胰腺癌中GRP78表达及其对预后的影响

临床与实验病理学杂志

J

Clin

Exp

Pathol

2020

Dcc

；

36(

12

)

-

1393

-

网络出版时间

：

2020

-12

-39

12

：

22

网络出版地址

：

htths

:

//Cns.

cndi.

net/cms//etail/39.

1073.

R.

20201229.

1256.

002

ht/l

胰腺癌中

GRP77

表达及其对预后的影响

沈珊珊

2

蒋廷页

2

,

杨天宇

2

钮

慧

2

张永胜

2

曹志飞

2

蔡为民

2

摘要

：

目的

探讨

GRP78

在胰腺癌组织中的表达及临床意义

。

方法

采用免疫组化

EnVRRn

法检测胰腺癌组织及相应癌旁

正常导管上皮中

GRP78

蛋白的表达

，

分析

GRP78

表达与胰腺癌临床病理特征的关系

。

利用

GEPIA

在线数据库(包括

TCGA

和

GTE

p

RNA

测序表达数据)分析胰腺癌中

GRP78

mRNA

的表达

。

利用

qRT-PCR

检测

20

对新鲜冷冻胰腺癌组织和癌旁正常

组织中

GRP78mRNA

的表达

。

结果

GRP78

蛋白在胰腺癌组织中的阳性率显著高于癌旁正常导管上皮

(

P=0.007

)

。胰腺

癌中

GRP78

蛋白表达水平与肿瘤大小

(

P

=

0.

036

)

、

分化程度(

P

=

0.

012

)

、

T

分期

(P=0.

017

)

显著相关

。

GRP78

蛋白高表达

是胰腺癌患者的不良预后因素

(

P

=0.010)

。

GEPIA

分析结果表明

，

胰腺癌组织中

GRP78

mRNA

表达水平显著高于癌旁正常

组织

(

P<0.05)

。

qRT-PCR

实验证实

GRP78mRNA

在胰腺癌组织中高表达

(

P<0.05)

。

结论

GRP78

蛋白在胰腺癌组织中

高表达

，

且与肿瘤进展密切相关,可能成为胰腺癌治疗的潜在靶点

。

关键词:

胰腺肿瘤

;GRP78

；

预后;免疫组织化学

中图分类号

：

R

735.9

文献标志码

：

A

文章编号

：1001

-7399(2020)12

-1393

-04

enn

:

20c29925/cccncnccccspc2020c22c002

胰腺癌是预后较差的恶性肿瘤之一

,5

年生存

率为

5%

~8%,

其发生

、

发展在分子水平上具有高

度的异质性

^

*

9

。

随着分子生物学技术的迅速发

例,相应癌旁组织

82

例,每例有

2

个组织块

。

所有

患者在术前均未接受过放

、

化疗或生物学治疗

,

且对

参与的研究均知情同意

。

在手术标本中随机挑选

20

例新鲜胰腺癌组织及其对应癌旁正常胰腺组织

展,学者们对胰腺癌的基因特点有了更深入的认识,

但缺乏早期发现和有效干预仍然是胰腺癌患者预后

-129

C

液氮保存

，

用于

qRT-PCR

检测

。

差和生存率低下的主要原因⑶

。

GRP78

是一种普

1.4

免疫组化

石蜡标本

4

i

m

厚切片

，

免疫组化

染色采用

EnVRRn

法

，

DAB

显色

。

GRP78

(

多克隆

遍表达于内质网的伴侣蛋白

，

已有多项研究表明其

在胃癌

、

肝细胞肝癌

、

乳腺癌等多种恶性肿瘤中过度

表达

,

并且与患者预后不良有关

,

其机制可能与促进

抗体

，

兔抗

，

克隆号

：

ab32618

)

购自

Abeam

公司

。

GRP78

阳性定位于细胞质

。

按细胞着色强度计分:

细胞增殖

、

侵袭和转移以及抑制肿瘤细胞凋亡有

关

WT

。

目前

,GRP78

在胰腺癌中表达的相关报道

较少⑷

。

本文旨在探讨

GRP78

在胰腺癌中的表达

无阳性着色为

0

分

，

浅黄色为

2

分

，

棕黄色为

9

分,

棕褐色为

3

分;按阳性细胞所占百分比计分:阳性细

胞数

<5%

为

0

分

,6%

~25%

为

2

分

,26%

~55%

为

2

分

,52%

~75%

为

3

分

，

>75%

为

4

分

。

两项计分

及预后意义

，

为探索新的诊断生物标志物和治疗靶

点提供思路

。

结果相乘作为最终结果

：

~4

分为低表达

，

M5

分为

高表达

。

1

材料与方法

1.1材料

胰腺癌组织芯片

(

HPan-Adel82Sur-02

)

