hEXTL1编码的酶不能催化GalNAc连接到生长的HS链上

EXTLⅠ的酶催化受体底物专一性的研究

周跃钢（重庆理工大学药学与生物工程学院，邮编：400050）

[摘要] 目的 研究HS链的硫酸化修饰是否对EXTLⅠ的GlcNAc T活性产生影响，以及EXTLⅠ对硫酸乙酰肝素（HS）是否具

有α-1,4-GalNAc T活性。方法 构建含hEXTL

Ⅰ

的p3FLAG-CMV8表达载体并转染进入COS-7细胞，用Western blotting方法鉴

定重组COS-7细胞分泌的表达蛋白。采用同位素标记技术，研究转基因细胞株表达的EXTLⅠ在不同受体底物存在下的

α-1,4-GalNAc T和GlcNAc T活性。结果 hEXTLⅠ的转基因COS-7细胞株已被构建并获得成功表达。使用HS（

3

H放射性活性为

3

83854 dpm）或完全去磺基化的硫酸乙酰肝素（CDSNAc-HS，H放射性活性为194061 dpm）作为受体均显示了EXTLⅠ具有GlcNAc

T活性（对照的

3

H放射性活性为776 dpm），但两者的酶活性相差至少1倍。使用HS、CDSNAc-HS、Chondroitin作为受体，并

没有检测到明显的GalNAc T活性。结论 HS链的硫酸化修饰将抑制EXTLⅠ的GlcNAc T活性，该活性可能是在硫酸化修饰反应

发生前发挥作用，hEXTLⅠ不能催化GalNAc连接到生长的HS链上。

[关键词] EXTLⅠ；硫酸乙酰肝素；酶；基因表达

Characterization of receptor substrate specificity of hEXTLⅠ

Zhou Yue-Gang（College of Pharmaceutical Sciences and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400050,

）

[Abstract] Objective To investigate if sulfation of HS chain would affect its GlcNAc T activity and EXTLⅠ had α-1,4-GalNAc T

activity for heparan sulfates (HS). Methods p3FLAG-CMV8 expression vector of the truncated hEXTLⅠ was constructed and

transfected into COS-7 cells. The expressed proteins secreted from COS-7 cells were detected with Western blotting. The α-1,4-GalNAc T

and GlcNAc T activities of the expressed hEXTLⅠ for different receptor substrates were studied with

3

H labeling isotope tracing

technique.

Results H radioactivity for control, HS and

completely desulfated NAc-HS (CDSNAc-HS) were 776, 83854 and

194061 dpm, respectively. The GlcNAc T activity for receptor-CDSNAc-HS is about twice as compared with the receptor-HS.

Detectableα-1,4-GalNAc T activity was not observed when HS, CDSNAc-HS and Chondroitin were used as receptor substrates.

3

Conclusion

GlcNAc T activity of EXTLⅠ will be prevented by sulfation of HS chain. It suggests that this activity functions before

sulfation modification of HS. hEXTLⅠ cannot ligate GalNAc to HS.

