溶液中透析三天。透

析后的残留物在７０＂Ｃ下于真空中蒸发。

２．２。５改性褐藻酸钠～血吸虫抗体复合物的制备

取溴化氰改性褐藻酸钠５．４ｍｇ溶于１

ｍＬ水中，置于冰水浴中冷却，加入４ｍｇ

的溴化氰，搅拌下，逐滴加入新配制的质量数为２０％的ＮａＯＨ，保持ｐＨ值为１１，

再加入冰醋酸调节ＤＨ值至８．５后，加入日奉血吸虫抗体５００

ｔｔＬ（Ｏ．５

ｍｇ／ｍＬ），搅

拌过夜。透析～天后置于４℃下保存。

２．２．６石墨一石蜡一壳聚糖电极的制备

称取０

１

ｇ的壳聚糖溶于适量的醋酸中，搅拌下逐滴加入饱和碳酸钠溶液垒

ｐＨ＝８．０，得～一乳胶状溶液，加入１．２

ｇ碳粉，搅拌后抽滤，得黑色胶状物。另取

一定量的石蜡溶解于乙醚中，加入与石蜡质量比约为３：２的黑色胶状物和一定

量的碳粉，充分搅拌得一均匀的组分，其中壳聚糖质量分数约为２％。将碳糊在

窜温下放置１０

ｍｉｎ，至绝大部分乙醚挥发，然后压入ＰＶＣ管中约１

ｃｍ。电极不

用时于室温下ｒ态保存。

２．２．７免疫传感器的制备

免疫传感器的构造见文献…。将免疫电极插入２

ｍＬ

８５／ａｇ／ｍＬ澳化氰改性褐

藻酸钠一抗体的培养液中，于２ＴＣ下放置３０

ｍｉｎ。电极表面分别用水和ＰＢＳ液

洗涤两次，插入到抗原与酶标抗原的混合溶液中，于２ＴＣ下孵育３０

ｍｉｎ。取出

电极，再分别用水和ＰＢＳ液洗涤电极表面两次。

２．２．８免疫传感器的再生

将使用过的传感器置于１０

ｍＬ

０．５ｍｏｌ／Ｌ

ｐＨ值为１０的ＮａＣｌ－－ＮａＯＨ溶液中

放置约４０

ｍｉｎ，取出，用水洗涤电极表面两次，然后将其置于１０

ｍＬｐＨ

５．７的醋

酸～醋酸钠缓冲溶液中放置１０

ｖａｉｎ，取出电极，用水洗涤，传感器即口＿『获得再生

…郢．

２．２．９测定方法

取不同浓度的抗原和１００

ｐＬ酶标抗原溶液混合后稀释至１

ｍＬ，待用。安培

分析在２０

ｍＬ

ｐＨ值为５．７的醋酸～醋酸钠缓冲溶液和１０

ｍＬ的５ｘ１０。ｍｏｌ／Ｌ的

邻氨基酚（０一ＡＰ）混合溶液中进行。Ｔ作电位为．１５０ｍＶ。待背景电流稳定后，

加入２０

ｕＬ

２ｘｌＯ。ｍｏＵＬ的Ｈ２０２，记录响应电流值。

２．３结果与讨论

２＿３．１循环伏安实验

ＨＲＰ在№０２存在下催化氧化氨基酚，这类底物已被用于伏安酶联免疫分析

中…６１。刘匡『东等㈣系统研究了邻、问、对位氨基酚的氧化还原特性，在此类异

构体中，邻氨基酚表现出最好的活性。邻氨基酚在ＨＲＰ存在下可被Ｈ２０２氧化为

稳定的氧化产物３．氨基ｉ分嚼嗪…７］ｏ实验过程中酶量的大小可通过循环伏安法或

汁时安培法测定催化产物的电流而确定。采用石蜡～石墨一壳聚糖材料的电极研

究了底物及其催化产物的循环伏安特性。在没有Ｈ２０２时，ｏ—ＡＰ在６６６

ｍＶ处有

一１ｉ可逆的氧化峰（Ｆｉｇ．２．１（ａ））。将石蜡一石墨～壳聚糖电极经吸附抗体后加

入抗原孵育，再加入Ｈ２０２，原氧化峰消失，在一２００－－一１００

ｍＶ处产生一个新的还

原峰（Ｆｉｇ．２．１（ｂ））。为获得一个灵敏的安培响应电流值，应选择。～个最佳工作

电位。在．３００—０

ｍＶ之间，记录催化产物在孵育过的石蜡一石墨～壳聚糖电极

上的安培响应。实验结果证明，一１５０

ｍＶ为最佳Ｔ作电位。

一《３芑ｇｊｏ

Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ｍＹ）

Ｆｉｇ

２１

Ｃｙｃｌｉｃ

Ｖｏｌｔａｍｍｇｒａｍｓ

ｏｆＯ－ＡＰ

ｉｎｔｈｅ

ａｂｓｅｎｃｅ（ａ）ａｎｄ

ｐｒｅｓｅｎｔ（ｂ）ｏｆ

Ｈ２０２

ｕｓｉｎｇ

ａ

ｐａｒａｆｆｉｎ－－ｇｒａｐｈｉｔｅ－－ｃｈｉｔｏｓａｎ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｉｎ

ａ

ｐＨ

５．７

ＨＡｃ－ＮａＡｃｂｕｆｆｅｒ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｃａｎｒａｔｅ：５０

ｍＶｓ－Ｉ．

２．３．２实验条件的优化

壳聚糖量的多少将直接影响其表面所吸附褐藻酸车｜】』一抗体复合物量的多少，

同时也影响着电极的导电性和其它物理性能。取壳聚糖质量分数分别为１０％、

５％、２％、１％的传感器进行试验，结果表明质量分数为２％时的响应电流最大。

在奉实验中取壳聚糖的用量为２％。

褐藻酸钠一抗体复合物量的多少将直接影响到键合在其表面的抗原的量，以

同定酶标抗原的用量为４０

ｐｇ，ｎ１Ｌ，改变褐藻酸钠一抗体复合物的用量作试验，

表明褐藻酸钠一抗体的浓度在８０—１００

ｐｇ／ｍＬ范周内测定时的响应电流值较稳

定（Ｆｉｇ，２

２）。实验中采用８５

ｌＪｇ／ｍＬ褐藻酸钠一抗体复合物溶液。

一§§

ｃｏｎ∞ｍｂ∞ｏｆＡｃｎｖｍｅｄＡｌｇｉｎａｔｅ—ＳｊＡｂｌ（ｖＳｍｌｌｌ

Ｆｉｇ

２２

Ｃｕｒｒｅｎｔ

ｖｅｒｓｕｓ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄ

ａｌｇｉｎａｔｅ

ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ

ＳｊＡｂ

ｐｌｏｔ．１ｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｉｎｃｕｂａｔｅｄ

ｉｎＯ．Ｉ

ｍｏｌＵ’ＨＡｃ—ＮａＡｃ

ｂｕｆｆｅｒ

ｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ

ｐＨ

５．７

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１

０

ｇｇｍＬ～ＳｊＡｇ－ＨＲＰ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．

孵育时阃对响虑电流值也有。定影响【１１

８１，实验表明，电流信号随孵育时间的

增加而增大，３０

ｍｉｎ时已基本达到稳定，冈此，选择３０

ｍｉｎ作为孵育时间。孵

育温度也影响免疫传感器的性能。通常，３７。Ｃ为免疫反应最佳孵育温度，但此温

度下长时间的孵育会降低酶标抗原中酶的活性。本实验中选择孵育温度为２７％。

此外，温度较高则会对石蜡电极的物理性能产生影响，影响电极的灵敏度。

免疫传感器的响应信号依赖于传感器表面反麻的酶标抗原量。为了以最小量

的ＨＲＰ—ＳｔＡｇ去获得最大的电流响应，在孵育过程中改变ＨＲＰ—ＳｔＡｇ的量进行实

验。结果表明电流响应随ＨＲＰ—ＳｉＡｇ量增加而线性增加（Ｆｉｇ．２１３），当溶液中

ＨＲＰ－ＳｔＡｇ量达到４０

ｐｇ／ｍＬ时，电流响应值趋于稳定。实验中采用４０

ｇｇ／ｍＬ的

ＨＲＰ—ＳｔＡｇ浓度。

Ｉ“伽“口Ｈ。Ⅺ

Ｆｉｇ

２．３

Ｃｕｒｒｅｎｔ

ｖｅｒｓｔｌｓ

ｌｏｇａｒｉｔｈｍ

ｏｆ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｐｌｏｔ，ｆａ，

ＳｊＡｇ－ＨＲＰ

ＨＲＰ—ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．［ｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｉｎｃｕｂａｔｅｄｉｎ

Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ

ｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ

ｐＨ

５．７

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

８５

ｇｇ／ｍＬ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ａｌｇｉｎａｔｅ

ＳｊＡｂ．ｃ．ＨＲＰ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｉｎ

ｂｌａｎｋ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

Ⅺ

≈

∞

一｛｜Ｅ

ｂ

＂

ｏ

Ｆｉｇ

２．４

Ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｃｕｒｒｅｎｔ

ｖｅｒｓｕｓ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｏ—ＡＰ

ｐｌｏｔ．

此外．底物浓度对电流响庸值的影响较大。根据Ｍｉｃｈａｌｅｌｉｓ—Ｍｅｎｔｅｎ方程，酶

ｍｍｏｌ／Ｌ之后，响应电流值趋于

ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｆｉｇ．２．４）

免疫传感器的性能参数主要包括达到稳定基线电流时间的长短、背景电流的

６

ｃｏｎｊｕｇａｔｅ。ｂ

ＨＡｃ—ＮａＡｃ

ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ

催化反麻的电流响应值与酶催化反应的最大速率相对麻且与酶的活性披结合在

传感器表面的ＨＲＰ．ＳｉＡｇ的量呈比例。在低浓度范嗣内，传感器的响应电流与底

物的浓度呈线性关系。当。一ＡＰ的浓度增加全０，５

稳定。实验中采用底物的浓度为０．５

２ｔ３１３免疫传感器的响应特性

大小、灵敏度、晕现性和ｒ作电位范周等。以石蜡为粘合材料，可以得到一个低

的背景电流羽Ｉ宽的Ｔ作电位……。在．３００

ｍＶ到２００

ｍＶ之间，原传感器的基线电

流为０．６

ｐ．Ａ到０．３

ｕＡ。在固定＋ｒ作电位为一１５０

ｍＶ下，结合改性褐藻酸钠一抗

体复合物后的传感器的基线电流为Ｏ．８／ａＡ，表明在免疫传感器表面形成薄膜后不

影响电极的导电性。同一传感器在经２０余次再生后，基线电流保持为Ｏ，８士Ｏ．０４

ｇＡ。取再生后的传感器在同浓度培养液中反应后测量，其偏差为４．５％（ｎ＝５）。实

验结果见Ｔａｂｌｅ

２．１。表明传感器在经过简单的强碱和强离子强度的溶液处理后，

传感器表面可获得有效的再生。此外，在实验中榆验了，免疫传感器的非特异性吸

附。取溴化氰改性褐藻酸钠一抗体复合物的溶液（８５

ｐｇｒｎ／Ｌ）中反应后的电极插

入酶标转铁蛋白抗原溶液中孵育后，电极响应值很小，而同浓度的酶标转铁蛋白

抗原溶液在空白电极上电流响应较大（Ｆｉｇ．２．３），说明电极在经过褐藻酸钠一

抗体吸附后，在电极表面形成薄膜，从而可使电极的非特异性吸附降低。

Ｔａｂｌｅ

２．Ｉ．Ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ

ａｎｄ

ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ

ｏｆ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ

８Ｅａｃｈ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｃｕｒｒｅｎｔ

ｒｅａｄｉｎｇｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ

ｔｏ

ａ

ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ

ｃｙｃｌｅ

ｗｈｅｎｔｈｅ

ｔｅｓｔｅｄ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｗａｓ

ｎｅｗｌｙ

ｐｏｌｉｓｈｅｄ

ｆｏｌｌｏｗｅｄ

ｂｙ

ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ

ａｎｄ

ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ

ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ

Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｉｎｃｕｂａｔｅｄ

ｉｎ

ｌｍＬ

０．１ｍｏｌＬ’‘ＨＡｅ－ＮａＡｃｂｕｆｆｅｒ

ｓ９１ｕｔｉｏｎ

ｏｆｐＨ

５．７

８ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

４０

ｐ，ｇｍＬ—ＨＲＰ—ｌａｂｌｅｄ

ＳｊＡｇ

Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

ＳｊＡｇ

ｉｎ

ｓａｍｐｌｅ

ｗａｓ

６

ｇｇ／ｍＬ。一Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ

ｗｉｔｈ

ｄｉｆｉｅｒｅｎｔ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．

Ｆｉｇ．２．５是最优条件下测得血吸虫抗原的校正曲线，响应电流与血吸虫抗原在

Ｏ．６４—４０

ｐｇ／ｍＬ之间里准线性关系。线性回归方程为：

ｌ＝．１７．３０８ｃ＋３４．５７２相关系数ｒ为Ｏ．９８４９。

｝ｎ】ｊｌ￡ｃ＆ＢＥ

ｂ瞄ｆ尉＾ｇｙｃ岬ｍ咖

Ｆｉｇ

２．５

Ｃｕｒｒｅｎｔ

ｖｅｒｓｕｓ

ｌｏｇａｒｉｔｈｍ

ｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｐｌｏｔ

ｆｏｒ

ａ

ｐａｒａｆｆｉｎ—ｇｒａｐｈｉｔｅ—ｃｈｉｔｏｓａｎ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ａｆｔｅｒ

