番茄Pti基因瞬时表达与互作检测

番茄Pti基因瞬时表达与互作检测

刘莹;冯国栋;张政;周宇;王洋;牛向丽

【摘 要】丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,

而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白.文章

通过克隆番茄Pti(Pto interaction protein)基因Pti4、Pti5和Pti6,分别构建植物

表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和western blot-ting

检测,并进一步利用免疫共沉淀技术,在植物体系中检测了它们与番茄Pto蛋白的相

互作用.实验结果表明,利用所构建Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体,在烟草中

获得了预期大小Pti4、Pti5和Pti 6蛋白,并在植物体系中验证了它们与Pto蛋白

的相互作用.该工作为深入研究Pti基因在番茄分子免疫途径的功能奠定了基础.

【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2018(041)012

【总页数】6页(P1700-1704,1723)

【关键词】植物抗病;植物表达载体;western印迹;免疫共沉淀;蛋白质相互作用

【作 者】刘莹;冯国栋;张政;周宇;王洋;牛向丽

【作者单位】合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学

食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合

肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食

品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥

230009

【正文语种】中 文

【中图分类】Q943.2;S511.03

0 引 言

番茄是重要的经济作物,但每年均会因病虫害造成减产。番茄细菌性斑点病是影响

番茄产量和品质的重要病害,主要危害番茄叶、茎、花、叶柄和果实,感染时产生深

褐色至黑色不规则斑点[1]。自1933年首次报道以来,番茄细菌性斑点病在全球26

个国家均有发现,我国也于1998年发现。据统计,这一病害可造成5%～75%的产

量损失,其病原菌是丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syringae

(Pst)[2]。丁香假单胞菌可分为50多个致病变种[3],在多种作物导致细

菌性病害。

植物病原菌以多种方式侵入植物,例如:一些病原菌利用机械压力或酶解作用直接穿

透植物表层;一些病原菌从气孔、皮孔等植物表面天然孔隙进入;还有一些病原菌只

侵染受伤的植物组织。能够避开天然屏障成功侵入植物体的病原菌,到达质外体后,

可以利用Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)[4-7]向植物胞外空间甚

至植物细胞内释放效应蛋白(effector)阻断植物体内已有的病原菌检测、防御体系

[8-10],使植物感病。而植物则进一步通过进化形成抗病基因(resistance gene,R)

与病原菌效应蛋白直接或间接相互作用、结合识别,使效应蛋白成为了无毒基因

(avirulence gene,Avr),植物产生对病害的抗性。这种“基因对基因”的抗性是植

物抗病性的重要形式。在番茄中,经长期进化形成的R基因Pto,编码丝氨酸/苏氨酸

蛋白激酶[11]通过识别丁香假单胞菌效应蛋白Avrpto/AvrPtoB[12-14],激发宿主

植物的防卫反应,从而产生对病原菌的抵御能力。因此,Pto成为研究植物抗病分子

机制、植物病原微生物相互作用的一个重要基因。通过酵母双杂交系统已发现了一

些可以与Pto相互作用的蛋白质,即Pti (Pto interaction protein),分别命名为Pti4、

Pti5和Pti6,它们都为转录因子[15],编码类似于烟草的乙烯反应元件结合蛋白[16],

可能是Pto的下游基因,但它们在植物体内的互作情况、在Pto蛋白所介导的免疫

途径中的具体功能尚未清晰阐明。

番茄作为食用蔬果在世界各地广泛种植,因其富含番茄红素等各种营养成分,成为适

合现代人食用的健康蔬果,而具有巨大的经济价值。本研究通过番茄Pti基因的克隆、

植物表达载体构建、表达,并进一步利用免疫共沉淀技术在植物体系中检测它们与

番茄Pto蛋白的相互作用,为深入探讨Pti基因在模式植物番茄中的抗病功能以及

可能的遗传改良应用提供了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

(1) 载体、菌株和植物材料。克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector购

于北京全式金生物技术有限公司;植物表达载体pBTEX-FLAG(带有CaMV35S植物

组成型启动子、FLAG蛋白标签)由本实验室保存;大肠杆菌(Escherichia coli)菌株

DH5α购于北京全式金生物技术有限公司;根癌农杆菌(Agrobacterium

tumefaciens)菌株GV2260由美国University of idaho大学Fangming Xiao博

士惠赠;烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)植株种植

于合肥工业大学屯溪路校区人工气候培养室。

(2) 试剂。Pfu高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司;质粒提取试

剂盒、DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒购于北京全式金生物技术有限

公司;限制性内切酶KpnI、StuI、T4连接酶购于TaKaRa公司;引物设计采用

Primmer Premmier 5.0软件,由上海英骏生物技术有限公司合成;FLAG标签小鼠

单克隆抗体、HA标签小鼠单克隆抗体购于美国Sigma公司;anti-HA agarose、

PageRuler Plus Prestained Protein Ladder、Western Blotting ECL Substrate

购于美国Thermo Scientific公司。其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 实验方法

