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2024年12月29日发(作者：swift官方网站)
Western Blotting操作方法
1).Protein extraction
Extraction buffer:
Sucrose 0.7 M
Tris/HCl 0.5 M
EDTA 50 mM
KCl 0.1 M
配制成母液pH 9.4
-mercaptoethanol 2% (freshly added)
Protease Inhibitor 25× (freshly added)
注：Protease Inhibitor：使用罗氏Protease Inhibitor Cocktail Tablets，一片用于50ml工作液，所以一片
药片溶于2ml水中配成25×母液，4℃储存时，在水中可以稳定存放1-2周，-20℃可以存放12周。
取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中） ，
加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；
完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；
在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C
拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；
向两只EP管中各加入1 ml 0.1 M NH
4
Ac（用甲醇溶解配制）；
在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；
在13000 rpm转速下离心5 min， 4 °C；
用 0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；
在13000 rpm转速下离心5 min， 4 °C；
取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；
室温干燥蛋白（不能过度干燥）, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。
2). 测定总蛋白浓度。
The protein concentration of the extracts was determined with the BCA protein Assay kit.
(1)Protein concentration
1. Coomassie brilliant blue（考马斯亮蓝G250）
通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非
共价键连接的复合物。蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子（如磺酸基），从而产生
在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色
2. BCA（选用）
二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA Solution
A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合
物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线
性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
1测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作
1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度
BSA原液浓度：5mg/ml
原液浓度
5mg/ml
500ug/ml
原液体积
100
80
1%SDS体积
900
20
终浓度
500ug/ml
400ug/ml
500ug/ml
500ug/ml
500ug/ml
200ug/ml
100ug/ml
60
50
80
75
50
40
50
120
75
50
100
300ug/ml
250ug/ml
200ug/ml
100ug/ml
50ug/ml
0ug/ml
2. 待测样品稀释
用Nanophotometer初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间
内。
3.加样准备测定
标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中（注意标准曲线样品做三个重复），加入BCA
工作液200μl。
4.配制BCA工作液
计算好所有样品需要的BCA工作液总体积[(标准品的个数+待测蛋白样品的个数)×（实验重复次
数）×（用于每个样品的工作液的体积）=所需工作液总体积]，按照A:B=50:1的比率来配制工作液
总体积（A液的量按照计算的所需工作液总体积来算，加入对应的B液）。
5. 加入BCA工作液时将工作液和每个样品均混匀（注意排枪的最大量程为300ul，先调枪，保证每
个枪头的液面平齐即加液量一样），于60保温30min（放入开始计时）或室温放置两个小时，冷却至
室温后（十分钟左右）。
6.测定： 拿出来时，样品由绿色变为有梯度的紫色，在酶标仪上562nm处比色。
2. 数据分析
以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据
样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量.
3. 根据标准曲线计算原溶液的总蛋白浓度
得到的浓度值要乘以稀释比才得到原浓度。
4. 根据样品体积和浓度，用1%SDS稀释得到终浓度的样品。配制可溶性总蛋白终浓度1ug/ul的溶
液
3). SDS-PAGE
配胶
下层分离胶 15% 18% 12% 10%
H
2
O 2.3ml 1.3ml 3.3ml 4.0ml