ｔｈｅ

ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓ８ｙ

ｂｕｆｆｅｒ

ｓ０１．ｉｏｎｏｆ

ｐＨ

５－７

ｍｏｌＬ－。ＨＡｃ－ＮａＡｃ

Ｏ．１

ｉｎ

ｌｍＬ

ｉｎｃｕｂａｔｅｄ

Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

４０｝＿ｔｇｍＬ～ＨＲＰ—ｉａｂｌｅｄ

ＳｊＡｇ．

２．３．４初步应用

Ｔａｂｌｅ

２．２是４ｉ同感染程度的兔血清中ＳｊＡｇ浓度的测定，结果显示响应电流

随感染程度增加而降低。表明传感器可用于直接检测ＳｊＡｇ的浓度。

Ｔａｂｌｅ

２．２

ＲａｂｂｌＩ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｋ竺！！！！竺！！！竺！兰！

Ｉｎｆｅｃｔ

ｄｅｇｒｅｅ

一

ｓⅧｍ

ｓⅢ口１ｅｓ

１

４

Ｃｕｒｒｅｎｔ／（ｕ

Ａ１

Ｄｅｔｅｃｔ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（１ｌ

ｇｇｒｎｌ）ＥＬＩＳＡ／（“咖１）

５．３１

８．６１

１２．０３

１４．５６

３１

４４

５５

２６．６

２３．５

２０．０

１７．８

４．９８

，８

１。

８．０８

１１．８

１４．２８

４４

２８０

２．４结论

基于改性褐藻酸钠和壳聚糖的凝聚作用而构制了日本【缸吸虫电流型免疫传感

器，采用竞争酶联免疫分析法，以ＨＲＰ．ＳｊＡｇ作示踪剂，邻氨基酚作酶的底物，

测定｝二｜奉血吸虫抗原。该传感器具有制作简单、价格低廉操作方便。测量快、蛋

白质非特异性ｕ及附影响低、敏感血可更新的特点。它可以用于判定样本中血吸虫

抗原的量，为预防血吸虫和判断治疗血吸虫病的疗效提供了有效的榆测方法。

第三章包埋纳米二氧化钛的碳糊电极固定辣根过氧化酶用

于过氧化氢的检测

３．１前言

纳米二氧化钛可以吸附溶液中的染料。这种的很强的吸附作用可能源于染料

表面羧基与Ｔｉ”间的螯合作用。基于这个发现，Ｅｍｍａｎｕｅｌ

Ｔｏｐｏｇｌｉｄｉｓ和Ｊａｍｅｓ

Ｒ．ＤｕｒｒａｎｔＩ”ｏ。１２１１提出了新的固定蛋白质的方法。他们研究出用二氧化钛的纳米渗

透层来固定蛋白质，蛋白质通过静电吸附作用固定到纳米二氧化钛的表面，然后

用分光光度法来检测这一过程。此外，他们还得到二氧化钛的等电点（１ＥＰ）大

致为６．０的结沦。捧于纳米颗粒比如纳米金在分析中生物物质的固定中的应用成

功，作者尝试将纳米二氧化钛包埋入碳糊电极里的方法研制同定酶的生物传感

器。用辣根过氧化酶（ＨＲＰ）做为模型来制备过氧化氢传感器。

传统的酶修饰电极小能很好的满足灵敏度，置信度以及操作简便的要求【ｌ”】。

已有研究报道固定辣根过氧化酶（ＨＲＰ）到电极上，比如与聚合物交联［１”’１２３］

与石墨油糊混合”“，或通过电沉积过程混合成膜或滴下法成膜【１０“””，通过在

自组装的单层膜上共价键合［１０２］等方法，这些方法或多或少均存在～些问题。本文

的实验表明，这种用纳米二氧化钛作电极载体所制成的电极在过氧化氯的检测中

表现出很高的稳定性和灵敏度。我们在实验中测试了ＨＲＰ的ｕ及附时间，底物的

浓度，支持电解质的ｐＨ值以及应用的电位对传感器的性能的影响。

３．２实验部分

３．２．１试剂

辣根过氧化酶（ＲＺ＝３．０，２５０

Ｕｍｇ‘）购自上海丽珠东风生物技术有限公司

（Ｌ海，中崮），其他试剂均为分析纯的，所有的溶液都是用二次水配制的。

纳米二氧化钛来自浙江明日纳米材料有限公司（浙江，中国）。ＴＥＭ测得颗

粒的半均尺寸为Ｉ

５ｎｍ如图３．１所示。通过ＫＹＫＹ－２８００电子传输显微镜获得。

磷酸缓冲溶液的ｐＨ值在５．０—８

０，用０．０６７ｍｏｌ／ＬＫＨ：Ｐ０４和０．０６７

ｍｏｌ／Ｌ的

Ｎａ２ＨＰ０４配得。支持电解质为Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ

ＫＣＩ。含１

ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚ｆ１，

２＿ｂｅｎｚｅｎｅｄｉ０１）的待测溶液通氮除氧１０分钟，且在整个实验过程中都在氮气的环

境中进行。所有的实验都在警温下进行。所有的电位都相对于饱年ｕ甘汞电极。

Ｆｉｇ

３．１

ＴＥＭ

ｉｍａｇｅ

ｏｆｎａｎｏ—ｔｉｔａｎｉｕｍｄｉｏｘｉｄｅ

ｐａｒｔｉｃａｌｓ．

３．２．２装置

循环伏安法和计时安培法都是在ｍｏｄｅｌ２７３电化学系统（ＥＧ＆Ｇ

Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ

Ａｐｐｌｉｅｄ

Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）上进行，采用三电极体系，温度为２５±ｌ℃。

铂电极为对电极，饱和的甘汞电极为参比电极，ｎ．二氧化钛ＥＣＰＥ为工作电极。

３。２‘３酶电极的制备

纳米二氧化钛粉末（Ｏ．００５９），碳粉（Ｏ．１２０９），石蜡（Ｏ．０８０９）混合，用ｌｍＬ

乙醚溶解．用超声波超５分钟，再在空气中干燥１０分钟。然后将混合物寨入直

径为６ｍｍ，深Ｉ

ｃｍ［８０１的ＰＶＣ管中，放置一天待其变硬。这样，一个ｎ．二氧化

钛ＥＣＰＥ便做好了。然后我们将电极放到含有５ｍｇ／ＬＨＲＰ的ＰＢＳ（ｐＨ６．９）的溶

液中，４＂Ｃ下放置１２小时，再用二次水冲洗丁净。制好的酶电极储存在ＰＢＳ（ｐＨ６．９）

的缓冲液中备用。

３．３结果与讨论

３．３．１

ｌ，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ在ｎ一二氧化钛ＥＣＰＥ上的电化学特性

图３．２所示为酶电极在没搅拌的除氧的Ｏ．０６７

ｍｏｌ／Ｌ含Ｉ

ｍｍｏｌ／Ｌ

１，

２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ的ＰＢＳ（ｐＨ

６．９）中的循环伏安曲线，其中ａ为乔含Ｈ２０２，ｂ为

含２．４ｍｍｏｌ／ｌ＿，Ｈ２０２。（图３．２（ａ））是没有Ｈ２０２的情况下所得的１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ

的循环伏安曲线。在２．４ｍｍｏｌ／Ｌ

Ｈ２０２的存在下，还原峰的峰电流增加了，而氧

化峰的峰电流减少了（图３．２（ｂ））。这些现象表明，１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ可以从ＣＣＰＥ

表面有效的将电子传递到固定在纳米二氧化钛上的ＨＲＰ的氧化还原中心。基于

酶的催化反应的过程可蛆如下表示：

ＨＲＰ（Ｆｅ３＋）＋Ｈ２０２＿÷Ｉｎｔ，（１）＋Ｈ２０

Ｉｎｔ．（１）＋ＱＨ２一Ｉｎｔ．（ＩＩ）＋Ｏ

Ｉｎｔ．（ＩＩ）＋ＱＨ２—＋ＨＲＰ（Ｆｅ＂）＋Ｑ＋Ｈ２０

Ｑ＋２ｅ—ＱＨ２

Ｉｎｔ．１（氧化态＋５）和ＩＩ（氧化态＋４）代表反应中的中间产物，ＱＨ２，Ｑ分别代表

１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ和它的氧化产物（Ｏ－苯醌）。Ｉｎｔ．Ｉ被还原为Ｉｎｔ．ＩＩ之后，ＩＩ通过

氧化还原介质ＱＨ２而形成ＨＲＰ（Ｆｅ３＋）的原始形式。Ｏ一苯醌则在电极上得到２

个电子而被还原为１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ。

Ｆｉｇ

３．２

Ｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｒｎｓ

ｉｎＯ．０６７

ｔｏｏｌ

Ｌ“ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｂｕｆｆｅｒ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ６．９）

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１

ｍｍｏｌ

Ｌ一１，２一ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ

ｗｉｔｈｏｕｔ（ａ）ａｎｄ

ｗｉｔｈ

２．４ｍｍｏｌ

Ｌ一１

Ｈ２０２（ｂ）．

Ｓｃａｎｒａｔｅ：５０ｍＶ

Ｓ－Ｉ

３．３．２实验条件的选择

小同的实验条件会影响到安培测量的结果，主要是介质的浓度，支持电解质

的ｐＨ值，吸附的时间以及Ｔ作电位。

为了克服辣根过氧化酶在异类电子传导中传输速度慢的问题，通常在制备酶

电韦鹱的过程中采用一些有高异类电子传导能力的小分子作电子媒介［１２４］在用于

ＨＲＰ酶的电子媒介中，１，２．ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ是最佳的电子媒介之一，它能快速的将电

了从电极表面传导到Ｉｎｔ．Ｉ或ＩＩ【””。在低浓度的电子媒介中，电流响应通常会受

到酶一电子媒介动力学的限制。当电子媒介浓度很高时，电流响戍又会受到酶一

底物动力学的限制。但是，较高浓度的１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ的背景电流也较高。所以，

实验中我们采用１．０

ｍｍｏｌ／Ｌ的１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ。

图３，３为酶电极在ｐＨ为４－９的磷酸缓冲液，其中含１，０

ｍｍｏｌ／Ｌ对苯二酚和

２．４ｍｍｏｌ／ＬＨ２０２中的响应。由图可知，响应电流在ｐＨ５．６有明显的增加。在ｐＨ６．９，

酶电极有最大的灵敏度。这个ｐＨ接近可溶性酶的选择性ｐＨ（６－７）［１２６］在实验

中我们采用ｐＨ

６．９为最佳ｐＨ值。

Ｆｉｇ

３．３Ｅｆｆｅｃｔ

ｏｆｐＨ

ｏｎ

ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｓｔｕｄｉｅｄ

ｂｙａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｍｅｔｈｏｄ

ｆｏｒ

２．４ｍｍｏｌ

Ｌ‘’Ｈ２０２

ｉｎＰＢＳ

ｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓ

ｐＨ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１

ｍｍｏｌ

Ｌ一１

１，２－一ｂｅｎｚｅｎｅｄｉ０１．

Ｏｐｅｒａｔｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌ－２

１７ｍＶ

ＵＳ

ＳＣＥ

纯的纳米二氧化钛可以吸附蛋白质，但是它的吸附速率很低。整个吸附过程

达到饱和需要１。３０天‘”…。但意外的是所制备的酶电极吸附时间１２小时后，它

的响麻电流就可以达到稳定。主要原冈可能是源于碳粉和纳米二氧化钛的协同吸

附。旨先ＨＲＰ通过碳粉的非特异性吸附很快的聚集到电极表面，然后再与纳米

二氧化钛通过静电吸附而得以同定。冈此吸附时间我们选择１２小时。

图３．４为应用电位的／１ｉ同对生物传感器响应的影响。随着电位由一５０ｍＶ增加

到一３００ｍＶ，传感器的灵敏度也随之增加，到一２１７ｍＶ时开始减少ａ冈此计时安培

法中我们采用一２１７ｍＶ（ＶＳ．ＳＣＥ）。

Ｆｉｇ．３．４

Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ

ｏｆ

ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ

ｃｕｒｒｅｎｔ

ｏｎ

ａｐｐｌｉｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ

ａｔ

ｔｈｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｉｎ

ｐＨ

６，９

ＰＢＳ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１

ｍｍｏｌＬ－１

１，２一ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ

ｉｎ

ｔｈｅ

ｐｒｅｓｅｎｃｅ

ｏｆ

２．４

ｍｍｏｌ

Ｌ一１

Ｈ２０２

３．３．３电极晌应特性

图３．５所示的是在选择的实验条件下（一Ｉ二作电位为一２１７ｍＶ

ＶＳ

ＳＣＥ，ｐＨ为６．９

的ＰＢＳ缓冲溶液，其中含１．０

ｍｍｏｌ／Ｌ１

２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉ０１）每次加２０１．ｄ

３６．５ｍｍｏｌ／Ｌ

的Ｈ２０２时得到的典型ｔ拘ｉ：ｌ时安培曲线。

电极表现出对Ｈ２０２快速而灵敏的响应。

在Ｈ：Ｏ：的校正曲线范闸内，传感器的电流响应可以在ｔ０

Ｓ内达到稳态电流的

９５％。这样的快速响应源于电子媒介和ＨＲＰ之间非常接近的缘故。

Ｆｉｇ

３．５

Ａ

ｔｙｐｉｃａｌ

ｃｕｒｒｅｎｔ－ｔｉｍｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｃｕｒｖｅ

ｆｏｒｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ

ａｄｄｉｔｉｏｎｓ

ｏｆ２０止ｏｆ

３６

５

１１１ｍｏＩ—Ｈ２０２

ｆｏｒｔｈｅＨＲＰ

ｅｎｚｙｍｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｉｎ０．０６７

ｍｏｌ

Ｌ‘’ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｂｕｆｆｅｒ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ

６．９１

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１ｍｍｏｌ

Ｌ＾ｌ

１，２－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ，Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ

ｐｏｔｅｎｔｉａｌ一２１７

ｍＶⅧ．ＳＣＥ

图３．６所示为ｌ—ＩＲＰ酶的响应电流在２．４ｘ１０４～３ｘ１０－７ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２０２的浓度范同内

呈线性关系，灵敏度为０．ＪｌＯｌＡ

Ｌｍｏｌ。ｃｍ～，校正系数为０．９９３（ｎ＝１３）。当Ｈ２０２

的浓度超过２．４２ｘ１０－３ｍｏｌ／Ｌ时，响应达到饱和，这是因为酶．底物和酶一电子媒

介催化动力学达到了饱和。电极的榆测下限为３ｘ１０－ｖｍｏｌ／Ｌ，在信噪比Ｓ／Ｎ为５

的情况下。我们将ｎ—Ｔｉ０２

ＥＣＰＥ的碳糊电极与没有包被纳米ｊ氧化钛的电极做了’

个比较，结果显示，后者对Ｈ２０ｚ没有明显的响应（数据没显示）。所制备的ＥＣＰＥ

的榆测下限比之前报道的基于碳糊的电化学传感器要低。线性范围，灵敏度以及

响应时间的对比见表５．１。

Ｆｉｇ

３．６Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ

ｃｕｒｖｅ（ｉｎｓｅｔ

ｒｅｆｅｒｓ

ｔｏ

ｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｒａｎｇｅ）．Ｓａｍｐｌｅｓ

ｗｅｒｅ

ｄｉｌｕｔｅｄ

ｂｙ

０．０６７

ｔｏｏｌＬ一１

ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ

ｏｆ

ｐＨ

６．９：ｔｈｅｄａｔａ

ｗｅｒｅ

ｔｈｅ

ａｖｅｒａｇｅ

ｖａｌｕｅｓ

ｆｒｏｍｔｈｒｅｅ

ｐａｒａｌｌｅｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．

Ｔａｂｌｅ

３．１

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ

ｏｆｌｉｎｅａｒ

ｒａｎｇｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ

ａｎｄ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｉｍｅｗｉｔｈ

：竺竺竺！

Ｈ２０２

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

Ｌｉｎｅａｒ

ｒａｎｇｅ

Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ

Ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｉｍｅ

ｐＰｙ／ＣＣＥ［１０３１

５．０×１０。ｔｏ２．０×１０＿４

Ｏ．０２４儿ＡｐＭ。１＜２０

ＣＰＥ

１１０３１

１０’７

ｔｏ

１０‘５０，００２６

ｇＡｇＭ“４２

Ｓｏｌ－ｇｅｌ

Ｑｌａｓｓ／ＣＰＥ［１２７】

２．０×１

０。５

ｔｏ

２．６×１０‘３

０．０５２

ｇＡｇＭ‘１

…－

Ｍ０ｎｔｍＯｒｉｌ

ＪＯｎｉｔｅｍｏｄｉｆｉｅｄ

ＧＣ［１２８］２．Ｏ×１０击ｔｏ

３．０×１０－。

…一

３－－２０

ｎ－Ｔｉ０２ＥＣＰＥ

３．０Ｘ１０－７

ｔｏ

２．４Ｘ１０．４

０，０３１

ｐ，ＡｇＭ＂ｌ＜１０

３．３．４

ＨＲＰ酶传感器的重现性

ＨＲＰ酶电极响应电流的重现性是在Ｈ２０２的浓度为０．２４ｍｍｏｌ／Ｌ时测定的。８

组数据的相对标准偏差（ＲＳＤ）为３．７％。所制备的小同的辣根传感器，在Ｈ２０２

为Ｏ．２４ｍｍｏｌ／Ｌ的浓度下电流检测的偏差系数为４．３％，这个数据是可以接受的。

３．３．５

Ｉ＿口盱酶传感器的储存及其稳定性

在溶液中ＨＲＰ有着很好的稳定性。冈此，ＨＲＰ电极在未使用的时候储存在

ＰＢＳ中（ｐＨ

６．９），温度为４＂Ｃ。该传感器的稳定性通过测量其对０．．２４ｍｍｏｌ／Ｌ的

Ｈ２０２的响庶来榆测，以一个月为一个周期，每天检测一次。该传感器的响应电

流在１５天后，减少到９０％，２５天后，响应为最初时的８０％。３５天后，仅为初

始值的６０％。冈此，这种ＨＲＰ酶电极在保留ＨＲＰ的活性方面还是很有效的。

３．４结论

基于纳米二氧化钛的碳糊酶电极是一种制作简单且比传统电极灵敏度高的

新型电极。实验结果证明了包埋纳米二氧化钛到碳糊电极里，在固定酶例如辣根

过氧化酶，来检测分析物如过氧化氧的浓度是可行的。

第四章基于纳米二氧化钛为载体的可更新荧光免疫系统

测定补体３

４．１前言

补体第三成分（ｃ３１是补体两条激活途径的中心环节堋０定其含量对研究自身

免疫性疾病和变态反应性疾病的诊断，治疗和病因具有重要的意义．传统的方法如

酶联免疫法（ＥＬｌｓＡ）和放射性免疫分析法（ＲＩＡ），所需时间很长．需要高素质的榆测

人员．操作复杂【”…，放射免疫还会带来污染，在临床中使用时有很大的限制，传统

的酶联免疫分析大多数是采用紫外一可见比色分析法检测．由于受检测仪器的限制．

其灵敏度往往小高，而且这些方法测定过程中需要多次的溶液转移，给操作带来一

定的影响．冈此研究吏灵敏．简便的分析方法是必要的．

在免疫分析中，通常抗原（抗体）的同定通常是通过共价键和，直接包埋，和吸附

等方法得以实现．共价键和和直接包埋对抗原ｆ抗体）的活性会造成很大的影响，而

且基于共价键和的免疫传感器的再生困难．Ｅｍｍａｎｕｅｌ

Ｔｏｐｏｇｌｉｄｉｓ等曾用纳米Ｔｉ０２

颗粒为同定蛋白质的载体‘”…，蛋自质通过静电吸附作用固定于纳米Ｔｉ０２表面．本

文试用纳米Ｔｉ０２颗粒为同定抗体的支持体，以辣根过氧化物酶标记Ｃ３（ＨＲＰ·ｃ３），

ＨＲＰ—Ｃ３与待测Ｃ３发生竞争性免疫反麻，ＨＲＰ—Ｃ３可以催化荧光底物３，３’５，５’一四

甲基联苯胺（ＴＭＢ）转化为无荧光物质，所以待测Ｃ３的浓度可由底物溶液的荧光降

低的大小判断．由于抗体和支持体基于静电吸附而得以同定，冈此免疫过程小会对

抗原（抗体）的活性造成影响．通过简单的处理后，抗原支持体表面可以得到有效

的再生，闵此该装置可以进行连续的抗原抗体检＿；贝！｜，该方法榆测限底，可满足临床

分析的要求，

４．２试验部分

４．２．１试剂

辣根过氧化物酶（ＨＲＰ，１０００

Ｕｍｇ～，Ｒｚ＝３．Ｏ）和３，３’５，５’－四甲基联苯胺（ＴＭＢ）

从Ｓｉｇｍａ公司购得；ｃ３，Ｃ３抗血清，牛血清蛋白（ＢｓＡ）均购自上海申索生物试剂公

司：切片右蜡购白中国人民解放军８９９４２部队试剂厂，使用前未进一步纯化；纳米

听两次。

４．２．５免疫反应荧光检测过程

酶联免疫荧光传感装置构造如图４．２所示。测量程序如下：第一步，４ｉ同体

积的ｃ３待测溶液与１００ｌ＿ｔＬ

ＨＲＰ—Ｃ３连接体混合，然后加入缓冲液使溶液总体积

为５ｍＬ，将史持体插入培养液中，在２７

４Ｃ下培育２０分钟，取出用洗液冲洗传感

表面，测量前将传感生物组分支持体置于缓冲溶液中保存；第二步，将传感生物

组分支持体同定于位于光路上的流通反应池上；包含２．５×１０－６Ｍ／ＬＴＭＢ底物溶

液被泉入流通反应池，在２９８ｎｍ处激发光下，测置３９８ｎｍ处底物溶液的荧光强

度，接着加入５×１０４Ｍ／ＬＨ，Ｏ，并记录变化了的荧光值，计算荧光强度变化。

Ｆｉｇ．４．２

Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ

ｄｉａｇｒａｍ

ｏｆｆｌｏｗ

ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

ｓｙｓｔｅｍ

ｃｏｕｐｌｉｎｇ

ｗｉｔｈ

ｆｌｕｏｍｅｔｒｙ

４．２．６．支持体表面的再生

生物组份支持表面可以通过通入ｐＨ２．０的Ｂ－Ｒ缓冲溶液２０分钟，用二次蒸

馏水冲洗支持体表面，复于Ｃ３抗血清液中孵育２０分钟，支持体即可再生。

４．３结果与讨论

～

。冷

。冷

一

‰

：夕Ｑ…懑毗

４．３．１定量基础

ＴＭＢ用作ＨＲＰ底物用在酶联免疫分析的可见比色测定中；在电化学方法方面，

ＴＭＢ已用于Ｈｅｌｉｃｏｂａｅｆｅｒ

ｐｙｌｏｒｉ免疫分析【１１５１。ＴＭＢ是联苯胺的甲基化衍物生，

在紫外光激发下，能产较强的荧光．在分析程序中，样品中的ｃ３和加入的ＨＲＰ—Ｃ３

竞争与支持体表面抗皿清发生免疫反应，两连接到电极上，Ｃ３（待测）浓度越

大，ＨＲＰ．Ｃ３连接在支持体表面的量越少，在酶催化反应环节，ＨＲＰ—Ｃ３将底物

溶液中的部分ＴＭＢ转化成无荧光化合物，而使底物溶液荧光降低，所以ＨＲＰ—Ｃ３

越多，荧光降低越大，相应的待测待ｃ３浓度越少。酶催化反应及荧光发射如图

４－３所示。Ｆ波４

３显示了２．５×１０－７Ｍ／ＬＴＭＢ＋５×１０—１Ｍ／ＬＨ２０２溶液在加入计ｉ同浓

度ＨＲＰ．Ｃ３后的荧光变化情况，从图上可知，ＨＲＰ．ｃ３引起的荧光降低具有浓

度相关性。

Ｆｉｇ．４．３

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｄｅｃｒｅａｓｅｏｆＴＭＢ