(1) 番茄Pti基因克隆。根据番茄Pti4、Pti5和Pti6基因序列(NCBI登录号为

AK319979、U89256和U89256)设计引物,分别用于对其编码区进行聚合酶链式

反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增。引物序列(5’-3’)为:

Pti4 F:GAAGGTACCATGGATCAACAGTTACCACCGA,

Pti4 R:GAAGGCCTAATGACCAATAGTTGATGGACACCT;

Pti5 F:GAAGGTACCATGGTTCCAACTCCTCAAAGT，

Pti5 R:GAAGGCCTACATCTTGATTCAAATACATCATTAG;

Pti6 F:GAAGGTACCATGACGGAAAATTCAGTTCCG,

Pti6 R:GAAGGCCTTCGAGCTTCAAGGGCAAAAT。

均引入KpnⅠ、StuⅠ酶切位点。

从番茄叶片中提取总RNA,取1 μg总RNA合成第一链cDNA，然后以cDNA为

模板,对Pti4、Pti5和Pti6基因进行PCR高保真扩增。扩增条件为:98 ℃ 2

min,98 ℃ 10 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃总延伸 5 min。PCR产物

经琼脂糖凝胶电泳、纯化,然后与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector克隆载体

连接,连接产物转化DH5a感受态细胞。挑取单克隆培养后进行菌落PCR鉴定,将

所鉴定阳性克隆送测序。

(2) 番茄Pti基因植物表达载体构建。将上述测序阳性克隆提取质粒,分别以KpnⅠ、

StuⅠ(Pti4,Pti5和Pti6)进行双酶切。酶切片段进行胶回收,然后与KpnⅠ、StuⅠ

双酶切回收的pBTEX-FLAG植物表达载体片段进行连接、大肠杆菌转化,并进行菌

落PCR鉴定、质粒酶切鉴定后进行测序验证,构建CaMV35S∷pBTEX-Pti-FLAG

载体(分别命名为pBTEX-Pti4-FLAG、pBTEX-Pti5-FLAG和pBTEX-Pti6-FLAG)。

利用冻融法将所构建载体转化农杆菌GV2260,筛选鉴定阳性克隆,获得分别带有

Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体的农杆菌单克隆,-80 ℃保存备用。

(3) Pti基因在烟草叶片中的瞬时表达。采用农杆菌介导的瞬时表达方法[17-18]。

即,将带有Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体的农杆菌在含有利福平(Rif)和卡那

霉素(Kan)的LB培养板28 ℃培养2 d,挑取单克隆于2 mL LB/Rif/Kan培养液

中,28 ℃,200 r/min过夜培养。吸取300 μL菌液于2.7 mL LB/Rif/Kan培养液

中,28 ℃培养5 h。然后将菌液3 000 r/min；离心6 min,以3 mL IM培养液(50

mmol/L 2-吗啉乙磺酸、10 %甘油、2 mmol/L磷酸二氢钠)重悬细胞,再次3 000

r/min离心6 min后重悬于3 mL诱导缓冲液Ⅰ(IM培养液、200 mmol/L乙酰丁

香酮、25 mg/mL卡那霉素)中,28 ℃，培养10～12 h。将菌液3 000 r/min离心

6 min收集细胞,以2 mL 诱导缓冲液Ⅱ(50 mmol/L 2-吗啉乙磺酸、蒸馏水、200

m mol/L乙酰丁香酮)重悬细胞,测定OD600吸收值。利用缓冲液Ⅱ调整使

OD600=0.5,注射于4 周左右大小烟草植株的叶片中。36 h后收取样品,-80 ℃保

存备用。

将上述烟草叶片样品取出,液氮研磨后取约200 mg研磨粉末加入200 μmol/L蛋

白提取液(50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、150 mmol/L氯化钠、5 mmol/L乙二