1.3

GEPIA

数据库分析

采用

GEPIA

数据库(

h/

tp

：

//gepm.

cancer-pku.

cn/)

对

GRP78

mRNA

在

271

购自上海芯超公司

。

组织芯片含有胰腺癌组织

120

例正常胰腺组织与

277

例胰腺癌组织中的表达进行

分析

。

1.4

qRT-PCR

采用

TRIZOL

试剂盒提取胰腺癌

接受日期

：

2222

-

12

-29

基金项目:江苏省卫生健康委医学科研项目

(

H2219271

)

、

苏州市科

技发展计划应用基础研究项目

(

SYS221727

)

和癌旁正常组织总

RNA,

并逆转录成

cDNA

o

利用

qRT-PCR

检测

GRP78

基因的表达

。

GRP78

引物序

作者单位/苏州大学附属第二医院病理科

，苏州

018522

9

江苏省常熟市第一人民医院病理科

，

常熟

018502

歹列:上游

5'-TGTTCAACCAATTATCAGCAAACTC-3'

；

下游

5

,

-3TCTGCTGTATCCTCTTCACCAGT-3

z

-

0-ac-

tin

引

物序列

：

上游

5'-CACCATTGGCAATGAGCGGT

TCCP

；

下游

5

^GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3

；

-

PCR

反应条件

：

95

C

5

min

、

95

C

12

s

、

63

C

39

s

,

作者简介:沈珊珊

，

女

，

医师

。

E-maiI

:

fOzsUlsUex@

129.

com

蔡为民

，

男

，

副主任医师

，

通讯作者

。

E-maii

：

594778473@

qq.

com

-

1894

-

临床与实验病理学杂志

J

Clin

Exp

P

i

O

o

C

2020

Dcc

；

36(12

)

合计

44

个循环

,

PCR

反应结束后分析溶解曲线

，

每

个组织样本设

3

个复孔

，

按照

2

"

AA

Ct

计算基因的相

对表达量

。

1.5

统计学分析

所有数据应用

SPSS

24.

0

软件

进行统计学分析

。

计数资料率的比较采用

X

检验

。

Cox

回归模型进行单因素及多因素分析

。

Kaplan-

Meica

法绘制生存曲线

,LocAann

法比较组间生存差

异

。

应用

Prism

7.

0

软件绘制生存曲线

。

以

P

<

0.

05

为差异有统计学意义

。

2

结果

2.

4

临床特征

80

例胰腺癌中男性

63

例

，

女性

37

例

。

患者年龄

34

〜

85

岁

，

中位年龄

62

岁

。

肿瘤

直径

W

4

cm

者

62

例

、

>

4cni

者

39

例

。

肿瘤位于胰

头

62

例

、

胰体尾

37

例

。

组织类型:导管腺癌

92

例

、

腺鳞癌

6

例

、

黏液腺癌

9

例

。

肿瘤病理分级:中分化

68

例

、

低分化

32

例

。

依据

2009

年美国癌症联合委

员会

(AJCC)

第

7

版胰腺癌分期

：

I

期

44

例

、

I

期

55

例

，

川

期

0

例

，

W

期

2

例

。

2.2

胰腺癌中

GRP78

的表达

GEPIA

数据库分

析:

CRP78

mRNA

在

127

例胰腺癌组织中的表达水

平显著高于

122

例癌旁正常组织

(

P<0.

05,

图

2

)

。

免疫组化检测

120

例胰腺癌组织中

GRP78

蛋白表

达结果显示

：

35

例

(

35

%

)

低表达

,

65

例

(

65

%

)

高表

达

；

GRP78

蛋白在癌旁正常导管上皮中

44

例低表

达

(55%

),36

例

(45%)

高表达

，

两组相比差异有显

著性

(P=0.

007,

图

2

)o

qRT-PCR

检测

20

对胰腺癌

组织和癌旁正常组织

，

结果显示

：

GRP78

mRNA

相

对表达量在胰腺癌组织中为

(208.

89

±

37.

32

)

%

,

在癌旁正常组织中为

(120.

00

±12.56)%,

差异有

统计学意义

(P<0.

05)

。

胰腺癌

癌旁组织

图

1

胰腺癌和癌旁组织中

GRP77

mRNA

的

表达

(

GEPIA

数据库)

图

2

GRP78

蛋白在胰腺癌组织和癌旁正常组织中的表达

,

EnVRRn

法:

A.

癌旁正常导管上皮(箭头)中

GRP78

蛋白低表达;

B.