ｏｂｔａｉｎｅｄ

ｗｉｔｈｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎ

ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ＨＲＰ．Ｃ３

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｆｏｒ２ｒａｉｎｓ

ｉｎ

ＰＢＳ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎ９２，５ｘ１０－７Ｍ／ｍＬ

ＴＭＢ

ａｎｄ

５ｘ１

０＂７Ｍ／ｍＬ

Ｈ２０２

ａｔ

ｐＨ

６．８．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｆＨＲＰ—Ｃ３

ｗａｓ（１ａｇ／ｍＬ）：（ａ）０；（ｂ）

１．２ｘ１０。２；（ｃ）４．８ｘ１０。；（ｄ）６ｘ１０～．

４．３．２．ｐＨ的影响

ｐＨ不仅影响ＴＭＢ荧光强度，同时也影响Ｔｉ０２吸附抗体的量的多少．由于Ｔｉ０２

的等电点为６旧］，因此在免疫反鹿中，为获得较大的抗体吸附量，溶液ｐＨ值应略为

碱性为好，但是在碱性条件下，底物ＴＭＢ的荧光很弱，增大误差，因此在本实验中，

选择ＤＨ为６．８．

４．３．３流速的影响

肖ＴＭＢ—Ｈ２０２溶液流径流通反麻池时，与ＨＲＰ－Ｃ３一Ｃ３Ａｂ复合物接触的部分ＴＭＢ

被转化为无荧光产物，所以底物溶液流速直接影响荧光强度。图４．６说明了流速对底

物液荧光的影响。流速低，荧光降低较多，若太低分析时间则会延长，本研究选用

３０ｍＬ／Ｈ的液流速度。

Ｆｉｇ．４．４

Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｆｌｏｗ

ｒａｔｅ

ｏｆｔｈｅ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅ

ｃａｒｒｉｅｒ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ

ｄｅｃｒｅａｓｅ．

ｏｎ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

４．３．４实验条件优化

免疫组分支持体制备利实验过程中参数值的设置都会影响传感系统的荧光

响应特性。传感免疫组分支持体中的Ｔｉ０２量直接影响传感表面可吸附抗体的两

地多少，在实验中增加支持体中Ｔｉ０２的含量，发现在Ｔｉ０２的含量为５％（ｗ／ｗ）时，支

持体的“及附能力最强，这可能是该比例是碳粉和Ｔｉ０２的协同吸附能力最强的缘故．

传感免疫组分支持体上吸附的ｃ３抗虹清的量直接影响传感表面与ＨＲＰ－Ｃ３和

ｃ３的键合。ｃ３抗血猜浓度从０．１到１．５ｍｇ／ｍＬ，荧光降低增大，而后再增加ｃ３

抗血清的浓度，荧光开始趋于稳定，表明暴露的抗体键合位点已经被完全键合。

【天１此，用１

５ｍｇｌｍＬ的ｃ３抗血清作为史持体的同定抗体的浓度．。

传感体系的响应直接与传感界面键合的酶标抗原的量相关，即与培养液中

酶标抗体的用量相关。实验中期望用最少量的ＨＲＰ－Ｃ３能获得最大的荧光响应

值。通过逐步增加培养液中ＨＲＰ．Ｃ３的量来选择其最优值。如图４．５所示：在

ｌｍＬ培养液中，当ＨＲＰ—Ｃ３溶液（３０

饱和值。冈此，１００

ｕ

ｕ

ｇ／ｍＬ）用量增加到１００１．ｔ

Ｌ时，响应达到

Ｌ的ＨＲＰ—Ｃ３溶液加到最终体积为ｌｍＬ的培养液中视为实

验的最佳值。另外的实验结果表明在２７＊（２下培育３０分钟为最传的温度和培育时

间。

／／

＜

Ｆｉｇ

４５Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅ

ａｍｏｕｎｔｏｆＨＲＰ。Ｃ３

４．３．５

免疫传感装置的响应特性及初步应用

图４．６是在最优条件下测得的ｃ３补体的校正曲线。荧光响应与ｃ３补体在６．５ｎｇ／ｍＬ

到７５ｎｇ／ｍＬ之间呈准线性关系。用同一传感生物组份支持体经ｐＨ２的Ｂ．Ｒ缓冲液进

行表面更新后测定同’一浓度的ｃ３补体，其相对标准方差５．３％（ｎ嗡１，说明该装置可以

为检测ｃ３补体提供一个相对可靠的结果。

Ｆｉｇ．４

６Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ

ｃｕｒｖｅ

ｆｏｒＣ３ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄ

ｂｙ

ｔｈｅ

ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｂｉｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ

ｉｎｃｕｂａｔｅｄｉｎ０．０６７ｍｏｌ／ＬＰＢＳｏｆ

ｐＨ

６．８

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ａｍｏｕｎｔ

ｏｆＣ３（ａｎａｌｙｔｅ），１．２

ｐｇ／ｍｌ

Ｃ３一ＨＲＰ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅ

ａｎｄ

０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ．

Ｅａｃｈ

ｐｏｉｎｔ

ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ

ｔｈｅｍｅａｎ＿＋ＳＤ

ｏｆｆｏｕｒ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．

对制各的传感器装置用于榆测咖清中ｃ３的含量的可行性进行了研究。我们

用制备的装置测定了４份由中南大学湘雅医学院提供的血清样品，并将结果与临

床中ＥＬＩＳＡ法测定结果进行了比较（表４．１）。由表可知，用该建议方法检测血

清中ｃ３完全能满足临床分析的需要．

Ｔａｂｌｅ

４．１

Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

ｉｎｈｕｍａｎ

ｓｅｒｕｍ

ｓａｍｐｌｅｓ

Ｓａｍｐｌｅ（ａ）

Ｓｅｎｓｏｒｍｅｔｈｏｄｅ

Ｃｌｉｎｉｃａｌ

ｍｅｔｈｏｄ（ＥＬＩＳＡ）

ｇＬ‘１

ｇＬ一１

１＃

１．１６±０．０２（ｂ１

１．１４

２＃

１．４３４－０．０５

１．４５

３＃

２．１８４－０．０７

２．３

ａ．Ｓａｍｐｌｅｓ

ｗｅｒｅｄｉｌｕｔｅ２ｘ１

０４ｔｉｍｅｓ；ｂ．Ｍｅａｎ±ＳＤ

ｏｆ

ｆｏｕｒｍｅａｓｕｒｍｅｎｔ．

４．４结论

试验结果表明，基于纳米Ｔｉ０２颗粒吸附免疫组分的酶联免疫荧光传感体系可

以提高ｃ３检测的灵敏度，制备的可更新免疫组分支持体基本解决了免疫传感层

再生困难的问题，经过酸性溶液的洗涤后，支持体表面可以得到再生，该方法简单，

榆测下限较低，可以满足临床分析的需要。

第五章

基于甲哌氯丙嗪为荧光底物的可更新荧光免疫技

术用于羊抗人免疫球蛋白的测定

５．１前言

生物免疫测定方法，比如酶联免疫法，放射免疫分析，电化学免疫分析等在医学

诊断，食品和环境的方［Ⅱｉ有发挥了很重要的作用ｆ１１８，ｉ”】．由于放射免疫法会带来放

射性污染，酶联免疫法和荧光免疫分析法被更广泛的虑用于生物分析中．传统的酶

联免疫法一般使用比色法来测定酶催化发应．可是这种方法灵敏度４ｉ高．电化学免

疫受溶液的多离子性及离子活度与离子浓度之间的复杂关系的影响存在灵敏度

低（榆测限一般为微摩尔级）及线性范同上限低等缺点．于是耦台了酶催化放大

技术和高灵敏度的荧光检测技术的酶联荧光免疫技术解决了这个问题．

对羟基苯乙酸‘…】，对羟基苯丙酸㈣］，阿魏酸‘１３２１等都曾用作辣根过氧化物酶的

荧光底物．但是已有的辣根过氧化物酶的荧光底物存在以下不足：１）酶催化反应速

度慢，荧光产物的荧光较弱且发射波长与蛋白质相近．２）对Ｈ２０２敏感，Ｈ２０２对荧光

底物的影响很大．３）荧光产物的ｓｔｏｃｋｓ位移小．甲哌氯丙嗪是一种抗呕吐剂，主要作

用于人体的神经系统ｌ””．它对Ｈ她较稳定，可以作为辣根过氧化物酶的底物［１３４１我

们研究发现酶催化反应可导致其荧光增强．本实验试图用聚苯乙烯（Ｐｓ）制成支持体

通过疏水性非特异性吸附将ＩｇＧ固定在其表面，然后与羊抗人ｌｇＧ和酶标羊抗人

ｌｇＧ进行竞争免疫反应，而酶标羊抗人ｌｇＧ可催化Ｈ２０２将荧光底物一甲哌氯丙嗪

２－Ｃｈｌｏｒｏ一１

０－【３一（４一ｍｅｔｈｙｌ一１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］一ＩＯＨ—ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ）

氧化，导致荧光增强，呙此可用荧光增强的多少来测定羊抗人ＩｇＧ的量．通过简单的

打磨抛光后航体支持体表面可以得到有效的再生．

５．２实验部分

５．２．１试剂

辣根过氧化物酶（ＨＲＰ，１０００

Ｕｍｇ～，Ｒｚ－３．０）和甲哌氯丙嗪

（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ，ＰｃＰｌ从Ｓｉｇｍａ公司购得；ＩｇＧ羊抗人ｌｇＧ（ＧａｌｇＧ），牛血清蛋白