Key words: hEXTLⅠ；heparan sulfate；enzyme；gene expression

细胞表面蛋白聚糖的HS（heparan sulfate）链是

糖胺聚糖（GAG）家族的一类阴离子多糖成员，在动

物的许多生物学功能中扮演了关键的作用

1-4

，其骨架

的生物合成包括连接在核心蛋白上的HS链起始四糖

片段（GlcA1-3Gal1-3Gal1-4Xyl1-O-ser）的合成、

HS链的延伸、HS链合成的终止。GlcNAcT-Ⅰ

（-GlcNAc transferaseⅠ）连接第一个-GlcNAc到

四糖片段上开始HS链的延伸过程。HS链的延伸是二

糖单位（4GlcNAc1-4GlcA1）的重复，主要由EXTⅠ

和EXTⅡ的HS-GlcAT-Ⅱ (GlcA transferase Ⅱ)和

GlcNAcT-Ⅱ (a1,4-GlcNAc transferase Ⅱ)负责催化合

成

5-6

。EXTLⅠ也具有EXTⅠ的GlcNAcT-Ⅱ活性

5,7

。

EXTLⅡ具有GlcNAcT-Ⅰ活性和-1,4-GalNAc T

(1,4-GalNAc transferase)活性，第二个酶活性催化

GalNAc连接到GlcA1-3Gal1-3Gal1-4Xyl1-O-ser

和GlcA1–3GalNAc上

5,8

，后者是硫酸软骨素（CS）

的二糖单位形式之一。由于该产物并没有在自然的

GAG链中发现，因此推测-1,4-GalNAc T活性可能

参与了GAG（如CS）链延伸的终止

8

。EXTL Ⅲ具有

GlcNAcT-Ⅰ和Ⅱ活性

5,7

。然而EXTLⅠ、Ⅱ和Ⅲ在体

内细胞中的生理意义并不是非常清楚

5

。HS链骨架的

N-去乙酰化、C

5

位的差向异构化、N-和O-硫酸化修

饰分别由不同的酶负责

5

，但HS链合成的终止机制仍

未知。已有研究暗示EXTL Ⅲ卷入了HS链合成的终

止

6,9

。因尚没有研究过EXTLⅠ的GlcNAc T活性是

否在HS链硫酸化修饰后也能发生，以及是否以HS

链为底物时也具有-1,4-GalNAc T活性，为此有必要

对EXTLⅠ的酶催化性质进行进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 载体、菌种、细胞株和主要试剂