胺四乙酸、10 %甘油、1 %聚乙烯吡咯烷酮、20 μmol/L二硫苏糖醇、1 mmol/L

苯甲基磺酰氟),涡旋,放置10 min,12 000 r/min,4 ℃离心10 min,吸取上清,加入上

样缓冲液,制备蛋白质样品。然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭和抗体结

合,利用免疫印迹(western blotting)检测Pti4、Pti5和Pti6蛋白的表达情况。

(4) Pti与番茄抗病蛋白Pto的植物体内互作。将带有Pti4、Pti5和Pti6基因的

pBTEX-Pti-FLAG载体农杆菌、带有Pto基因的pBTEX-Pto-HA载体农杆菌,如上

述瞬时表达实验方法所述进行培养、烟草叶片注射和蛋白质提取。提取液中加入

10 μL anti-HA agarose,4 ℃免疫反应2 h。然后6 000 r/min,4 ℃离心1 min,弃

去上清,加入1 mL 洗涤缓冲液(50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷,150 mmol/L氯化

钠,5 mmol/L乙二胺四乙酸,10 %甘油,1 mmol/L苯甲基磺酰氟)重悬,重复清洗3

次。最后加入 30 μL上样缓冲液,95 ℃,5 min,取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分

离,转膜、封闭后,分别以HA标签抗体(anti-HA)、 FLAG 标签抗体(anti-FLAG)37 ℃

免疫反应1 h,以TBS缓冲液(1.34 mol/L氯化钠,27 mmol/L 氯化钾,250 mmol/L

三羟甲基氨基甲烷)洗膜3次。加入辣根过氧化酶联二抗,37 ℃,1 h,洗膜3次。加

入反应底物(western blotting ECL substrate),在化学发光仪中对蛋白表达、相互

作用情况进行检测。

2 结果与分析

2.1 克隆番茄Pti基因

以野生型番茄品种AC+植株叶片cDNA为模板,利用1.2节所述引物对Pti4、Pti5

和Pti6基因分别进行PCR 扩增。所获PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图

1所示,扩增产物均为一条特异条带,基因片段大小与预期结果(720、507、768 bp)

基本一致。将PCR产物纯化后连接于pEASY-Blunt克隆载体,连接产物转化大肠

杆菌DH5a感受态细胞。经阳性克隆鉴定、测序验证,结果表明克隆获得了番茄

Pti4、Pti5和Pti6基因编码序列。图1中，M代表Trans 2K DNA Marker;1代

表Pti4基因;2代表Pti5基因;3代表Pti6基因。

图1 番茄Pti基因PCR扩增产物

2.2 构建番茄Pti基因植物表达载体

将已测序Pti4、Pti5和Pti6基因的pEASY-Blunt克隆载体按照1.2方法所述,进

行双酶切,胶回收基因片段连接于植物表达载体pBTEX-FLAG。连接产物转化大肠

杆菌DH5a感受态细胞。通过菌落PCR鉴定,获取阳性单克隆,并提取质粒,分别进

行双酶切鉴定,结果如图2所示。图2中,M代表 Trans2K DNA Marker;1代表

pBTEX-Pti4-FLAG未酶切质粒; 2代表pBTEX-Pti4-FLAG质粒以KpnⅠ/StuⅠ双

酶切;3代表pBTEX-Pti5-FLAG未酶切质粒; 4代表pBTEX-Pti5-FLAG质粒以

KpnⅠ/StuⅠ双酶切;5代表 pBTEX-Pti6-FLAG未酶切质粒; 6代表 pBTEX-Pti6-

FLAG质粒以KpnⅠ/StuⅠ双酶切。

酶切后获得了预期大小的Pti基因片段,表明Pti4、Pti5和Pti6基因已分别连接至

植物表达载体pBTEX-FLAG。经进一步测序验证,完成CaMV35S∷pBTEX-Pti-

FLAG载体构建。

图2 Pti基因植物表达载体酶切鉴定

2.3 在烟草中瞬时表达Pti蛋白

将带有Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体的农杆菌阳性单克隆,经1.2节方法所

述培养、注射于烟草叶片中,外源番茄Pti基因在烟草叶片中进行瞬时表达。通过免

疫印迹试验,检测到预期大小Pti4(约28 kDa)、Pti5(约20 kDa)和Pti6(约30 kDa)

