抗柔嫩艾美耳球虫ScFv-PE40重组毒素的活性测定

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１３年（第４９卷）第３期　２７　

抗柔嫩艾美耳球虫ＳｃＦｖ－ＰＥ４０重组毒素的活性测定　

郝景锋　。，吴　斌　，蔡华东　，赵　权。　

（１．吉林农业科技学院动物医学学院，吉林吉林１３２１０１；２．吉林省磐石市园艺特产技术推广站，吉林磐石１３２３００；　

３．吉林农业大学研究生院，吉林长春１３０１１８）　

摘要：本试验采用ＳｃＦｖ—ＰＥ４０重组免疫毒素（构建重组毒素时使用的是ｐＥＴ２８ａ（十）表达载体，因其表达的蛋白产物Ｎ末　

端包含Ｈｉｓ—Ｔａｇ，因此采用金属Ｎｉ２＋亲和层析柱方法纯化该目的蛋白）来免疫健康无球虫海蓝小公雏，免疫后通过盲肠病变　

记分，克盲肠内容物卵囊数（ＯＰＧ）、结合抗球虫指数（ＡＣＩ）、增重等感染指标的测定，对重组免疫毒素对海蓝小公雏感染柔嫩　

艾美耳球虫的保护效果进行观察评价，为临床上控制鸡球虫病提供科学的依据。　

关键词：抗柔嫩艾美耳球虫；重组免疫毒素；活性测定　

中图分类号：￥８５２．７２　３　文献标识码：Ａ　文章编号：０５２９—６００５（２０１３）０３—００２７　０３　

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｎｔｉ—Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ　

ＳｃＦＶ－ＰＥ４０　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ　

ＨＡＯ　Ｊｉｎｇ—ｆｅｎｇ　，ＷＵ　Ｂｉｎ　，ＣＡＩ　Ｈｕａ—ｄｏｎｇ　，ＺＨＡＯ　Ｑｕａｎ３　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｊｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ　１３２１０１，Ｃｈｉｎａ；　

２．Ｐａｎｓｈｉ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　Ｓｔａｔｉｏｎｓ，Ｐａｎｓｈｉ　１３２３００，Ｃｈｉｎａ；　

３．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｂｙ　ＳｃＦｖ—ＰＥ４Ｏ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　

ｖｅｃｔｏｒ（ｐＥＴ２８ａ（＋）ｉｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔｏｘｉｎ　ＳｃＦｖ—ＰＥ４０　ｗｉｔｈ　Ｈｉｓ—ｔａｇ，ＳＯ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏ—　

ｔｅｉｎ　ｉｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｆｔｅｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃ—　

ｔｉｖｅ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｉｎｎｕｎｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｃｅｃａｌ　ｌｅ—　

ｓｉｏｎ　ｓｃｏｒｉｎｇ，ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｏｏｃｙｓｔｓ　ｐｅｒ　ｇｒａｍ　ｏｆ　ｃｅｃａｌ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ（ＯＰＧ），ｗｅｉｇｈｔ　ｇａｉｎ，ｃｏｍ—　

ｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａｌ　ｉｎｄｅｘ（ＡＣＩ）ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ．Ｔｈｅ　ｒｅ—　

ｓｕｉｔｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｎｔｉ—Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＯ　Ｑｕａｎ　

作为鸡球虫病主要的病原体之一，柔嫩艾美耳　艾美球虫病，目前主要依靠药物防治和疫苗免疫。　

球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）对雏鸡的危害非常严重，针对柔嫩　

由于药物防治存在耐药性和药物残留问题，效果不　

太理想；同时，活苗免疫不但具有潜在的致病力，而　

收稿日期：２０１２　０４　２８　

且生产成本较高，免疫程序复杂，特别是免疫后的监　

基金项目：吉林农业科学院校级青年基金　

作者简介：郝景锋（１９７７），男，硕士生，研究方向为临床兽医学，　

测和管理技术要求较高，不能得到广泛应用｜１］。这　

Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｉｆｙｈｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｅｎ　