胰腺癌组

织中

GRP78

蛋白高表达

2.3

胰腺癌中

GRP77

蛋白表达与临床病理特征的

关系

癌组织中

GRP78

蛋白表达上调与肿瘤直径

>4

cm(P=0.

036

)

、

分化程度低

(P

=

012

)

及较高

的

T

分期

(

P

=

0.

012

)

密切相关

，

与患者性别

、

年龄

、

肿瘤部位

、

N

分期及

AJCC

临床分期无明显相关性

(表

1)

。

表

1

胰腺癌中

GRP77

表达与临床病理特征的关系

临床病理参数

a

GRP78

低表达

高表达

X

值

P

值

性别

男

63

18

45

女

37

2

20

3.093

0.079

年龄(岁)

<60

47

18

29

三

60

53

236

0.424

0.515

分化程度

低

32

6

26

中

68

29

39

5.462

0.019

肿瘤直径

(cm

)

W

4

61

26

35

>4

39

9

30

4.374

0.036

肿瘤部位

胰头

62

24

33

胰体尾

33

11

27

0.987

0.320

T

分期

T1

+T2

78

32

44

T3

+T4

22

3

12

5.6550.012

N

分期

N0

54

20

34

N1

44

12

31

0.2140.644

AJCC

分期

I

40

223

I

~W

60

18

42

2

446

0.

129

2.4

预后分析

单因素分析结果显示

，

肿瘤分化程

度

、

N

分期

、

AJCC

分期及

CRP78

表达与胰腺癌患者

临床与实验病理学杂志

J

CCn

Exp

Pathol

2522

Dec

；

36(12

)

-

1795

-

预后相关

(P<5.55,

表

2)

。

多因素分析结果显示,

转录激活的必要成分

⑹

。

大量研究表明

，

GRP78

蛋

肿瘤分化程度是胰腺癌独立的预后因素

(

P

=

5.

555

,

表

3

)

。

生存分析显示

，

癌组织中

GRP78

蛋

白高表达可以促进癌细胞的增殖

、

存活

、

抗凋亡

、

免

疫逃逸

、

转移

、

血管生成和耐药⑼

。

相反

，

通过抗

GRP77

特异性抗体中和

GRP77

可以在体

、

内外抑制

白高表达组患者的总生存时间低于低表达组

(

P

=

5.

515,

图

3

)

。

肿瘤的生长和转移

3

］

。

因此,

GRP7

9

表达可以作为

肿瘤生物学行为和治疗反应的生物学标志物

，

以及

作为新疗法的潜在靶标

。

GRP7

7

蛋白作为内质网应激相关蛋白

，

其在多

种恶性肿瘤中表达上调

，

如胃癌

［

］

、

乳腺癌

［

］

、

前列

腺癌恶性黑色素瘤少

］

等

，

促进肿瘤细胞的增

图

6

胰腺癌组织中GRP78

蛋白高表达组与低表达组患者生存曲线

表

9

影响胰腺癌预后的单因素分析

因素

单因素分析

风险比

95%

C

P

值

性别

5.0

2

5.

5

。〜

1.92

5459

年龄

1.25

5.79

〜

1.9

9

5339

分化程度

1.97

1.22

〜

3.

19

5555

肿瘤大小

5.94

5.

52

〜

1.06

5479

肿瘤部位

1.12

5.77

〜

1.28

5634

T

分期

1951

5.

55

-1.78

5995

N

分期

2915

1.34

〜

3.

43

5551

AJCC

分期

2925

1.36

〜

3.

73

5552

癌组织

GRP7

9

表达

2951

1.21

-3.33

5515

癌旁

GRP7

8

表达

1955

5.59

〜

1.79

>5.999

表

6

影响胰腺癌预后的多因素分析

因素

多因素分析

风险比

95%

C

P

值

分化程度

2957

1.25

-3.22

5.055

N

分期

1974

5.06-3.525.

121

AJCC

分期

1945

〜

3.

11

5.343

癌组织

GRP7

表达

1952

5.

59

〜

2.