（ＢｓＡ）均购自上海申索生物试剂公司；实验中，含有Ｏ．１％ＢＳＡ的磷酸缓冲溶液

（ＰＢＳ），用Ｏ．０６７ｍｏｌ／Ｌ

ＫＨ２Ｐ０４和０．０６７

ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＨＰ０４配制。ＨＲＰ底物溶液为

包含ＰＣＰ－Ｈ２０２，ｐＨ

５．４的ＰＢＳ．其余试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水．

５．２．２仪器

目奉ＨＩＴＡＣＨＩｆ－４５００型荧光光度仪用于荧光测定：Ｅｊ本ＳＨＩＭＡＤＺＵ

ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒ．１

５０１紫外分光光度仪用于紫外测定；ＣＳＳ５０１型恒温槽用于控制孵育

温度。江苏产蠕动泉产生液流．

５．２．３酶标ＧａＩｇＧ的制备

将５．０ｍＬＨＲＰ溶解于０．５

ｍｏｌＬ。１

ｐＨ值为５．０的醋酸钠缓冲溶液中，加入Ｏ．２５

ｍＬ０．１

ｍｏｌＬ。的Ｎａｌ０４溶液，在４℃下反应３０ｒａｉｎ。而后加入０．５ｍＬ２．５％（ｖ／ｖ）

的乙二醇溶液，室温下放置３０分钟。加入ＧａｌｇＧ１．０ｍｇ，用碳酸钠缓冲溶液（ｐＨ

９，５）调ＤＨ值至９．０，将溶液于４℃下放置过夜。再缓慢的向溶液中加入０．１ｍＬ

（５

ｍｇｍＬ～）Ｎａｌ０４溶液，在４℃下放置２

ｈ后，４＂Ｃ下置于ｐＨ值为７．４的０．１

ｍｏｌｌ。１

磷酸缓冲液中透析过夜．

５．２．４

ＩｇＧ的固定

聚苯乙烯（Ｏ．０５９），碳粉（Ｏ．０８９）混合，用ｌｍＬ乙醚溶解，在空气中干燥

ｌＯ分钟。待绝大部分乙醚挥发后，将所得黑色糊状混合物塞入直径为６ｍｍ，深１

ｃｍ［”１的ＰＶＣ管中，放置一天待其变硬。将其表面在金相砂纸上抛光成镜，置于１

ｍｌ

１ｍｇ／ｍＩ

ｌｇＧ培养液中孵育２０分钟，取出，再分别用水和ＰＢＳ液洗涤其表面两

次。

５．２．５免疫反应荧光检测过程

酶联免疫荧光传感装置构造如图Ｆｉｇ．５．１所示。测量程序如下：第一步，不同

体积的ＧａｌｇＧ待测溶液与１００¨Ｌ

ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ连接伴混合，然后加入缓冲液使溶

液总体积为ｌｍＬ，将支持体插入培养液中，在２７

６Ｃ下培育２０分钟，取出用洗液

冲洗传感表向，测量前将传感生物组分支持体置于缓冲溶液中保存；第二步，将

传感生物组分史持体固定于位于光路上的流通反应池上；包含２．５×１０４

ｍｏｌＬ。

ＰＣＰ底物溶液被泵入流通反应池，在３５０ｎｍ处激发光下，测３９２ｎｍ处底物溶液

的荧光强度，接着加入５×１０。６ｍｏｌＬ～Ｈ２０２并记录变化了的荧光值，计算荧光强

度变化。

Ｆｉｇ．５

１

Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ

ｄｉａｇｒａｍ

ｏｆｆｌｏｗ

ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

ｓｙｓｔｅｍ

ｃｏｕｐｌｉｎｇ

ｗｉｔｈ

ｆｌｕｏｍｅｔｒｙ

５．２．６支持体表面的再生

生物组份史持体表面可以通过在金相砂纸上抛光再生

５．３结果与讨论

５．３．１．ＧａｌｇＧ的定量

ａ１

ＰＣＰ的结构如图Ｆｉｇ．５．２所示

／＾＼Ｎ—ＣＨ３

广，Ｎ＼／

颐！珂ａ

Ｆｉｇ．５．２

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰＣＰ

Ｈ２０２可以将ＰＣＰ缓慢氧化成红色产物，ＨＲＰ可催化该反应进程，反应过程中可

观察到蓝色中间体的产生．图Ｆｉｇ．５．３是ＰＣＰ溶液在ＨＲＰ的催化下与Ｈ２０２的作用

的紫外光谱．图中ａ为单纯的１×１０。ｍｏｌＬ。ＰＣＰ溶液的紫外图，ｂ为加入Ｈ２０２后的

紫外图，ｃ为在酶作用下Ｈ２０２氧化ＰＣＰ的紫外图由图可知，底物ＰＣＰ在３００ｎｍ处

有明显的紫外吸收峰Ａ，加入Ｈ２０２后，在５１

５ｎｍ处有一处ｕ及收峰Ｄ，加入酶之后该

峰消失，该峰也许是Ｈ２０２和底物ＰＣＰ作用所形成的中间态物质的紫外吸收峰，加

入酶之后，Ｈ２０２优先和酶反应生成＋５价的酶中间体，所以该峰消失；自ｎＸＮＺＮ在

３３５ｎｍ处产生～个明显的峰Ｃ，Ｃ峰应该是ＰＣＰ氧化最终产物的紫外吸收峰．在

２９５ｎｍ处的Ｂ峰随Ｈ２０２和酶的加入逐渐升高，Ｂ峰也许是氧化的中间产物的紫外

吸收峰．

…日ｌＢ

ｎｇｍｌ

Ｆｉｇ．５．３Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ

ｓｐｅｃｔｒｕｍ．ａ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１×１０。ｍｏｌＬ“ＰＣＲ

ｂ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｌ

×１０－３ｍｏｌＬ‘１

ＰＣＰ

ａｎｄ

３×１０－３ｍｏｌＬ～Ｈ２０２．Ｃ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１×１０。ｊｍｏｌＬ“ＰＣＰａｎｄ

３×

１０—３ｍｏｌＬ一‘Ｈ２０２

ｗｉｔｈ

１０

ｕ

ｇ／ｍＬ

ＨＲＰ

荧光峰的选择：ＰＣＰ在２８０ｎｍ和３５０ｒｉｍ处有两个激发峰，同样在３９５ｎｍ和

４５０ｎｍ处有两处发射峰．分别固定２８０ｎｍ和３５０ｎｍ激发扫描发射峰，发现固定

３５０ｎｍ的激发３９５ｎｍ和４５０ｎｍ处的两处发射峰都远远大于２８５ｎｍ处激发产生的

发射．由图Ｆ晤５．４可知ＰＣＰ在３５０ｎｍ处的激发光下，在３９５ｎｍ和４５０ｒｉｍ处显示有

两处荧光发射．图中ａ为１×１０－３ｍｏｌｌ’１

ＰＣＰ溶液的荧光曲线．在加入３×

１０。ｍｏｌＬ“Ｈ２０２后．４５０ｎｍ处的荧光峰明显降低，而３９５ｎｍ处的荧光峰增加很小（ｂ）．

在有酶存在的情况下，３９５ｎｍ处的荧光峰叫显增强，而４５０ｎｍ处的荧光峰被３９５ｎｍ

处的荧光峰所掩盖．所以我们选择３９５ｎｍ处的荧光峰来对免疫过程进行检测．

Ｆｉｇ

５．４ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｓｐｅｃｔｒｕｍ．ａ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１×１０－５ｍｏｌＬ“ＰＣＥ

ｂ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１

ｘ

１０－５ｍｏｌＬ“ＰＣＰ

ａｎｄ

３×１０。ｍｏｌＬ～Ｈ２０２

ｃ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

１×１０－５ｍｏｌＬ‘１

ＰＣＰａｎｄ３×

１

０－５ｍｏｉＬ一‘Ｈ，Ｏ，ｗｉｔｈ

２

ｕ

ｇ／ｍＬ

ＨＲＲ

分析程序中，样品中的ＧａｌｇＧ和加入的ＨＲＰ－ＧａｌｇＧ竞争与ｌｇＧ发生免疫反

戍而连接到电极上，ＧａｌｇＧ（待测）浓度越大，ＨＲＰ－ＧａｌｇＧ连接在支持体表面的

量越少，在酶催化反应环节，ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ催化Ｈ２０２将底物溶液中的部分ＰＣＰ

转化为中间产物Ｍ１，而使底物溶液在３９２ｎｍ处的荧光峰荧光增强，所以ＨＲＰ—

ＧａｌｇＧ越多，荧光增强越大，相应的待测待ＧａＩｇＧ浓度越少。酶催化反应荧光

发射如图Ｆｉｇ．５．５所示。从图上可知，ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ引起的荧光升高具有浓度相关

性。冈此可以用荧光升高值来对ＧａｌｇＧ进行定量．

一

Ｆｉｇ

５．５

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

■澎一

一

ｉｎｃｒｅａｓｅ

ｏｆ

ＰＣＰ

ｏｂｔａｉｎｅｄ

ｗｉｔｈｔｈｅ

ａｄｄｉｔｉｏｎ

ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｆｏｒ

２ｒａｉｎｓ

ｉｎＰＢＳ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎ９２．５×１０‘ｍｏｌＬ一１

ＰＣＰ

ａｎｄ

５ｘ１０。６

ｍｏｌＬ。。Ｈ２０２

ａｔ

ｐＨ

５．４．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｆＨＲＰ－ＧａｌｇＧ

ｗａｓ（ｇｔｇ／ｍＬ）：（ａ）Ｏ；（ｂ）

２．５×１０‘。；（ｃ）５ｘ１０～；（ｄ）９ｘ１０

５．３．２实验条件的优化

实验过程中参数的改变会传感系统的荧光响应．这些参数主要包括ｐＨ，支持体

的机械性能，流速，温度，酶标抗原和抗体的浓度大小等．

５．３．２．１

ｐＨ的影响

小仅ＰＣＰ奉身的荧光强度受ｐＨ影响，而且ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ的活性和ＨＲＰ—

ＧａｌｇＧ－ｌｇＧ复合物的稳定性也受ｐＨ的影响。Ｆｉｇ．５．６是２，５×１０。ｏ

ｍｏｌＬ。１ＰＣＰ溶

液的荧光随ｐＨ变化曲线。从图Ｆ嘻５．６上可知，溶液的荧光强度在ｐＨ５．３…７．４

之间荧光趋于降低。这可能是ｐＨ直接影响ＰＣＰ的质子化过程而影响基态与激发

态的平衡的缘故．由于酸性太强对酶和抗原抗体的活性都有很大的影响，故在试验

中选择ｐＨ５

４为最佳ｐＨ值．

懈

啪

ｍ

啪

ｍ

ｍ

Ｆｉｇ．５．６

Ｅｆｆｅｃｔｏｆ

ｐＨ

ｏｎ

ＰＣＰ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｌｉｎｅｎｓｉｔｙ

５．３．２．２

ＰＳ免疫组分支持体的性质

在奉实验中，在ＰＳ中加入碳粉可以增加其吸附能力，同时还可以提高支持体的

机械强度．实验中，在ＰＳ与碳粉的比例为２：３时，支持体的机械性能最好．

５．３．２．３流速的影晌

当ＰＣＰ—Ｈ２０２溶液流径流通反应池时，与ＨＲＰ－ＧａＩｇＧ－ｌｇＧ复合物接触的部分

ＰＣＰ被转化引起荧光增强，所以底物溶液流速直接影响荧光强度。图Ｆｉｇ．５．７说

明了流速对底物液荧光的影响。流速低，荧光升高较多，若太低分析时间则会延

长，本研究选用３０ｍＬ／Ｈ的液流速度。

１０……∞Ｍ∞∞

……ｌｍｍＩ

Ｆｉｇ．５．７

Ｅｆｆｅｃｔ

ｏｆｔｈｅｆｌｏｗ

ｒａｔｅ

ｏｆ

ｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ

ｉｎｃｒｅａｓｅ．

ｃａｒｒｉｅｒ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ

ｏｎ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

５．３．２．４抗体和酶标抗原浓度的影响

ａ．ＩｇＧ的含量将直接影响到电极表血ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ的量．１９Ｇ浓度０．１到ｌｍｇ／ｍｌ，

荧光升高增大，再增大浓度时，荧光强度趋于稳定，冈此在试验中选择１ｍｇ／ｍｌ

为最佳抗原浓度．

ｂ．传感体系的响应直接与传感界面键合的酶标抗体的量相关，即与培养液中酶

标抗体的用量相关。实验中期望用最少量的ＨＲＰ．ＧａｌｇＧ能获得最大的荧光响

虑值。通过逐步增加培养液中ＨＲＰ．１９Ｇ的量来选择其最优值。如图Ｆｉｇ．５．８

所示：在ｌｍＬ培养液中，当ＨＲＰ．ＧａｌｇＧ溶液（３０１．ｔ

ｇ／ｍＬ）用量增加到３０Ｈ

Ｌ时，响应达到稳定。因此，３０

ｕ

Ｌ的ＨＲＰ．ＧａｌｇＧ溶液加到最终体积为ＩｍＬ

的培养液中视为实验的最佳值。另外的实验结果表明在２７。ＣＴ培育２０分钟

为最佳的温度和培育时间。

Ｆｉｇ．５．８

Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅ

ａｍｏｕｎｔ

ｏｆＨＲＰ－ＧａｌｇＧ．

ｃ．在实验中我们同定了ＰＣＰ的浓度为２．５×１０。６

ｍｏｌｌ。１ＰＣＰ溶液为荧光底液

在固定ＨＲＰ—ＧａｌｇＧ浓度不变的情况下，测得５×１

０。６

ｍｏｌＬ。１的Ｈ２０２为最佳浓度．

５．３．２．５免疫传感装置的响应特性及初步应用

图Ｆｉｇ．５．９是在最优条件下测得的ＧａｌｇＧ的校正曲线。荧光响应与ＧａｌｇＧ浓

度在２ｎｇ／ｍＬ到６０ｎｇ／ｍＬ之间呈准线性关系。相关系数为０．９８．同一支生物组分支

持体经过打磨抛光进行表面更新后对同浓度的ＧａｌｇＧ进行检测，相对方差为

２．１％（ｎ＝８），说明该装置可较准确对ｌｇＧ进行定量．

３．４结论

以ＰＳ制成支持体同定ｌｇＧ，以甲哌氯丙嗪为荧光底物可较准确的测定ＧａｌｇＧ的

含量．通过简单的打磨抛光后，抗原支持体表面可以得到有效的再生．该方法具有简

单，榆测限低，重现性好等优点．

结论

第一部分：１）以壳聚糖和改性褐藻酸钠凝集作用制备的日本血吸虫传感器解决

了以往同定方法中影响生物活性利再生困难的问题，同时将褐藻酸钠进行改性，极大

的降低了生物同定载体表面非特异性吸附严重的问题．２）利用纳米二氧化钛颗粒与

碳粉的协同作用，制备了一种高灵敏度的过氧化氢传感器．将纳米＝氧化钛包埋

入碳糊电极里的方法研制同定酶的生物传感器可以解决传统的酶修饰电极小能很

好的满足灵敏度，置信度以及操作简便的要求．

第二部分：以３，３’．５，５’一四甲基联苯胺（ＴＭＢ）和甲哌氯丙嗪（ＰＣＰ）为荧光底物

解决了以往酶联荧光免疫传感器中底物的一些巧ｉ足：１）酶催化反应速度慢，荧光产

物的荧光较弱且发射波长与蛋白质相近．２）对Ｈ２吼敏感，Ｈ：Ｏ：对荧光底物的影响很大

以３．３’，５，５’

四甲基联苯胺（ＴＭＢ）和甲哌氯丙嗪（ＰＣＰ）为荧光底物已经成功用于

测定Ｃ３补体和羊抗人ｌｇＧ．

４２

致

谢

本论文是在导师沈国励教授的悉，０指导下完成的．从论文的选题，实验方案的

拟定到文章利沧文的修改，每一项Ｔ作都凝聚了沈老师的心血．他渊博的知识。严

谨的治学态度，开阔的学术思想和勤勉的教书育人的作风永远是我们学习的榜样

对我们无微小至的关怀体现了他高尚的情操，让我永生难忘．在此．谨向导师沈国

励教授表示衷心的感谢．

感谢胡舜钦博十对我论文的选题．文章和论文的修改提出的宝贵思想和意见

他严谨的Ｔ作态度，开阔的知识面和对我生活工作上的关心使得我能在二年中顺

利完成学业在此，对胡舜钦博十表示由衷的感谢

真诚的感谢本实验童蒋健晖教授，崔卉，吴朝阳，营棒祥老师的热情帮助和大

力史持．感谢龚福春，雷存喜，宦双燕，杨郁．王桦，李继¨ｌ，陈立新，李春香等同学

在诸多问题上的讨论和大力史持．

最后，感谢我的父母和朋友对我三年来的理解，支持和帮助

二零零二年七月于长沙

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Ｍ

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ＤＮ

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Ｙ，Ｓａｋａｉ

Ｋ．Ａ

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ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｆｏｒ

ｍｅａｓｕｒｉｎｇＩｇＧ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｉｎ

ｈｕｍａｎ

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ｂａｓｅｄ

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ｔｈｅ

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ＲＤＸ

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ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ

ｄｙｅ—ｌａｂｅｌｅｄ

ａｎｔｉｇｅｎ

ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ

ｆｌｏｗ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ，

Ｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ａｃｔｕａｔｏｒｓ

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１｜４１８

［４４］Ｈｕｉｑｕａｎｚ

ｖａｎ

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Ｏ

Ｐ，Ｋｌｅｉｊｅｒ

Ｗ

Ｊ，ＰｕＬ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ

ｄｉａｇｎｏｓｉｓ

ｏｆ

ｍｏｒｑｕｉｏ

Ａ

ｓｙｎｄｒｏｍｅ

ｗｉｔｈ

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ｎｅｗ

ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｃｈｉｎ

Ｍｅｄ

Ｓｃｉ

Ｊ，１９９１，６（１）：９－】３

［４５］Ｈｕａｎｇ

ｚ，Ｏｌｓｏｎ

Ｎ

Ａ，Ｙｏｕ

Ｗ，Ｈａｕｇｌａｎｄ

Ｒ

Ｐ，Ａ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｃｏｍｐｅｔｉｔｖｅ

ＥＬＩＳＡ

ｆｏｒ

２．４．ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ

ｕｓｉｎｇ

３，６一ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ

ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ａｓ

ａ

ｆｉｕｏｒｏｇｅｎｉｃ

ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｊ

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４６

ｆ４６］Ｐｅｔｍａ

Ｒ

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Ｍ

Ｊ，Ｖｏ－Ｄｉｎｈ

Ｔ

Ｆｉｂｅｒ－ｏｐｔｉｅｓ－ｂａｓｅｄ

ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ

ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

ｆｏｒ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ｔａｌａｎｔａ，１９８８，３５（１）：１

３９—１４４

［４７］Ｊ６ｒｇ

Ｍ，Ｕｗｅ

Ｋ．Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ

ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ

ａｓｓａｙ

ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ｌａｂｅｌｓ

ａｎｄ

ｅｎｚｙｍｅ—ａｍｐｌｉｆｉｅｄ

ｌａｎｔｈａｎｉｄｅｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｓｔ，２０００，１２６：１７５—１７８

【４８］Ｓｕｌｅｉｍａｎ

Ａ

Ａ，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ

Ｇ

Ｇ

Ｒｅｃｅｎｔ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｉｎ

ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ［ｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ．

Ａｎａｌｙｓｔ，１

９９４，１

１９：２２７９－２２８５

［４９］Ｇｕｉｂｕｌｔ

Ｇ

Ｇ

ＨｏｃｋＢ．Ｔｈｅ

ｑｕａｒｔｚ

ｃｒｙｓｔａｌ

ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ

ａｓ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．

Ａｎａｌ

Ｌｅｔｔ，

１

９９５，２８：７４９．７５３

【５０］Ｇｅｄｄｅｓ

Ｎ

Ｊ，Ｐａｓｃｈｉｎｇｅｒ

Ｅ

Ｍ，Ｆｕｒｌｏｎｇ

Ｄ

Ｎ．Ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ

ｃｒｙｓｔａｌ

ｆｏｒ

ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆ

ｉｍｍｕｎｏ．ｒｅａｃｔｉｏｎｉｎ

ｂｕ盱ｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ，１９９４，１７１：１２５—１

３１

【５１］Ｃａｒｔｅｒ

Ｒ

Ｍ，Ｊａｃｏｂｓ

Ｍ

Ｂ，Ｌｕｂｒａｎｏ

Ｇ

Ｊ，Ｇｕｉｂｕｌｔ

Ｇ

ＧＰｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｉｃｉｎ

ａｎｄ

ａｆｆｉｎｉｔｙ

ｐｕｒｉｆｉｅｄ

ｇｏａｔ

ａｎｔｉ—ｒｉｃｉｎ．Ａｎａｌ

Ｌｅｔｔ，１９９５，２８：１３７９—１３８６

［５２］Ｐｉｚｚｉｃｏｎｉ

Ｖ

Ｂ，Ｐａｇｅ

Ｄ

Ｌ．Ａ

ｃｅｌｌｂａｓｅｄｉｍｍｕｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｗｉｔｈ

ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｄｅｓｉｇｎ

ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１９９７，１２：２８７～２９９

［５３］Ｘｉｅ

Ｂ．Ｍｅｃｋｋｌｅｎｂｕｒｇ

Ｍ，Ｄａｎｉｅｌｅｓｓｏｎ

Ｂ，ｅｔ

ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｏｆ

ａｎ

ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ

ｔｈｅｒｍａｌ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒ

ｔｈｅ

ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｍｕｌｔｉｐｌｅ

ａｎａｌｙｔｅｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，

１９９５，１２０：１５５—１５９

【５４］Ｓｅｇｅｙｅｖａ

Ｔ

Ａ，Ｌａｖｒｉｋ

Ｎ

Ｖ

Ｒａｃｈｋｏｖ

Ａ

Ｅ，ｅｔ

ａ１．Ａｎ

ａｐｐｒｏａｃｈ

ｔｏ

ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｕｎｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ

ｔｈｉｎｎｌｍ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｍｎｉｃｓ．

１９９８，１

３：３５９—３６９

［５５］Ｋａｎｕｎｇｏ

Ｍ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ

Ｄ

Ｎ，Ｋｕｍａｒ

Ａ，ｅｔ

ａ１．Ｃｏｎｄｕｃｔｉｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｐｏｌｙ（３，４－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ

Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００２，８：６８０—６８

１

【５６】Ｋｉｍ

Ｊ

Ｈ，Ｃｈｏ

Ｊ

Ｈ，Ｃｈａ

Ｇ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．Ｃｏｎｄｕｃｔｉｍｅｔｒｉｃ

ｍｅｍｂｒａｎｅ

ｓｔｒｉｐ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｗｉｔｈ

ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ－ｂｏｕｎｄ

ｇｏｌｄ

ｃｏｌｌｏｉｄｓ

ａｓ

ｓｉｇｎａｌ

ｇｅｎｅｒａｔｏｒ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，

２０００，１４：９０７—９１５

［５７］Ｓａｎｄｂｅｒｇ

Ｒ

Ｑ

Ａｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ

ｐｏｌｙｍｅｒ

ｂａｓｅｄｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｆｏｒ

ｔｈｅ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆ

ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ

ｒｅｓｉｄｕｅｓ．ＡｍＣｈｅｍ

Ｓｏｃ

Ｓｙｍｐ

Ｓｅｒ，１

９９２．５

１

１：８

１—８８

［５８］’Ｆｈｏｍｐｓｏｎ

Ｊ

Ｃ，Ｍａｚｏｈ

Ｊ

Ａ，ｅｔ

ａｌ＿Ｅｎｚｙｍｅ

ａｍｐｌｉｆｉｅｄ

ｒａｔｅ

ｃｏｎｄｕｔｉｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

Ａｎａｌ

Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９ｌ，１

９４：２９５－３０１

［５９］Ｙａｇｉｕｄａ

Ｋ，Ｈｅｍｍｉ

Ａ，ＩｔｏＳ，ｅｔ

ａ１．Ｄｅｖｅｌｐｏｍｅｎｔ

ｏｆ

ａ

ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ。ｂａｓｅｄ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎＳＯｒ

ｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆ

ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ

ｄｒｕｇ）ｉｎ

ｈｕｍａｎ

ｕｒｉｎｅ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１

９９６，８：７０３—７０７

［６０】Ｋｏｎｃｈｉ

Ｒ，Ｏｗｃｚａｒｅｋ

Ａ，Ｄｚｗｏｌａｋ

Ｗ’ｅｔ

ａ１．１ｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ

ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆ

ｍｅｍｂｒａｎｅ

ｉｏｎ—ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ａｃｔｕａｔｏｒｓ

Ｂ，１

９９８，４７：２４６．２５０

［６１］Ｓｅｒｇｅｙｅｖａ

Ｔ

Ａ，Ｓｏｌｄａｔｋｉｎ

Ａ

Ｒ

Ｒａｃｈｋｏｖ

Ａ

Ｅ，ｅｔ

ａ１．１３－Ｌａｃｌａｍａｓｅｌａｂｅｌ

ｂａｓｅｄ

ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ

ｆｏｒｎ一２

ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ

Ｃｈｉｍｉｃａ

Ａｃｔ．ａ，１９９９，

３９０（１－３）：７３—８１

［６２１彭图治，祝方猛．活化高分子膜免疫电极榆测乳腺癌抗原。

分析化学，２００１，

２９：３８３．３８６

［６３］Ｈａｓｓａｎ

Ｓ

Ｓ

Ｍ，Ｒｉｚｋ

Ｎ

Ｍ

Ｈ，ｅｔ

ａ１．Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ

ｇｒａｐｈｉｔｅ

ｓｅｎｓｏｒｓ

ｄｏｐｅｄ

ｗｉｔｈ

ｍｅｔａｌ—ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ

ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ

ｆｏｒｔｈｅ

ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ

ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ

ｕｒｉｃ

ａｃｉｄｉｎ

ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ

ｆｌｕｉｄｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，１２２：８１５－８１９

［６４］Ｔｓｕｒｕｔａ

Ｈ，Ｙａｍａｄａ

Ｈ，Ｍｏｔｏｙａｓｆｏｏｎ

Ｙ

ｅｔ

ａ１．Ａｎ

ａｕｔｏｍａｔｅｄＥＬＩＳＡ

ｓｙｓｔｅｍｕｓｉｎｇ

ａ

ｐｉｐｅｔｔｅｔｉｐ

ａｓ

ａｄｅｔｅｃｔｏｒ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８３：２２１—２２９

［６５］Ｖａｎｋｅｒｋｈｏｆ

Ｊ

Ｃ，Ｂｅｒｇｖｅｌｄ

Ｅ

Ｓｃｈａｓｆｏｏｒｔ

ＲＢ

Ｍ．Ｔｈｅ

ＩＳＥＦｔ；Ｔ

ｂａｓｅｄ

ｈｅｐａｒｉｎ

ｓｅｎｓｏｒ

ｗｉｔｈ

ａ

ｍｏｎｏｌａｙｅｒ

ｏｆ

ｐｒｏｔａｍｉｎｅ

ａｓ

ａｆｆｉｎｉｔｙ

ｌｉｇａｎｄ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，

１

９９５，１

０：２６９—２８２

【６６］Ｔｒｅｌｏａｒ

Ｐ

Ｈ，Ｎｋｏｈｋｗｏ

Ａ

Ｔ，Ｋａｎｅ

Ｊ

Ｗ，ｅｔ

ａ１．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ｓｉｍｐｌｅ

ｋｉｎｅｔｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｎｅ

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｎｚｙｍｅ

ｌａｂｅｌｓ

ｉｎ

ｌｉｍｉｔｅｄ

ａｎｄ

ｅｘｃｅｓｓ

ｒｅａｇｅｎｔ

ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１９９４，６：５６１—５６６

【６７］Ａｔｈｅｙ

Ｄ，Ｂａｌｌ

Ｍ，ＭｃＮｅｉｌ

Ｃ

Ｊ．Ａｖｉｄｉｎ

ｂａｓｅｄ

ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ

ｆｏｒ

ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈｉｎ．Ａｎｎ

Ｃｌｉｎ

Ｂｉｏｃｈｅｍ，１

９９３，３０：５７０－５７７

［６８］Ｋｅａｙ

Ｒ

ｗ’ＭｃＮｅｉｌ

Ｃ

Ｊ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ—ｆｌｅｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｆｏｒ

ｒａｐｉｄ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｔｒａｚｉｎｅ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１９９８，１３（１

