admin 管理员组文章数量: 1086019
2024年12月29日发(作者：switch语句可以代替哪个语句)
蛋白免疫印迹（WesternBlot）
1.4.9 细胞裂解液
50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去
氧胆酸钠及0.1% SDS
1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）
称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。
1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液
去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级
SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。
1.4.12转膜缓冲液
Tris碱 3.03g，甘氨酸 14.4g，甲醇 200ml，补ddH2O 至
1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。4℃避光保存。
1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)
Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。
1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）
Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。
1.4.15 10%SDS
SDS 10g，ddH2O定容100ml。
1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）
丙烯酰胺 29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分
别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃
保存一月。
1.4.17 10×TBST缓冲液
浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；
0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再
做10 倍稀释。
1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）
脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。
1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）
APS 10g，ddH2O定容100ml。应隔周新鲜配制。
3 蛋白免疫印迹(Western Blot)
原理：Western blot 印迹方法，又称免疫印迹，是将获得的蛋白
样品通过SDS-聚丙烯酰胺（SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis, SDS-PAGE）电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，
并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（硝酸纤
维素膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后
膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化酶标记（偶联）的
二抗结合，最后用ECL试剂检测。如果印迹膜上含有靶蛋白，经X 光
片曝光显影后，则会在X光片上出现特异性蛋白条带。
3.1 样品制备
3.1.1 取对数生长期的Kasumi-1细胞分别加入不同浓度VPA处理
不同时间，800rpm，5min,离心收集细胞。同时设空白对照组。
3.1.2 彻底去除上清，加入适量细胞裂解液并加入PMSF(使PMSF
终浓度为0.174mg/ml)，冰上作用40min，期间间断充分混合5～6
次。
3.1.3 12000rpm，4℃离心20min，取上清，转入新的
Eppendorf 管中，-80℃保存。
3.2 蛋白质浓度测定
3.2.1 蛋白定量采用BCA法
原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA 与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在570nm处有高的吸收
值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
3.2.2 工作溶液及标准蛋白溶液配制
将50体积BCA reagent与1体积Cu reagent 混合即为工作溶
液。用PBS与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释：
20ul4000ug/mlBSA+20ul稀释溶液（PBS）=40ul
（BSA=2000ug/ml），取20ul连续倍比稀释7次，得到BSA标准溶
液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625ug/ml，各
20ul。
3.2.3 微板测定
将20ul标准品和待测样本与200 ul工作溶液混合；37℃30min
孵育;将反应微板温度冷却至室温；测定570nm光密度（OD）值。
3.2.4 绘制标准曲线（Fig 24）。
X轴为BSA标准蛋白浓度（ug/ml），Y轴为各标准管对应
OD570nm 值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。
3.3 蛋白变性
恒温水浴箱加热至98℃，取出保存于-80℃冰箱的蛋白样品，按
比例（4：1）加入5×Loading Buffer,封好EP管口，至水浴箱中变性
10分钟。
3.4 蛋白电泳
3.4.1 按下表分别配制分离胶和浓缩胶。APS和TEMED最后再加。
试剂12%分离胶
（10ml）
6%分离胶
（10ml）
5%浓缩胶
（5ml）
30%凝胶储备液 4.0 2.0 0.67
分离胶缓冲液
（1.5M Tris-HCl）
2.5 2.5 0
浓缩胶缓冲液
（1.0M Tris-HCl）
0 0 0.5
10%SDS 0.1 0.1 0.04
双蒸水 3.3 5.3 2.7
10%APS 0.1 0.1 0.04
1%TEMED 0.004 0.008 0.004
3.3.2 分离胶溶液加至电泳板中，在上面铺上水层，以隔绝空气。
3.3.3 待凝固后，倾去上面的水层。迅速加入浓缩胶，小心插入梳
子，避免混入气泡。
3.3.4 待浓缩胶聚合完全后，在电泳槽中加入电泳缓冲液，小心移
出梳子，加入已变性并混有溴酚蓝的蛋白样品，进行稳压电泳（浓缩
胶，80V；分离胶，120V）。
3.4 转膜
3.4.1 根据凝胶大小剪取6张滤纸和1张PVDF膜（PVDF膜于甲
醇中浸泡5min），然后将滤纸、PVDF膜及凝胶于转移缓冲液中处理
15分
钟。同时将海绵浸于转移缓冲液中。
3.4.2 按如下方法安装转移装置：阴极一层海绵三层滤纸
胶 PVDF膜三层滤纸一层海绵，将气泡赶净。
3.4.3 扣紧转移槽，接通电源，以2mA/cm2恒流转膜，VEGF常
温转膜120分钟，β-actin 常温转膜150分钟，KDR 4℃转膜4小时。
3.4.4 转膜后，在滤膜左上角剪口做标记，并转移到丽春红染液中5-
10min，其间轻轻摇动染液。蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗
滤膜，其间换水数次。
3.5 免疫印迹
3.5.1 封闭。将PVDF膜浸泡于5%脱脂牛奶封闭液（脱脂奶粉由
0.1%Triton X-100 TBST稀释）中， 4℃摇床2小时。
3.5.2 加一抗。将PVDF膜置于湿盒上，有蛋白的一面向上，压紧
四角，滴加适量的抗体稀释液于PVDF膜上。4C°孵育过夜。2.5%封
闭液配制，VEGF及KDR 1：200稀释，β-actin 1：1000稀释。
3.5.3 冲洗。用0.1%Triton X-100 TBST液洗滤膜，共3次，每次
15min。
3.5.4 加二抗。2.5%封闭液1：1500稀释。将PVDF膜置于湿盒
上，有蛋白的一面向上，滴加适量的抗体稀释液于PVDF膜上，压紧
四角，室温作用1小时。
3.5.5 冲洗。用0.1%Triton X-100 TBST液洗滤膜，共3次，每次
5min。
3.5.6 取等量ECL A、B液，混匀，将混和液加于膜上反应3min。
3.5.7 暗室曝光。在暗盒内依次放上保鲜膜、PVDF膜、保鲜膜，
固定。黑暗中，再将X光片置于膜上，曝光3min。
3.5.8 曝光完毕，将X光片在显影液中浸泡2min，待出现暗带时，
于自来水下冲洗。
3.5.9 将X光片在定影液中浸泡2～4min，自来水冲洗，晾干保
存，并拍照。
3.5.10 拍照的图像用灰度扫描软件BandScan
4.5进行扫描，取得目的条带灰度值，用该灰度值和内参β-actin
灰度值相比，用相对灰度值在Excel中作图分析。
版权声明：本文标题：蛋白免疫印迹(WesternBlot) 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://roclinux.cn/p/1735503369a1673379.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
发表评论