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2024年6月28日发(作者：标量结构体)
第29卷 第12期
2023年12月
河 北 医 学
HEBEIMEDICINE
Vol.29,No.12
Dec.,2023
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31.
【文章编号】
1006
-
6233(2023)12
-
1962
-
06
NLRC3参与的肿瘤免疫机制在子宫内膜异位症发病中的作用
郝梦启, 姬佩雲, 高秀娟, 庄新荣, 张桂香, 张雅丽
(承德医学院附属医院妇科, 河北 承德 067000)
【摘 要】
目的:探索Ⅲ期、Ⅳ期子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)患者卵巢异位内膜组织中核
苷酸结合寡聚结构域样受体家族胱天蛋白酶募集结构域蛋白3(NLRC3)的表达及其与临床病理特征的
关系。方法:免疫组化、Western
Blot、qRT
-
PCR方法检测17例Ⅲ期、17例Ⅳ期卵巢异位内膜组织和17
例正常子宫内膜组织中NLRC3的表达,分析NLRC3与EMT患者临床病理特征之间的关系。结果:与
正常子宫内膜组织相比,Ⅲ期、Ⅳ期异位子宫内膜组织中NLRC3表达水平均降低(P<0.05),而NLRC3
的表达在Ⅲ期、Ⅳ期子宫内膜异位症患者中差异无统计学意义(P>0.05)。CA125水平高者NLRC3蛋
白表达阳性率更低(P<0.05)。不同年龄、不同病灶大小、不同痛经程度EMT患者的NLRC3表达差异
无统计学意义(P>0.05)。结论:EMT的发病与腹腔微环境免疫失衡有关,NLRC3发挥的免疫监视功能
下降或缺失可能参与EMT的发生发展。联合检测CA125和NLRC3的表达可能为预测或诊断EMT发
挥良好的作用。
【关键词】 子宫内膜异位症; NLRC3; 免疫监视; CA125
【文献标识码】 A 【doi】10.3969/.1006
-
6233.2023.12.06
TheRoleofNLRC3intheTumorImmuneMechanism
InvolvedinthePathogenesisofEndometriosis
stageIIIandIVendometriosis
(EMT)
-
ods:
Immunohistochemistry,WesternBlot,andqRT
-
PCRwereusedtodetecttheexpressionofNLRC3in17
(Affiliated
HospitalofChengdeMedicalUniversity,HebeiChengde
067000,
China)
【Abstract】Objective:
ToexploretheexpressionofNucleotide
-
bindingOligomerizationDomain
(NOD)
-
likereceptorfamilyCARDdomain
-
containingprotein3
(NLRC3)
inovarianectopicendometrialtissuesof
HAOMengqi,JIPeiyun,GAOXiujuan,etal
casesofstageIII,17casesofstageIVovarianectopicendometrialtissues,and17casesofnormalendometrial
ationshipbetw-
【基金项目】河北省2020年度医学科学研究课题计划,(编号:20200393)
1962
【通讯作者】张雅丽
第29卷 第12期
2023年12月
河 北 医 学
HEBEIMEDICINE
Vol.29,No.12
Dec.,2023
sults:
Comparedwithnormalendometrialtissues,theexpressionlevelofNLRC3wasdecreasedinstageIII
andstageIVectopicendometrialtissues
(P<0.05),
whiletherewasnostatisticallysignificantdifferencein
NLRC3expressionbetweenstageIIIandstageIVendometriosispatients
(P>0.05).
ThepositiverateofNL-
RC3proteinexpressionwaslowerinpatientswithhigherCA125levels
(P<0.05).
Therewasnostatistically
significantdifferenceinNLRC3expressionamongEMTpatientsofdifferentages,lesionsizes,anddegreesof
peritonealmicroenvironment,andthedecreasedorlostimmunesurveillancefunctionofNLRC3maybein-
dysmenorrhea
(P>0.05).Conclusion:
ThepathogenesisofEMTisassociatedwithimmuneimbalanceinthe
bineddetectionofCA125andNLRC3expression
mayplayasignificantroleinpredictingordiagnosingEMT.