65

5.199

6

讨论

GRP79

也称为免疫球蛋白重链结合蛋白

(

im-

munonlonulin

hevyy

cegn

binninn

protein

in

pre

-5

cells

,

BiP

),

是一种分子伴侣

，

属于热休克蛋白

70

(heat

shock

protein

7

。

，

HSP75

)

家族

［

］

。

GRP77

蛋

白主要分布在内质网

，

参与蛋白质折叠和组装

，

以及

错误折叠蛋白质的蛋白酶体降解

［］

。

在实体肿瘤

中

，

缺氧

、

葡萄糖或营养缺乏

、

乳酸酸中毒等肿瘤微

环境触发内质网应激

。

GRP78

蛋白是内质网应激

殖

、

侵袭和转移

，

并且血清

GRP7

8

蛋白水平可以评

估乳腺癌的治疗效果和预测预后⑷

。

Nin

等⑷发

现

，

与邻近非肿瘤组织正常胰腺导管上皮细胞相比

,

GRP78

蛋白在胰腺癌细胞中表达更高

，

而且在肿瘤

组织中表达上调与较高的

T

分期和较短的总生存

期密切相关

。

本组通过

GEPIA

在线数据库和免疫

组化检测分析

GRP7

8

基因和蛋白的表达,数据显

示

：

与癌旁正常导管上皮细胞相比

，

GRP78

mRNA

和蛋白在胰腺癌组织中表达上调

。

此外

，

本组实验

发现

GRP77

蛋白上调与肿瘤直径

>4

cm

、

分化程度

低及较高的

T

分期显著相关

，

并且癌组织中

GRP77

蛋白高表达的患者总生存期较短

，

表明

GRP7

9

在胰

腺癌的进展中起着至关重要的作用

，

并可作为胰腺

癌患者早期有效诊断和术后预后评估的生物学标志

物

。

GRP78

在癌旁正常胰腺腺泡细胞中高表达

，

原

因可能是癌旁的腺泡细胞受到慢性炎症刺激

，

诱发

了内质网应激血

9

］

。

本实验也发现在癌旁胰腺腺泡

细胞中

GRP78

蛋白高表达的现象

。

GRP78

蛋白在恶性肿瘤进展中的主要作用是

促进肿瘤的增殖

、

侵袭和转移

。

研究表明

，

GRP78

通过提高

CychnD1

、

CDK4

和

CDK6

的表达促进胰腺

癌细胞的增殖⑷

。

CycnnD1

、

CDK4

和

CDK6

是控制

细胞增殖

G

1

期的关键蛋白

，

GRP7

9

可能通过改变

细胞周期来影响胰腺癌细胞的增殖⑷

。

GRP78

蛋

白过表达通过增加基质金属蛋白酶

(

mat-x

metai-

10-6X^380

,

MMP

)

的分泌和活性以及调节细胞骨架

的动力学来促进胰腺癌细胞的侵袭,

FAK

和

JNK

是

GRP7

诱导的胰腺癌细胞侵袭的关键下游信号传

导

。

一项体外研究表明

，

GRP78

通过诱导胰腺癌细

胞上皮-间质转化促进癌细胞的侵袭和转移酗

］

。

总之

，

本实验结果显示胰腺癌组织中

GRP7

8

基

因和蛋白表达水平上调

，

并且与较低的分化程度和

较高的

T

分期有关,提示患者预后不良

。

GRP79

蛋

白在胰腺癌进展中具有重要作用

，

其生物学机制仍

-

1797

-

临床与实验病理学杂志

J

Clin

Exp

Pathol

Dec

；

3

6(

12

)

需要进一步分析

，

可能提高胰腺癌患者的早期诊断

[9

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Zoni

E

,

Chen

L,

KarPampouny

S

,

et

ai

CRUTO

ag

its

sianaling

pa4ner

GRP78

Orive

the

metastatic

phenotype

in

human

osteotropic

prosUte

cancer[

J]

,

Oncwene,

2517,36(33)

：

4739

-

4749.

(1):109.

[4]

Raites

A

,

Lipovetzai

J

,

Lubin

I,

et

ai

GRP78

expression

in

pe-

[12

]

Shimizu

A

,

Kaira

K

,

YasuUa

M

,

et

ah

Clinical

ag

patholovicat

81

x

111X0^00

of

ER

stress

marPer

(

BiP/GRP78

ag PERK)

expres-

siou

in

malipnant

melanoma

[

J

]

.

Pathol

Oncol

Res

:

ZU

,23

(1

)

：

111

-116.

ripperat

blood

mononuclear

celts

is

a

new

predictive

maraer

for

the

benefit

of

taxanes

in

breastneoaPjuvant

treatment

[

J

].

BMC

Cancer,

2525,25(1)

：

333.

[5]

IbraPim

3

M

,

Abbelmaled

D

H

,

Elfiia

A

A.

GRP78

:

a

celt's

re

­

[13

]

Daner

P

,

Sharma

N

S

,

Gupta

VK

,

eh

ai

ER

s

—

ess

86X804

,

glu­

cose

repulatop

protein

78

(GR/73)

reaulates

redox

status

in

pan-

sponse

to

stress

[

J

].