７）：９６３－９７０

【６９］Ｏｚｇｅ

Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ

Ｊ

Ｂ．Ｓｔａｂｌｅ

ｓｅｎｓｏｒ

ｌａｙｅｒ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ

ｏｎｔｏ

ｓｕｒｆａｃｅｓ

ｕｓｉｎｇ

ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００１，１２６（３１）：１８６１—１８６５

【７０］Ｌｅｉ

Ｃ

Ｈ，Ｄｅｎｇ

Ｊ

Ｑ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ

ＰｅｒｏｘｉｄｅＳｅｎｓｏｒＢａｓｅｄ

ｏｎ

Ｃｏｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ

Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ

Ｇｔｅｅｎａｎｄ

Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ

Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ｉｎ

ｔｈｅ

ｓａｍｅ

Ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ

Ｍｏｄｉｆｉｅｄ

Ｂｏｖｉｎｅ

Ｓｅｒｕｍ

Ａｌｂｕｍｉｎ—Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ

Ｍａｔｒｉｘ

ｏｎ

ａ

Ｇｌａｓｓｙ

ＣａｒｂｏｎＥｌｅｃｔｒｏｄｅＳｕｒｆａｃｅ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，

１９９６．６８（１

９１：３３４４—３３４９

【７１】陈丹丹，刘宅红，孔继烈三氧化二铝溶胶一凝胶同定过氧化氢生物传感器．分析化

学，２００３，３０（８）：９５８—９６

１

［７２］Ｋａｒｙａｋｉｎ

Ａ

Ａ，Ｐｒｅｓｎｏｖａ

Ｇ

Ｖ

Ｒｕｂｔｓｏｖａ

Ｍ

Ｙ

ｅｔ

ａ１．Ｏｒｉｅｎｔｅｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ

ｏｎｔｏ

ｔｈｅ

ｇｏｌｄ

ｓｕｒｆａｃｅｓｖｉａ

ｔｈｅｉｒｎａｔｉｖｅｔｈｉｏｌ

ｇｒｏｕｐｓ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，２０００，

４９

７２：ｊ８０５－３８

ｌｌ

【７３］Ｓｕｓａｎ

ＬＲ

Ｂ，Ｄａｖｉｄ

Ｒ

Ｍｉｃｈａｅｌ

Ｊ．Ｔａｒｌｏｖ，ｅｔ

ａ１．Ｃｏｎｔｒｏｌ

ｏｆＦｌｏｗ

Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｉｎ

Ｍｉｃｒｏｔｉｕｉｄｉｃ

Ｄｅｖｉｃｅｓｗｉｔｈ

Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ

Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｓ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，２０００，７２（２４）：

５９２５—５９２９

［７４］Ｒｉｓｈｐｏｎ

Ｊ，ＧｏｔｔｅｓｆｅｌｄＳ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ

Ｃ，ｅｔ

ａｌ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ＧｌｕｃｏｓｅＳｅｎｓｏｒＢａｓｅｄ

ｏｉｌ

ＧｌｕｃｏｓｅＯｘｉｄａｓｅ

Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ

ｉｎ

Ｎａｔｉｏｎ

Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓ，１９９４，６：１７－２１

［７５］Ｇｕｎａｓｉｎｇｈａｍ

Ｈ，Ｔａｎ

Ｃ

Ｂ，Ｐｌａｔｉｎｕｍ

ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ

Ｎａｔｉｏｎ

Ｆｉｌｍ

Ｍｏｄｉｆｉｅｄ

Ｇｌａｓｓｙ

Ｃａｒｂｏｎ

ａｓ

ａｌｌ

Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｌｙｔｉｃ

Ｓｕｒｆａｃｅ

ｆｏｒ

ａｎ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

Ｇｌｕｃｏｓｅ

ＥｎｚｙｍｅＥｌｅｃｔｒｏｄｅ．Ａｎａｌｙｓｔ，

１

９８９，１１

４（６－８）：６９５－６９９

［７６］Ｓａｎｔａｎｄｒｅｎ

Ｍ，ＳｏｌｅＳ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ—Ｆａｂｒｅｇａｓ

Ｅ，ｅｔ

ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｏｆｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ

ｓｙｓｔｅｍｓ

ｗｉｔｈ

ｒｅｎｅｗａｂｌｅ

ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，

１９９８，１３（１）：７—１７

［７７］Ｗａｎｇ

Ｊ，Ｐａｍｉｄｉ

ＰＶ

Ａ，Ｒｏｇｅｒｓ

Ｋ

Ｒ．Ｓｏｌ—ｇｅｌ

ｄｅｒｉｖｅｄ

ｔｈｉｃｋ—ｆｉｌｍ

ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｏｓｒｓ

ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９８，７０（６）：１１７１—１１７５

［７８］Ｓａｄｉｋ

Ｏ

Ａ，Ｊａｈｎ

Ｍ

Ｊ，Ｗａｌｌａｎｃｅ

Ｇ

Ｇ

ｅｔ

ａ１．Ｐｕｌｓｅｄ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆ

Ｔｈａｕｍａｔｉｎ

ｕｓｉｎｇ

Ａｎｔｉｂｏｄｙ—ｃｏｎｍｉｎｉｎｇ

ｐｏｌｙ（ｐｙｒｒｏｌｅ）Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，１９９４，１１９（９）：

１９９７．２０００

［７９］Ｚｈｏｕ

Ｙ

Ｍ（周弧明），Ｌｉｕ

Ｇ

Ｄ（刘国东），Ｗｕ

ｚ

Ｙ（吴朝阳），ｅｔ

ａ１．Ａｎ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

［ｍｕｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

Ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ａ

Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ

ＩｍｍｕｎｏｃｏｍＤｏｓｉｔｃ

Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｆｏｒｔｈｅ

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ

Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ

Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ

Ａｎｔｉｇｅｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ

Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００２，

１８：ｌ５５．１５９

［８０］Ｌｉｕ

Ｇ

Ｄ（刘国东），Ｗｕ

Ｚ

Ｙ（吴朝阳），Ｗａｎｇ

Ｓ

Ｐ（汪世平），ｅｔ

ａ１．Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ

ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｆｏｒ

ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ

ｊａｐｏｎｉｕｍ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ａｓｓａｙ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，

２００１，７３（１４）：３２１９－３２２６

［８１］Ｔｉｎｓｌｅｙ—Ｂｏｗｎ

Ａ

Ｍ．Ｔｕｎｉｎｇ

ｔｈｅ

ｐｏｒｅ

ｓｉｚｅ

ａｎｄ

ｓｕｒｆａｃｅ

ｃｈｅｍｉｓ仃ｙ

ｏｆ

ｐｏｒｏｕｓ

ｓｉｌｉｃｏｎ

ｆｏｒ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ｐｈｙｓ

Ｓｔａｒ

Ｓｏｌ，２０００，１

８２（４）：５４７—５３

［８２］Ｓｍｉｔｈ

Ａ

Ｍ，Ｄｕｃｅｙ

Ｍ

Ｗ

Ｍｅｙｅｒｈｏｆｆ

Ｍ

Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ

ｏｆ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｌａｙｅｒｓ

ｌｉｎｋｅｄ

ｔｏ

ｔｈｉｏｃｔｉｃａｃｉｄ

ｔｒｅａｔｅｄ

ｇｏｌｄ

ｓｕｒｆａｃｅｓ

Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｍｎｉｃｓ，２０００，１

５（３－４）：

１９３－１９２

［８３］Ｄｉｓｌｅｙ

Ｄ

Ｍ，Ｃｕｌｌｅｎ

Ｄ

Ｃ，Ｙｏｕ

Ｈ

Ｘ，ｅｔ

ａ１．Ｌｏｗｅ

ａｎｄ

Ｃｏｖａｌｅｎｔ

ｃｏｕｐｌｉｎｇ

ｏｆ

ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕＩｉｎ

Ｇ

ｔｏ

ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ

ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ

ａｓ

ａ

ｍｅｔｈｏｄ

ｆｏｒ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ

ｔｈｅ

ｉｎｔｅｒｒａｃｉａｌ

ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ

ｌａｙｅｒ

ｏｆ

ａ

ｓｕｒｆａｃｅ

ｐｌａｓｍｏｎ

ｒｅｓｏｎａｎｃｅ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ．Ｂｉ０８。“ｓｏ’５

４９

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｃｃｔｒｏｎｉｃｓ，１９９８，１３（１１）：１２１３－１２２５

【８４］Ｓｈｒｉｖｅｒ

Ｌａｋｅ

Ｌ

Ｃ，Ｄｏｎｎｅｒ

Ｂ，Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ

Ｒ，ｅｔ

ａ１．Ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｕｓｉｎｇ

ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ

ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒｓＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１９９７，１２（１１）：１１０１．１１０６

［８５］Ｗｉｌｌｌｉａｍｓ

Ｒ

Ａ，Ｂｌａｎｃｈ

Ｈ

Ｗ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ

ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ

ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｎｏｌｙｅｒｓ

ｆｏｒ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ

ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１

９９４，９（３－４）：１

５９—１

６７

［８６］Ｎｇｅｂ—Ｎｇｗａｉｎｂｉ

Ｊ，Ｆｏｌｅｙ

Ｐ

Ｈ，Ｋｕａｎ

Ｓ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．Ｐａｒａｔｈｉｏｎ

ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ

ｏｎ

ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ

ｃｒｙｓｔａｌｓ

Ｊ

Ａｍ

Ｃｈｅｍ

Ｓｏｃ，１９８６，１０８０８）：５４４４—５４４７

【８７］Ｏｗａｋｕ

Ｋ

Ｇ

Ｍａｓａｈｉｒｏ

ｌ，Ｙｏｓｈｉｈｉｔｏ

Ａ

Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ

Ａ

Ｌａｎｇｒｎｕｉｒ－Ｂｌｏｄｇｅｔｔ

ｆｉｌｍ

ｆｏｒ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｉｔｓ

ｕｓｅ

ｉｎ

ｏｐｔｉｃａｌ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ

Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，１９９５，

６７：１６１３．１６１６

【８８］Ｔｕｒｉｅｌ

Ｅ，Ｆｅｍａｎｄｅｚ

Ｒ

Ｏｒｉｅｎｔａｔｅｄ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｆｏｒ

ａｔｒａｚｉｎｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

ｂｙ

ａ

ｆｌｏｗ—ｔｈｒｏｕｇｈ

ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ．Ｆｒｅｓ

ＪＡｎａｌ

Ｃｈｅｍ，１９９９，３６５（８）：６５８－６６２

［８９］Ｔｉｎｓｌｅｙ—Ｂｏｗｎ

Ａ

Ｍ．Ｔｕｎｉｎｇ

ｔｈｅ

ｐｏｒｅ

ｓｉｚｅ

ａｎｄ

ｓｕｒｆａｃｅ

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ

ｏｆ

ｐｏｒｏｕｓ

ｓｉｌｉｃｏｎ

ｆｏｒ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｐｈｙｓ

Ｓｔａｔ

Ｓｏｌ，２０００，１

８２（４）：５４７—５３

［９０］Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ

Ｋ，Ａｎｄｒｅａｓ

Ｈ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ

Ｓ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

Ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ

ｔｈｅ

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓＢａｓｅｄ

ｏｎ

ｐＨ

Ｓｈｉｆｔ—Ｉｎｄｕｃｅｄ

Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ

ｏｆ

Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ—Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

Ｐｏｌｙｍｅｒ

Ｆｉｌｍｓ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，２００２，７４（２）：３５５—３６１

［９１］Ｒｏｂｅｒｔ

Ｍ，Ｊｏｈａｎｎｅｓ

Ｆ，ｅｔ

ａ１．Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ

Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｎｇ

ａｓａ

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ

ｆｏｒ

ｔｈｅ

Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

ｏｆＭｉｃｒｏａｒｒａｙｓ

ｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ

Ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ－Ｓｉｚｅｄ

Ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｓｐｏｔｓ

Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，

２００１，７３（１０）：２１８３－２１８９

【９２］ｌｔａｍｅｒⅥＲｏｎ

Ｂ，Ａｒｉｅ

Ｄ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆＰｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ

Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ

Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ

Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ

ａｓＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＡｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｌｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ．ＪＡｍＣｈｅｍ

Ｓｏｃ，１９９４，１１６（２０）：

９３６５—９３６６

［９３］Ｂｌｏｎｄｅｒ

Ｒ，Ｌｅｖｉ

Ｓ，Ｔａｏ

Ｇ

Ｉ，ｅｔ

ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｏｆ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ａｎｄ

Ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ

Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ

ｌｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ

Ｕｓｉｎｇ

Ａｎｔｉｇｅｎ

ａｎｄ

ＰｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅＭｏｎｏｌａｙｅｒＥｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，１９９７，１１９（４３）：１０４６７－１０４７８

［９４］Ｆｅｒｎｆｉｎｄｅｚ－Ｓｇｎｃｈｅｚ

Ｃ，Ｃｏｓｔａ－ＧａｒｃｉａＡ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ

ｅｎｚｙｍｅ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ

ｏｎ

ａ

ｒｅｎｅｗａｂｌｅ

ｃａｒｂｏｎ

ｐａｓｔｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｓｕｐｐｏｒｔ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ

Ｃｈｉｍｉｃａ

Ａｃｔａ，

１９９９，４０２：１１９－１２７

［９５］Ｚｈｏｕ

Ｙ

Ｍ（周Ⅱ明），Ｈｕ

Ｓ

Ｑ（胡舜钦），Ｃａｏ

ｚ

ｘ（曹梓祥），ｅｔ

ａｌ，Ａｎ

Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ

Ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ａｎ

Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ

Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ

Ｃａｒｂｏｎ—Ｐａｒａｆｆｉｎ

Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｆｏｒ

Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ

ＩＩＩ（Ｃ３）ａｓｓａｙ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄ

Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２００３，１８（４）：４７３＿４８１

５０

【９６］Ｗａｎｇ

Ｊ，Ａｂｄｅｌ—Ｎａｓｓｅｒ

Ｋ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ

ｂｅａｄ—ｂａｓｅｄ

Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ

Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆＤＮＡ

ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅＡｎａｌｙｓｔ，２００１，１２６（１１）：２０２０—２０２４