蛋白的表达,如图3所示。图3中,1～3为3个pBTEX-Pti4-FLAG载体农杆菌单克

隆在烟草叶片中的瞬时表达;4～6为3个pBTEX-Pti5-FLAG载体农杆菌单克隆在

烟草叶片中的瞬时表达; 7～9为3个pBTEX-Pti6-FLAG载体农杆菌单克隆在烟草

叶片中的瞬时表达。

图3表明所构建Pti基因表达载体在植物体内可以进行表达,用于进一步的蛋白质

后续实验。

图3 Pti基因在烟草中瞬时表达产物的免疫印迹检测

2.4 Pti与Pto蛋白相互作用

由于Pti基因编码产物可以在植物体内顺利表达,因此,进一步将带有FLAG标签的

Pti4、Pti5和Pti6蛋白分别与带有HA标签的番茄抗病蛋白Pto在烟草叶片中共

同表达,通过蛋白提取、免疫共沉淀,利用它们所带标签序列的差异,对其相互作用进

行检测，结果如图4所示。图4中,1代表pBTEX-FLAG空载体农杆菌单克隆与

pBTEX-Pto-HA载体农杆菌单克隆在烟草叶片中共同表达; 2代表 pBTEX-Pti4-

FLAG载体农杆菌单克隆与pBTEX-Pto-HA载体农杆菌单克隆在烟草叶片中共同

表达; 3代表 pBTEX-Pti5-FLAG载体农杆菌单克隆与pBTEX-Pto-HA载体农杆菌

单克隆在烟草叶片中共同表达; 4代表pBTEX-Pti6-FLAG载体农杆菌单克隆与

pBTEX-Pto-HA载体农杆菌单克隆在烟草叶片中共同表达；IP为

Immunoprecipitation; WB为 Western Blotting; a-HA为HA标签抗体;a-FLAG

为FLAG标签抗体。

在共表达样品中,预期大小的Pti4、Pti5、Pti6和Pto蛋白均得到表达;anti-HA

agarose也使Pto-HA被免疫沉淀富集;番茄Pti4、Pti5和Pti6蛋白均可在Pto蛋

白的免疫复合物中被检出,而在空载体的负对照样品中则无明显条带,说明Pti4、

Pti5和Pti6均可以与Pto相互作用,但与Pti4和Pti6相比,Pti5与Pto的相互作用

稍弱。

图4 Pti与Pto蛋白的免疫共沉淀检测结果

3 讨 论

在对植物抗病免疫分子机制的认识中,番茄及其病原微生物丁香假单胞菌番茄致病

变种ae 是一个很好的研究模式。番茄通过“发

现”ae 的鞭毛蛋白等保守结构,触发PTI(PAMP-triggered

immunity)[19]免疫机制来避免病害发生;病原菌进而通过向番茄细胞注入毒性的

AvrPto、AvrPtoB等效应蛋白,分别在不同环节阻断、干扰植物的基础PTI免疫

[20]。植物进而进化形成高激酶活性的Pto蛋白,磷酸化AvrPtoB的E3连接酶位

点,竞争性失活其连接酶结构域,不仅避免了自身被降解,也使病原微生物的毒性蛋白

变成了植物感知威胁预设防线的无毒基因。当病原菌附着于植物体并向细胞注入效

应蛋白AvrPto、AvrPtoB时,Pto与其直接结合,触发Pto激酶结构改变,导致

Prf(富含亮氨酸重复的抗性蛋白)构象转换而被激活[21-22],触发下游防御反应,最终

在侵染部位产生超敏反应诱导组织坏死[23-24],防止病原菌的定植和繁殖。因

此,Pto成为植物分子免疫机制中的一个重要枢纽蛋白,但Pto介导的免疫途径的框

架仍未完整阐明。

虽然在酵母系统中,通过酵母双杂交已发现番茄Pti蛋白与Pto蛋白相互作用,Pti也

因此得名。但在植物体内两者之间的互助仍需验证。在本实验中,蛋白表达、互作

检测中选用烟草作为植物实验材料,是由于烟草与番茄同样可受ae

侵染,引起相似叶片病变症状、防御反应,同时,与番茄相比,烟草叶片伸

展,易于进行农杆菌液注射,也是外源基因转录、蛋白质翻译的一个理想的植物材料,

因此,在植物抗病机制研究中被广泛应用[25-26]。本工作中,通过构建Pti基因植物

表达载体、在烟草叶片中表达、植物体内互作检测,证明Pti蛋白与Pto蛋白在植

物体内具有相互作用。另一方面,也表明本研究所构建载体可用于后续实验。

本文中番茄Pti蛋白与Pto 的互作显示,它们参与Pto介导的植物抗病免疫分子途

径,互作程度的差异则提示,它们可能在识别抵御病原菌的调控力度中有所区别。这

些工作使进一步探讨与重要抗病蛋白Pto相互作用的这些Pti转录因子的功能、它

们在植物病原微生物之间相互识别、攻防关系中的作用,以及在Pto介导免疫分子

途径中的准确占位,提供了基础和可能。

[参 考 文 献]

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