Life

Sci

-

2519,226

:

199

-

163.

[6

]

Nin

Z

,

Wang

M

,

Zhou

L

,

et

ai

Elevated

GRP78

expression

is

as

­

creahc

cancer

theredp

maintaining

"

stemness

”

[

J

]

•

Celt

Death

Dis

,

2519

，

。

心)

：

192.

sociated

with

poor

provnosis

in

patienU

with

pancreatic

cancer[

J]

.

Si

Rep,

2515,5

：

16067.

[14

]

Yuan

X

P

,

Dong

M

,

Li

X

,

et

ai

GR/79

promotes

the

invasion

ot

pancreatic

cancer

celts

bp

FAK

anh

JNK

[

J

].

Mol

Celt

Biochem,

2519,363(1

-2)

：

55

-62.

[7

]

Podre

KF

R

,

Poet

G

J

,

Hepne4pot

L

M.

The

ennoplasmic

reticu

­

lum

(ER

)

08X64

—

)

BiP

is

a

master

regulator

ot

ER

functions

:

Getting

bp

with

a

little

help

from

EROj

frienUs[

J]

.

J

Biol

Chem,

2517,254(6)

：

2593

-2179.

Expression

of

GRP77

R

pancreatic

cancer

and

its

effects

on

prognosis

SHEN

Shap-sPap

1

,

JIANG

孑^)

2

,

YANG

Tme-ya

1

,

NIU

Hub

,

ZHANG

Yoxg-shexg

1

,

CAO

Zhi-feP

,

CA

【

WePmiu

5

(

1

Department

of

Pathology

,

the

Second

J^filiated

Hospital

of

Soochow

University

,

Suzhou

215004

,

China

；

2

Department

l

Patholofy

,

the

Firsi

People

，

s

Hospital

o

U

Chanashu

City

,

Chanashu

215550

,

China

)

To

iuvestigate

the

expression

and

ABSTRACT

Purpose

oh

GRP78

iu

the

paucreaho

caucer

tissues

was

sipnificanWy

cos-

related

with

Wmos

size

(

P

=

1. 336 )

,

diRerextiahox

(

P

=

1.

H

)

and

T-stage

(P

二

2.

317)

:

And

the

increased

expressiox

clinical

sipnificauce

of

GRP78

iu

paucreatic

eager.

Methods

Immuuohistochemistp

was

used

to

Oetect

GRP78

proteiu

expres-

siox

iu

paucreaho

caucer

tissues

anh

uormai

paucreaho

Ouct

oh

GRP78

iu

the

paucreaho

caucer

tissues

was

a

provuosticahy

aPverse

factor

(P

二

2.

H).

The

results

oh

GEPIA

database

a-

cefs

withiu

ahjacext

uox-tumor

tissues.

The

relahoaship

be-

tweex

GRP78

expressiox

auO

clinicopatholovic

features

oh

pau1

creatio

aPexocarciuoma

was

aglyzed.

Expression

oh

GRP79

mR1

ualysis

showed

that

the

expressiox

oh

GRP78

mRNA

iu

paucreat1

ic

caucer

tissues

was

sipnificagy

higher

than

that

iu

abjacext

uox-tumor

tissues

(

P

< 2.

35

)

.

The

qRT-PCR

confirmed

that

NA

iu

paucreaho

caucer

was

aualyzed

iu

the

GEPIA

oxbue

Oata-

base

(

iucluUing

TCGA

anh

GTEx

RNA

sequexcing

expression

GRP78

mRNA

was

highly

expressed

iu

paucreaho

caucer

tissues

(

P

<

2.

25

)

2

Conclusion

GRP78

proteiu

is

over-expressed

iu

Oata)

:

The

expression

oh

GRP78

iu

22

pairs

oh

fresh

frozex

pau1

creatio

caucer

tissues

anh

the

correspoxhing

ahjacext

tissues

paucreatic

caucer

tissues

,

and

is

closely

related

to

Wmor

ppw

gressiox.

GRP79

proteiu

map

be

a

potextiai

therapenWc

target

for

were

assessed

bp

qRT-PCR.

Results

The

positive

rate

oh

GRP78

proteiu

expressiox

iu

paucreaho

caucer

tissues

was

sip-

niPcautly

higher

than

that

oh

uormai

paucreaho

Ouct

cells

withiu

paucreatic

caucer.

Key

worps

：

paucreaho

ueopbsms

；

GRP78

;

immuuohistochem1

adjacent

uormai

paucreaho

tissues

(P

二

2.

327).

The

expressiox

istp

；

proauosis