就需要找到其他更为安全、简单、廉价、有效的防治　

通讯作者：赵权，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｏｑｕａｎ０８２５＠１６３．ｅｏｍ　

措施。近些年来，多种球虫保护性抗原基因被克隆　

高，在９１．３　～９１．７　之间，提示ｏｍｐＨ作为疫苗　

ｐＨ）ｏｆ　Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　７７７　ｕｌｔｏｃｉｄａ　ｘ一７３［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９７，　

使用可能提供同源和异源保护，但有待进一步进行　

１７９：７８５６　７８６４．　・　

表达及免疫保护试验研究。　

Ｅａ３　Ｇａｌｄｉｅｒｏ　Ｍ，Ｆｏｌｇｏｒｅ　Ａ，Ｎｕｚｚｏ，ｅｔ　ａ１．Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｍｉ　

ｇｒａｔｉｏｎ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈ　

参考文献：　

ａｎｄ　ＬＰＳ　ｏｆ　Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍ　ｕｌｔｏｃｉｄａ　ＥＪ］．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，　

［１］　

王娉，张富春．多杀性巴氏杆菌毒力因子的研究进展ＥＪ］．地方　

２０２（３）：２２６　２３８．　

病通报，２００６，２１（２）．　

［４］曹素芳，黄青云，韩先干，等．禽巴氏杆菌Ｃ４８—１外膜蛋白Ｈ　

［２］　

ＬＵＯ　Ｙ，Ｇｌｉｓｓｏｎ　Ｊ　Ｒ，ＪａｃｋｗｏｏｄＭ　Ｗ。ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒ—　