【９７１Ｌｉ

ｘ，Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ

ｚ．Ａ

ｆｉｂｅｒ

ｏｐｔｉｃ

ｓｅｎｓｏｒ

ｆｏｒ

ｒａｐｉｄ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｂｉｌｉｒｕｂｉｎ

ｉｎ

ｓｅｒｕｍ．Ａｎａｌ

Ｃｈｉｍ

Ａｃｔａ，１９９７，３５３：２６３－２７３

［９８］Ｚｈａｎｇ

ｗ’Ｃｈａｎｇ

Ｈ

Ｄｕａｌ—ｅｎｚｙｍｅ

ｆｉｂｅｒ

ｏｐｔｉｃ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒ

ｐｙｒｕｖａｔｅ．Ａｎａｌ

Ｃｈｉｍ

Ａｃｔａ，

１９９７，３５０：５９—６５

［９９］Ｃｏｒｄｅｋ

Ｊ，Ｗａｎｇ

Ｘ．Ｄｉｒｅｃｔ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ

ｏｎ

ｏｐｔｉｃ

ｆｉｂｅｒ

ｐｒｏｂｅｓｆｏｒ

ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｇｌｕｔａｍａｔｅ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９９，７１：１５２９—１５３３

【１００］Ｃｈｅｎ

Ｘ

Ｈ，Ｒｕａｎ

ＣＭ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｔｈｅｄｉｒｅｃｔ

ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｆｅｒ

ａｎｄ

ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｌｙｓｉｓ

ｏｆｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ

ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ｉｎＤＮＡ

ｆｉｌｍ

ａｔ

ｐｙｒｏｌｙｔｉｃ

ｇｒａｐｈｉｔｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．

ＡｎａｌＣｈｉｍ

Ａｃｔａ，２０００，４１２：８９－９８

【１０１］Ｙａｂｕｋｉ

Ｓ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ

Ｆ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ

ｐｅｒｏｘｉｄｅ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｂａｓｅｄ

ｏｎ

ａ

ｇｌａｓｓｙ

ｃａｒｂｏｎ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｃｏｖｅｒｅｄ

ｗｉｔｈ

ｐｏｌｙｉｏｎ

ｃｏｍｐｌｅｘ

ｍｅｍｂｒａｎｃｅ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ａｎｄ

ｍｅｄｉａｔｏＬＳｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒ，２０００．６５：４９—５１

［１０２］Ｓｕｎ

Ｊ

Ｊ，Ｆａｎｇ

Ｈ

Ｑ，Ｃｈｅｎ

Ｈ

Ｙ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ

ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ｏｎａ

ｓｌｅｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ

ｍｏｎｏｌａｙｅｒ

ｍｏｄｉｆｉｅｄ

ｇｏｌｄ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ

ｆｏｒｔｈｅ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎ

ｐｅｒｏｘｉｄｅ．

Ａｎａｌｙｓｔ，１９９８，１２３：１３６５·１３６６

【１０３］Ｔｉａｎ

Ｆ

Ｍ，Ｘｕ

Ｂ，Ｚｈｕ

Ｌ

Ｄ，ｅｔ

ａｌ

Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ

ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ

ｗｉｔｈ

ｅｎｚｙｍｅ

ｅｎｔｒａｐｐｅｄ

ｗｉｔｈｉｎ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｓｉｔｅｄ

ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ

ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｍｅｄｉａｔｅｄ

ｓｏｌ—ｇｅｌ

ｄｅｒｉｖｅｄ

ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ

ｃａｒｂｏｎ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．Ａｎａｌ

Ｃｈｉｍ

Ａｃｔａ，２００１，４４３：９＿１６

［１０４］Ｑｉａｎ

Ｊ

Ｈ．Ｌｉｕ

Ｙ

Ｃ，Ｌｉｕ

Ｈ

Ｙ’ｅｔ

ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ

ｓｉｌｋ

ｆｉｂｒｏｉｎ

ｍｅｍｂｒａｎｃｅ

ｆｏｒ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ

ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ

ａｎｄ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

ｏｆ

ａｎ

ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｈｙｄｒｏｇｅｎ

ｐｅｒｏｘｉｄｅ

ｓｅｎｓｏｒ

ｅｍｐｌｏｙｉｎｇｐｈｅｎａｚｉｎｅ

ｍｅｔｈｏｓｕｌｐｈａｔｅ

ａｓ

ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｈｕｔｔｌｅ．Ｊ

Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，１９９５，３９７：１５７一１６２

［１０５］Ｂｏｓｓｕｙｔ

Ｘ，Ｂｏｇａｃｒｔｓ

Ａ，Ｓｃｈｉｅｔｔｅｋａｔｔｅ

Ｇ

ｅｔ

ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｐａｒａｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｂｙ

ｃａｐｉｌｌａｒｙ

ｉｍｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎ，ＣｌｉｎＣｈｅｍ，１

９９８，４４：７６０＿７６４

［１０６１苏萍，王永成涨新祥等．雌二醇的水凝胶毛细管电泳免疫分析．高等学校化学学

报，２０００，６：８７０－８７２

［１０７］Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ

Ｒ，Ｃｏｌｌｅｙ

Ｄ

Ｇ．Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ

ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｒｅｓｅａｒｃｈ

ｔｏ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ－

ＰａｒａｓｉｔｏｌＴｏｄａｙ，１

９９８，１４：９９－１０４

［１０８］Ｂｌｏｎｄｅ

Ｒ

Ｌｅｖｉ

Ｓ，Ｔａｏ

Ｇ

Ｌ，ｅｔ

ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｏｆ

ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ａｎｄ

ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ

ａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ

ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ

ｕｓｉｎｇ

ａｎｔｉｇｅｎ

ａｎｄ

｛ｌ

ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ

ａｎｔｉｇｅｎｍｏｌｏｌａｙｅｒ．ＪＡｍ

Ｃｈｅｍ

Ｓｏｃ，１９９７．１１９：１０４６７—１０６７８

【１０９】Ａｓａｎｄａｎｄｒｅｕ

Ｍ，Ｃ６ｓｐｅｄｅｓ

Ｆ’Ａｌｅｇｒｅｔ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ

ｉｍｍｕｎｏｅｎｓｅｒｓｂａｓｅｄ

Ｏｎ

ｒｉｇｉｄ

ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ

ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，１９９７，６９：２０８０—２０８５

［１

１

０］Ｓ０１６

Ｓ，Ａｌｅｇｒｅｔ

Ｓ，Ｃ６ｓｐｅｄｅｓ

Ｆ，ｅｔ

ａ１．Ｆｌｏｗ

ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

ｉｍｍｕｎｏａｎｌａｙｓｉｓ

ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｉｎａｇｎｅｔｏｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｅｒ

ｓｙｓｔｅｍ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９８，７０：１４６２—１４６７

［１

１

１］Ｙａｎ

Ｘ

Ｌ，ＫｈｏｒＥ，Ｌｉｍ

Ｌ

Ｙ，ｅｔ

ａｌ，ＰＥＣｆｉｌｍｓ

ｐｒｅｐａｒｅｄ

ｆｒｏｍ

ｃｈｉｔｏｓａｎ—ａｌｇｉｎａｔｅ

ｃｏａｃｅｒｖａｔｅｓ

Ｃｈｅｍ

Ｐｈａｒｍ

Ｂｕｌｌ，２０００，４８（７）：９４

１－９４６

［１１２］Ｋｉｍ

Ｓ

Ｇ

ＬｉｍＧ

Ｔ，Ｊｏｎｇｇｅｏｎ

Ｊ，ｅｔ

ａｌ

Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ

ｏｆＭＴＢＥ（ｍｅｔｈｙｌ

ｔ－ｂｕｔｙｌｅｔｈｅｒ）ａｎｄ

ｍｅｔｈａｎｏｌｍｉｘｔｕｒｅｓ

ｔｈｒｏｕｇｈ

ｐｏｌｙｉｏｎ

ｃｏｍｐｌｅｘ

ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ

ｍｅｍｂｅｒａｍｅｓ

ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ

ｏｆｓｏｄｉｕｍ

ａｌｇｉｎａｔｅ／ｃｈｉｔｏｓａｎ

Ｊ

Ｍｅｍｂｒ

Ｓｃｉ，２０００，１

７４：１－７

［１

１３］Ｂｒａｕｅｒ．“Ｐｒｅｐ

Ｉｎｏｒｇ

Ｃｈｅｍ”：Ａｃａｄａｍｉｃ

ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ

Ｙｏｒｋ１

Ａｕｆｌ，Ｓ，１９６５，４９２－５０５

［１

ｌ

４】ｗｕ

ｚ

Ｙ（吴朝阳），Ｙａｈ

ＹＨ

Ｃ颜永红），Ｓｈｅｎ

Ｇ

Ｌ（沈匡『励），ｅｔ

ａｌ，Ａｎｏｖｅｌ

ａｐｐｒｏａｃｈ

ｏｆ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｎ—ｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ

ｐｌａｓｍａ－ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ

ｆｉｌｍｓｆｏｒ

ｓｅｎｓｏＬ

Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ

Ａｃｔａ，２０００，４１

２：２９－３５

【１

１５］Ｖｏｌｐｅ

Ｇ

Ｃｏｍｐａｇｎｏｎｅ

Ｄ，Ｄｒａｉｓｃｉ

Ｒ，ｅｔ

ａ１．３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ

ａｓ

ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｕｂｓｔｒａｔｅ

ｆｏｒ

ｈｅｒｐｒｏｘｉｄａｓｅ

ｂａｓｅｄ

ｅｎｚｙｍｅ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ａ

ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ

ｓｔｕｄｙ．Ａｎａｌｙｓｔ，１９９８，１２３：１３０３－１３０９

［１

１６】Ｚｈａｎｇ

Ｓ

Ｓ（张书圣），Ｊｉａｏ

Ｋ（焦奎），Ｃｈｅｎ

Ｈ

Ｙ（陈洪渊）．ＰＡＰ—Ｈ２０２一ＨＲＰ伏安酶联

免疫分析新体系测定人ｍ清总甲状腺素．高等学校化学学报，１９９９，６：８８１．８８３

【１１７］Ｚｈａｎｇ

Ｓ

Ｓ（张节圣），Ｊｉａｏ

Ｋ（焦奎），ＣｈｅｎＨＹ（陈洪渊）．以邻氨基酚为底物的伏安

酶联免疫分析体系酶促反应的研究．Ｓｃｉｅｎｃｅ

ｉｎ

Ｃｈｉｎａ（Ｓｅｒｉｅｓ

Ｂ），１９９９，２７（１）：８３—９０

［１

１８］ＴＩｊｓｓｅｎ

ＲＰｒａｃｔｉｃｅ

ａｎｄ

ｔｈｅｏｒｙ

ｏｆｅｎｚｙｍｅ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．８ｔｈ

Ｅｄｉｔ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ

Ｙｏｒｋ，

１９８５

［１１９］Ｋｅｓｓｌｅｒ

Ｃ

Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ

ｌａｂｅｌｉｎｇ

ａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆ

ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，

Ｎｅｗ

Ｙｏｒｋ，１９９２

［１２０］Ｅｍｍａｎｕｅｌ

Ｔ，Ｊａｍｅｓ

ＲＤ．Ｐｒｏｔｅｉｎ

ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ

ｏｎ

ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ

Ｔｉ０２

ｆｉｌｍｓ：ａｎ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ

ｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒ

ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ

ｄｅｖｉｃｅｓ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９８，７０：５１１１－５１１３

【１２１］Ｅｍｍａｎｕｅｌ

Ｔ，Ａｎｔｈｏｎｙ

Ｅ

Ｇ

Ｃ，Ｂｒｉａｎ

Ｏ’Ｒｅｇａｎ，ｅｔ

ａ１．１ｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ

ｏｆ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｏｎ

ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ

Ｔｉ０２

ａｎｄＺｎＯ

ｆｉｌｍｓ．ＪＥｌｅｃｔｒｏａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，

２００１．５１７：２０．２７

［１２２］Ｔａｔｓｕｍａ

ｒ

Ｏｋａｗａ

Ｋ

Ｗａｔａｎａｂｅ

ｆ

Ｅｎｚｙｍｅ

ｍｏｎｏｌａｙｅｒ－ａｎｄｂｉｌａｙｅｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ

ｔｉｎ

。ｘｉｄｅ

ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ

ｆｏｒ

ｔｈｅ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ

ａｎｄ

ｇｌｕｃｏｓｅ．Ａｎａｌ

Ｃｈｅｍ，

Ｓ，