【Key
words】 Endometriosis; NLRC3; Immune
surveillance; CA125
购于北京Solarbio科技有限公司。NLRC3蛋白抗体购
于美国NOVUS生物技术公司。GAPDH抗体及山羊
抗兔荧光二抗来自于ABclonal生物公司。免疫组化
试剂盒和DAB显色剂来自于北京中杉金桥生物技术
公司。
1.3 方 法
1.3.1 免疫组化:所取组织经石蜡固定包埋,柠檬酸
盐(pH
=
6.0)修复液进行抗原修复,内源性过氧化物
酶阻断剂孵育10min,封闭用山羊血清工作液进行封
37℃孵箱复温45min,二抗孵育20min,显色剂显色,苏
1.3.2 Western
Blot:高效RIPA裂解液提取组织获得
子宫内膜异位症是慢性炎症性良性妇科疾病,具
有恶性肿瘤的特点,且EMT患者罹患癌症风险较
高
[1]
。目前人们对这种疾病的病因解释不明确,免疫
失衡现被提出以解释异位子宫内膜组织的起源
[2]
。
NLRC3是先天免疫细胞炎症信号通路的负调控因子,
发挥免疫监视作用,参与自身免疫调节及肿瘤的发生
本研究通过比较Ⅲ期、Ⅳ期EMT患者卵巢异位内膜组
织和正常子宫内膜组织中NLRC3的表达水平,进一步
讨论其在EMT发生发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料:收集承德医学院附属医院2020年12
月至2022年4月进行手术的卵巢子宫内膜异位症患
者。纳入标准:患者经组织病理学诊断为卵巢EMT,
年龄26~48岁。排除标准:经性激素类药物治疗的患
者,患有自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、急慢性炎
症、恶性肿瘤的患者。EMT患者按照美国生殖医学学
会(American
SocietyforReproductiveMedicine,ASRM)
发展。目前NLRC3在EMT患者中的表达研究较少。
闭,37℃孵育20min,一抗(浓度为1∶50)孵育过夜,
木素复染1min,1%盐酸酒精分化30s,树胶封片。
80V20min,分离胶电泳110V,按marker和loading
总蛋白,用BCA法对总蛋白进行定量检测,取等量蛋
白进行SDA
-
PAGE,分离胶浓度(10%),浓缩胶电泳
buffer位置停止电泳。300mA恒流转膜2.5h。5%脱
脂奶粉封闭1h,加入NLRC3抗体(1∶100),4℃冰箱
孵育过夜,加入二抗,室温孵育1h(GAPDH抗体,1∶关于子宫内膜异位症的分期(rASRM分期)分为:Ⅲ
期17例,年龄24~45岁,平均(35.4±6.2)岁;Ⅳ期17
例,年龄26~48岁,平均(36.2±6.4)岁。痛经NRA评
分标准:0分:无痛经;1~3分:轻微痛经;4~6分:严重
痛经,尚能忍受;7~10分:严重痛经,需口服止痛药物。
同时收集17例因异常子宫出血行诊断性刮宫或因子
宫肌瘤行子宫切除患者的子宫内膜作为对照组,经组
织病理学诊断为正常子宫内膜组织,年龄25~42岁,
平均(33.7±4.8)岁。三组间年龄差异无统计学意义
(P>0.05)。收集的组织一部分置入4%多聚甲醛固
1.2 主要试剂:SuPerbrilliant
6min高纯RNA提取试
5000)。使用扫描仪扫描目的条带。
1.3.3 qRT
-
PCR:采用SuPerbrilliant
6min高纯RNA
提取试剂盒提取组织中的RNA。在Nanodrop
RNA定
量测定仪中检测样品的OD值,要求1.8≤A260/A280
≤2.0且1.8≤A260/A230≤2.3,间接计算出样品中
RNA含量以进行下一步实验。根据Fastking一步法除
42℃2min,95℃3min。SupperRead荧光定量预混试剂
基因组cDNA第一链合成预混试剂盒进行操作,条件:
按照说明进行PCR反应,反应体系:20μL。条件:95℃
定,剩余组织用0.9%生理盐水冲洗后置入液氮中。
剂盒购于中实基因科技有限公司。FastKing
cDNA第
一链合成试剂盒、SuperReal
PreMixPlus试剂盒均购于
10min预变性,95℃15s,60℃1min,72℃30s进行45
个循环。β
-
actin作为内参,测量每个样品的CT值,
每个样品设置3个复孔,记录并统计获得的结果,计算
目的基因在各组组织中相对于内参的表达量Q。Q
=
天根生物科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒
2
-
ΔΔCT
,△Ct目的基因
=
Ct目的基因
-
Ctβ
-
actin基因,
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△△Ct
=
△Ct
-
Ctmean值(对照组平均值)。各引物序
列如下:
β
-
actinF:5ˊ
-
CACCATTGGCAATGAGCGGTTC
-
3ˊ
多组比较以P<0.05为差异有统计学意义,两两比较
以P<0.0125为差异有统计学意义。GraphPad
2 结 果
Prism8.0软件绘制统计图。
R:5ˊ
-
AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
-
3ˊ
NLRC3F:5ˊ
-
TGGCAGTGAGAGAAAACCGCAC
-
3ˊ
1.3.4 免疫组化结果判读:由经验丰富的病理科医师
采用双盲法对染色结果阅片。NLRC3表达的评分标
准:每张切片随机观察5个高倍视野(
×
400),根据阳
性细胞着色强度及染色面积进行评分。着色强度:无
染色0分,浅黄色1分,棕黄2分,棕褐色3分。着色
面积:<30%评1分,30%~60%评2分,>60%评3分。
两项相加结果:0分为阴性(
-
),1~2分为弱阳性(±),
阳性均视为阴性,阳性及强阳性均视为阳性进行组间
比较。
1.4 统计学处理:采用SPSS26.0软件进行统计学分
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