基因克隆及序列分析ＥＪ］．中国预防兽医学报，２００６，２８（３）：　

ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ（Ｏｌｌ＇ｌ　

２５３—２５６．　

２８　中国兽医杂志２０１３年（第４９卷）第３期　

表达，在已经报道Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ基因中，ＳｃＦｖ基因编¨　

的抗原位于子孢子折光体上，在球虫孢子生殖阶段　

过渡到裂殖生殖阶段发挥很重要的生物学功能，其　

基因表达产物具有一定的免疫保护作用，而且对其　

他球虫具有一定的交叉保护＿２］。因此，利用分子生　

物学技术研制基因工程疫苗已成为当前防治球虫病　

较为理想的选择。　

本实验室已经对Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ子孢子表面抗原　

ＳｃＦｖ基因进行了克隆和序列测定，将目的基因连接　

ｐＥＴ２８ａ（＋）载体进行原核表达后，对海蓝小公雏　

感染柔嫩艾美耳球虫的保护效果进行观察评价，为　

进一步在临床上控制鸡球虫病提供科学的依据。　

１材料与方法　

１．１　材料　重组免疫毒素（吉林农业大学寄生虫实　

验室馈赠）：本试验构建重组毒素时使用的是　

ｐＥＴ２８ａ（＋）表达载体，因其表达的蛋白产物Ｎ末　

端包含Ｈｉｓ—Ｔａｇ，所以能够采用金属Ｎｉ２＋亲和层　

析柱方法纯化该目的蛋白。试验动物：１日龄海蓝　

小公雏，购自长春市北方养鸡场。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ虫株，　

由吉林农业大学寄生虫实验室保存。　

１．２方法　

１．２．１试验分组设立阴性对照（非感染非免疫对　

照组）为第１组，阳性对照（感染非免疫对照组）为　

第２组，试验组即重组免疫毒素组为第３组。　

１．２．２试验设计试验动物选取１日龄的球虫检　

测阴性海蓝公雏鸡，饲养至１２日龄随机分成３组，　

每组２Ｏ羽，自由饮水采食，首免于１４日龄，１００　ｇ／　

羽，胸部肌肉注射，采用同样剂量于２１日龄加强免　

疫，于２８日龄先称重，每羽口服１×１０　个易感染　

的Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ孢子化卵囊，逐日观察记录精神状态　

以及死亡数量，３６日龄宰杀，逐只称重、盲肠病变计　

分以及卵囊计数，计算ＡＣＩ，应用ＳＰＳＳ　１３．０软件进　

行数据分析。　

１．２．３抗球虫效果的判定　

１．２．３．１　盲肠病变值与判定指标　３６日龄试验　

鸡先称重，宰杀，按Ｊｏｈｎｓｏｎ方法判定盲肠病变记　

分，标准如下：剖检未见任何病变记为０分；盲肠　

壁出现极少数出血点且内容物正常记作＋１；盲肠　

出血，肠壁肥厚，有出血点记作＋２；盲肠出现栓　

塞，大量出血，肠壁萎缩或者变形记作＋３；盲肠内　

出现栓芯或者凝血块，盲肠萎缩严重，肠壁增厚记　

作＋４。若两侧病变程度不相同时，按照病变较严　

重侧计算　］。　

病变值一各组平均病变记分×１０　

１．２．３．２　ＯＰＧ值测定　从感染后第５天开始，每　

天收集１～５组的粪便至攻虫后第９天。采用司陶　

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

尔虫卵记数法测定ＯＰＧ值　。　

表１克盲肠内容物卵囊值换算标准　

克盲肠内容物卵囊数ＯＰＧ（×１０　）　卵囊值　

０～０．１　

Ｏ．１～１．０　

２．０～５．０　

６．０～１０．０　

＞１１．０　

１．２．３．３增重本次增重指标的测定范围是２０～　

３６日龄，计算公式如下：平均增重一扑杀时平均体　

重一攻虫前平均体重；平均增重率一平均增重／攻　

虫前平均体重　

相对增重率（　）一平均增重率／阴性对照组平　

均增重率×１００Ｖｏｏ　

１．２．３．４抗球虫指数（ＡＣＩ）　根据如下公式计算：　

ＡＣＩ＝（相对增重率＋存活率）一（病变值＋卵囊值）　

ＡＣＩ＞１８０时即为保护效果明显；ＡＣＩ为１６０～　

１７９时即为保护效果较好；ＡＣＩ为１６０～１２０时即为　

保护效果一般；ＡＣＩ＜１２０时即为无保护效果＿５］。　

２试验结果　

２．１　临床症状观察结果　２１日龄后第３组鸡未出　

现明显异常状况，各鸡只精神状态良好。攻虫后第　

５天，第２、３组试验鸡只陆续出现精神沉郁，食欲减　

退，第２组鸡粪便出血严重，第３组粪便少量出血。　

各试验组分别用饱和食盐水漂浮法进行卵囊计数，　

结果显示已有卵囊生成。第２，３组鸡于感染后第　

６～９天均检出卵囊，第２组卵囊数量较高。期间第　

１组鸡未出现任何异常，粪检时无卵囊出现。　

２．２鸡只增重变化　从表２可以看出，使用ＳＰＳＳ　

１３．０软件进行统计分析，攻虫前，各试验分组差异　

均不显著（Ｐ＞０．０５），表明疫苗免疫对增重基本未　

产生影响。宰杀之前，第３组试验鸡体重增重明显　

高于阳性对照组，差异显著（Ｐ＜０．０５），说明融合蛋　

白对Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ感染具有一定的抵抗作用。第３组　

与第１组体重差异显著（Ｐ＜０．０５），说明试验组对　

Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ感染不能完全保护。　

２．３盲肠病变计分　盲肠病变计分统计情况如表　

３所示。由表３可看出各试验组与阴性对照组的差　

异均显著，第３组与第２组差异显著，第３组的盲肠　

病变记分最小，为１．８，抗球虫效果较好。　

２．４　ＯＰＧ值测定结果　３３～３６日龄各组鸡的粪　

便卵囊计数（ＯＰＧ）值测定结果见表４，由表４可以　

看出，试验各组与阴性对照组比较差异均显著，并且　

与阳性对照组差异显著。其中第３组的ＯＰＧ值最　