30%丙烯酰胺 5.0ml 6.0ml 4.0ml 3.3ml
PH=8.8
Tris-HCl
10% SDS
1.5M 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml
100ul 100ul 100ul 100ul
APS 100ul 100ul 100ul 100ul
TEMED 8ul 8ul 8ul 8ul
上层浓缩胶 4%
H
2
O 6.0ml
30%丙烯酰胺 1.3ml
PH=6.8 0.5M Tris-HCl 2.5ml
10% SDS 100ul
APS 100ul
TEMED 8ul
注：APS在半月内使用，TEMED易被氧化变黄；
根据蛋白大小确定胶浓度
6%胶 50-150kD
8%胶 30-90kD
10%胶 20-80kD
12%胶 12-60kD
15%胶 10-40kD
TEMED和APS是促凝剂，加入后迅速混匀，用1ml枪头加入夹好的玻璃板中，沿内侧壁加入，约
4ml，加2ml75%乙醇液封，轻弹防止分离胶有气泡。待下层分离胶凝固后，倒掉乙醇，晾干，再配
制上层浓缩胶，每块胶需约2ml。若有气泡，将气泡吸走后，插上梳子（从一侧插入，慢慢完全插进
去，可以防止起泡的产生），观测梳子周围有无气泡，若有，重插梳子。
上样
将装好的玻璃板夹好，中间倒入SDS-PAGE电泳缓冲液（不漏液），液面超过上样孔，拔出梳子；
样品处理：准备好的样品100℃或沸水浴加热其10分钟，以充分变性蛋白。
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 上样量至少2ug，根据自己
的蛋白表达量确定。
恒流 上层胶：20mA/板
下层胶：40mA/板
恒压 上层胶：80V
下层胶：120V
溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目
的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳（此时可用于考马斯亮蓝染色，观测目的蛋白的表达情况）。
4). Western blotting
转膜
电泳结束后，将凝胶放入transfer buffer 中浸泡；
准备PVDV膜，将膜剪成5*8cm（由胶大小决定）大小，切角标记，在甲醇中浸泡10秒，浸于transfer
buffer中；
将滤纸和海绵也用transfer buffer浸泡（不要和胶，膜放在一起）；
按顺序夹好凝胶：黑板-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-白板，放置凝胶和滤纸时注意要轻轻赶走
气泡，转膜90V,1h。（注意转模时蛋白涌动方向为由负极到正极，即由黑到红（白），放入湿转槽中时，
颜色要对应）；
洗膜：用TBST洗膜2min，向盒子中加入足量TBST淹没膜，盒子放在平行摇床上洗涤；
封闭： 将膜在5%的block buffer(5%脱脂奶粉，1*TBST)中封闭1h，用脱色摇床转，转速不要太大；
附一抗： 将一抗用5%脱脂奶粉按1：3000稀释后，将膜用杂交袋封好，加入含有一抗的牛奶将膜完
全封闭，室温附一个半小时到两个小时，或者4℃过夜（可以回收抗体）；
洗膜：将膜在1*TBST中漂洗3次，盒子放在平行摇床上洗涤，每次10分钟；
附二抗：用5%脱脂奶粉稀释HRP标记的二抗（1：3000），将膜用杂交袋封好，加入含有二抗的牛奶，
室温附一个半小时；
洗膜： 将膜在1*TBST中漂洗3次，每次10分钟；
配制ECL反应液（A:B=1:1各取500ul加到1.5mlEP管中，加时注意换枪头以免污染，混匀后使用），
将反应液混合均匀涂在膜正面，黑暗条件处理两分钟，用AI600显示结果。
Western相关试剂
（1）5xTris-Glycine buffer(1L)（SDS-PAGE电泳缓冲液）
Tris 0.125M 15.1g
Glycine 1.25M 94 g
SDS 0.5% 5.08g
200 ml buffer +800 ml H
2
O 1L
（2）SDS-PAGE loading buffer
5x SDS-PAGE loading buffer 10 ml 2 x SDS-PAGE loading buffer
Tris-HCl PH6.8 250mM 2.6ml 100 mM
SDS(W/V) 10% 1g 4%
甘油(W/V) 50% 5ml 20%
BPB(溴酚兰) 0.5% 50mg 0.2%
巯基乙醇(W/V) 5% or 500ul 或者 500mmol/L DTT
加入巯基乙醇的loading buffer可在室温下保存一个月左右
（3））Transfer buffer (1L 10×母液)
39mM甘氨酸 48mM Tris 0.037% SDS
29g 58g 3.7g
先配制电转液10×母液，用时需要现配电转液，取700ml去离子水，加入100ml 10×电转液母液，加
入200ml甲醇混匀（现配现用）。
（6）5*TBS:（1L）
100 mM Tris-HCl（PH7.5） 2.5M Nacl
100 ml 1M Tris-HCl PH7.5 146.1g
配制1M Tris-HCl PH7.5作为母液。
（7）1*TBST（1L）现用现配
1*TBST 0.05%Tween-20(v/v)
200 ml 5*TBST 500ul Tween-20
（8）考马斯亮蓝R-250染色液（1L）
<1>称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中
<2>量取250ml的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解
<3>加入100ml的冰醋酸，均匀搅拌
<4>加入650ml的去离子水，均匀搅拌
<5>用滤纸去除颗粒物之后，室温保存
考马斯亮蓝R-250 异丙醇 冰醋酸
0.1% (W/V) 25% (V/V) 10%(V/V)
（9）考马斯亮蓝脱色液（1L）
醋酸10%(V/V) 乙醇5%(V/V) dH2O
100ml
50ml 850ml
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