小为１５　０００，卵囊数量下降率最大，为４Ｏ．７８　。　

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１３年（第４９卷）第３期　２９　

注：表中同一列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。下表同　

表３盲肠病变记分　２．５重组蛋白免疫对球虫感染的综合保护效果　

从表４可以看出，各组的ＡＣＩ值，重组免疫毒素组　

较高，对鸡体具有较好的保护效果。　

表４感染后５～９　ｄ各组雏鸡的ＯＰＧ值　

表５　重组蛋白免疫对球虫感染的保护效果　

在鸡球虫病的免疫研究中评价保护效果的基本指　

标。结果显示，免疫毒素组的卵囊减少率达到　

４０．７８　，而相对增重率明显要比阳性对照组高。但　

免疫效果并不十分理想，饲养方式可能是一方面原　

因，地面平养鸡的生活条件会使垫料变湿，卵囊孢子　

３讨论　

化容易再次被鸡采食，造成再次感染；免疫间隔时间　

鸡球虫病是鸡常见且危害十分严重的寄生虫　

过短可能是另一方面原因，有研究成果表明，ＤＮＡ　

病，是由一种或多种球虫引起的急性流行性寄生虫　

疫苗必须进行多次加强免疫，但每次加强免疫间的　

间隔时间要相对较长＿６］，Ｋｌｏｔｚ等（２００７）认为要获　

病。雏鸡感染球虫后，主要症状可见大量肠上皮细　

得理想的保护效果间隔时间最好能达到３～４周　］。　

胞受损、出血，严重者造成死亡，病愈鸡长期不能康　

复，生长及生产性能都受到严重影响。它造成的经　

综合表明，重组免疫毒素对可诱导鸡体产生一定的　

抗球虫感染的免疫保护力。　

济损失是惊人的，是严重威胁着封闭式工厂化养鸡　

发展的一种重要的疾病。近年来，多种球虫保护性　

参考文献：　

抗原基因被克隆表达，利用基因工程技术生产基因　

［１］ＣｈａＰｍａｎ　Ｈ　Ｄ，Ｃｈｅｒｒｙ　Ｔ　Ｅ，Ｄａｎｆｏｒｔｈ　Ｈ　Ｄ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｇ，Ｓｈｉｒ—　

ｌｅｙ　Ｍ　Ｗ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｒ　Ｂ．Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　

工程疫苗用于预防鸡球虫病越来越得到人们的重　

ｐｏｕｌｔｒｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｌｉｖｅｓ　ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎｔ　Ｊ　ＰａｒａｓｉｔｏＩ，　

视。通过肌肉、鼻腔、静脉、真皮、皮下及腹腔等不同　

２００２，３２（５）：６１７－６２９．　

接种途径进行免疫，免疫效果表明，肌肉注射和静脉　

［２］彭金彪．鸡柔嫩艾美耳球虫重组Ｓ０７抗原的免疫保护作用　

注射效果最好。　

［Ｄ］．扬卅Ｉ：扬卅ｌ大学，２００７：５：６４—６５．　

本研究采用肌肉注射的方法是对１４日龄雏鸡　

［３］王卉．鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株Ｓ０７和ＴＡ４抗原基因的克隆　

与表达及免疫保护性试验［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，　

进行首次胸腺部位免疫，２１日龄进行加强免疫。在　

２００９：５：４７—４８．　

２８日龄称重后经口服感染１×１０　个Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ孢　

［４］李安兴，蒋金书．柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅ￣ｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ）ＢＪ株Ｓ０７　

子化卵囊　３６日龄宰杀所有鸡只，根据鸡只体内注　

重组抗原的免疫试验Ｉｌ１．中国兽医学报，２０００，２Ｏ（２）：１６７—　

射重组免疫毒素免疫后的盲肠病变记分、ＯＰＧ、增　

１７０．　

［５］　彭维刚．鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株ＲＢ１　ａ基因的克隆表达与　

重、结合抗球虫指数（ＡＣＩ）等相关抗球虫感染指标　

免疫保护性试验［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１１，５：３５．　

检测，试验表明，重组蛋白可以显著减少盲肠病变记　

［６］许金俊，陶建平，彭金彪，等．不同佐剂和免疫途径对柔嫩艾美　

分和卵囊排出，抑制增重减少，相对增重率和卵囊减　

耳球虫ＳＯ７抗原免疫保护效果的影响［Ｊ］．中国预防兽医学　

少率是评价鸡球虫疫苗免疫保护效果的两个重要的　

报，２００７，２９（９）：７０２—７０３．　

指标。不论应用药物处理还是使用疫苗进行免疫　

［７］Ｋｌｏｔｚ　Ｃ，Ｇｅｈｒｅ　Ｆ，Ｌｕｃｉｕｓ　Ｒ，Ｐｏｇｏｎｋａ　Ｔ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｉ—　

ｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａ—　

后，其目的都是削减虫卵卵囊的生成，使环境中的卵　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ　

囊控制在非致病水平，因此目前以卵囊减少率作为　

［Ｊ１．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７，２５（３６）：６６２５—６６３４．