含有hEXTL

Ⅰ

的质粒IMAGE6150218、p3FLAG-CMV8载体、

DH5细胞、COS-7细胞、CDSNAc-HS由Sugahara教授的研

究室提供。其它主要试剂来源如下：MinElute Gel Extraction

kit和MinElute PCR Purification kit (QIAGEN)、HS和

Chondroitin﹛GlcA1-(3GalNAc1-4GlcA1-)n和

GalNAc1-(4GlcA1-3GalNAc1-)n的混合物，Chn﹜

(Seikagaku Corp)、FlexiPrep kit（Amersham Biosciences）、

FuGENE™ 6转染试剂（Roche Applied Science）、ECL Advance

Western Blotting Detection kit (Amersham, RPN2135)、抗

FLAG M2亲和树脂（SIGMA）、UDP-[H]GalNAc和UDP-[H]GlcNAc

（American Radiolabled Chemicals, Inc）。

33

1.2 rhEXTL I表达载体的构建和转化进入DH5细胞

以质粒IMAGE6150218作为模板扩增缺少N-端75个氨基

酸残基的hEXTLⅠ的DNA片段

7

，扩增引物为

GCAAAGCTTCATGGTGGCAGCTGCAAC/GCAGATATCG

CTGGCTGACATGATAGG（分别接有的Hind Ⅲ/EcoRⅤ酶切

位点用粗体字显示）。扩增片段经琼脂糖凝胶电泳分离后按照

MinElute Gel Extraction kit纯化。扩增产物和p3FLAG-CMV8

载体经Hind Ⅲ/EcoRⅤ双酶切后按照MinElute PCR

Purification kit纯化，然后将扩增的hEXTLⅠ的DNA片段插

入p3FLAG-CMV8载体中构建重组rhEXTLⅠ融合表达载体。

按照Invitrogen的手册将载体转化进入DH5细胞，并进行鉴

定（质粒纯化按照Amersham Biosciences的FlexiPrep kit进行）。

制备纯化的重组rhEXTLⅠ表达载体用于转染COS-7细胞

1.3 重组rhEXTL I表达载体转染COS-7细胞

使用含有10% FBS的D-MEM (Sigma, D5796)和

FuGENE™ 6转染试剂，按照厂家的操作手册，将6.7 μg重组

rhEXTLⅠ表达载体转染COS-7细胞（培养在100 mm板上）。

转染后的COS-7细胞在37C, 5% CO

2

的条件下培养四天，收

集含有表达的rhEXTLⅠ的培养介质。

1.4 表达的rhEXTLⅠ的Western blotting

收集到的培养介质中的rhEXTLⅠ，并按照SIGMA提供

的操作手册使用抗FLAG M2亲和树脂进行纯化，纯化样品经

SDS-PAGE分离后(BIO-RAD, 浓缩胶为4% T，分离胶为12.5%

T)，按照ECL Advance Western Blotting Detection kit，用PVDF

膜(GE-healthcare)进行Western blotting鉴定，FLAG-表达蛋白

的显示和拍照使用Lumi Vision PRO 4000EX, TAITEC装置，

按照相关操作手册进行。

1.5 rhEXTLⅠ的酶催化的受体底物性质鉴定

将10 μl 抗FLAG亲和树脂（SIGMA）与1ml含酶（或

对照）培养基混合使酶吸附到树脂上，树脂颗粒随后分别用

TBST（Tris-buffered saline with 0.05% (w/v) Tween 20）和酶活

测定缓冲液

7-8

洗涤，再悬浮于酶活测定缓冲液中，参照文献

7-8

进行合成反应、合成产物的分离、合成产物中

3

H同位素标

记的检测，测定-1,4-GalNAc T或GlcNAc T活性。使用

UDP-[

3

H]GalNAc或UDP-[

3

H]GlcNAc作为供体，HS、

CDSNAc-HS或Chondroitin（Chn）作为受体。酶促反应在37°C

进行2 h。

2 结果

2.1重组rhEXTL I表达载体构建及其在COS-7细胞

中的分泌表达

预期的1.92kb的Hind Ⅲ/EcoRⅤ双酶切hEXTLⅠ的DNA

片段（图

1

）和分泌到细胞培养介质中的融合的FLAG-目标表

达蛋白（图

2

）的显示表明已成功构建了rhEXTLⅠ表达载体，

并转染了COS-7细胞，在COS-7细胞获得了表达。

2.2 rhEXTLⅠ的酶催化的受体底物专一性

N-acetylheparosan﹛(-4GlcA1-4GlcNAc1-)n﹜作为受体

（带有非还原末端的GlcA）时已证实了EXTLⅠ具有GlcNAc

T活性

7

，在研究中当使用HS或CDSNAc-HS时也再次证实了

EXTLⅠ具有GlcNAc T活性，对照、HS和CDSNAc-HS的

3

H

放射性活性分别为776 dpm、83854 dpm和194061 dpm。并且

图1 含rhEXT

LⅠ

的p3FLAG-CMV8载体的限制性酶切消化

1: Hind Ⅲ/EcoRⅤ酶切消化 2: Pst酶切消化 M: 标准

DNA分子量 (Biolabs) 箭头显示酶切产生的hEXTL

Ⅰ

基因

片段

图2 含rhEXT

LⅠ

的p3FLAG-CMV8载体在COS-7细胞中分

泌表达产物的western blotting

C: 对照（非转化子) 1和2: 含表达产物的COS-7细胞培

养介质 M: 标准蛋白质分子量 (Biolabs) 箭头显示分泌

的表达蛋白

250000

HS/UDP-GlcNAc

HS/UDP-GalNAc

200000

Chn/UDP-GalNAc

m

)

p

d

(

y

150000

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3

50000

0

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1

1

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1

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1

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‡

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ooo

nnn

图3

hEXTLⅠ基因表达的糖基转移酶的受体底物专一性

受体/供体: HS/UDP-GlcNAc, HS/UDP-GalNAc,

Chn/UDP-GalNAc. Chn : chondroitin ‡: 受体是

CDSNAc-HS 以HS, CDSNAc-HS或Chn作为底物时没有

观察到可检测到的-1,4-GalNAc T活性

CDSNAc-HS作为受体的酶活性约为使用HS时的酶活性的1

倍。使用HS、CDSNAc-HS、Chondroitin作为受体，并没有明

显检测到GalNAc T活性（图3）。这一结果与使用

N-acetylchondrosin（GlcA1-3GalNAc）作为CS受体获得的结

果

7

相似。表明不论是HS还是CS作为受体，EXTLⅠ均没有

显示出-1,4-GalNAc T活性（图3）。

3 讨论

EXTLⅡ的-1,4-GalNAc T活性被推测可能参与了GAG

链延伸的终止

8

，连接一个适当的供体底物到生长的HS链上

终止链延伸反应，随后再被酶解除去。这种可能性是存在的。

如真是按照这种方式，可能是由一种酶（可能是EXTL家族的

一个成员或其它酶）来催化一个适当的供体底物连接到生长的

HS链上终止链延伸反应，再通过另一个酶（可能是EXTL家

族的另一个成员或其它酶）来催化其降解除去。并且结构差异

可能使GAG家族的四种类型糖链（CS、HS、DS和KS）连

接的起终止反应的供体底物也不相同，链延伸的终止反应机制

可能也有差异。体外实验证实相关的酶催化活性可能是驱散覆

盖在HS等GAG链延伸终止反应上的迷雾的前提条件。

HS链的硫酸化修饰将抑制hEXTLⅠ的GlcNAc T活性这

一实验结果暗示hEXTLⅠ是在HS主链合成时, 硫酸化修饰反

应发生前发挥作用，并且hEXTLⅠ也不能催化GalNAc连接到

生长的HS链上。目前尚无足够的其它实验证据暗示EXTLⅠ

可能催化其它供体底物连接到正在延长的HS链上。故现有证

据还没有显示EXTLⅠ可能参与了HS链延伸的终止。

在HS链合成时，EXTLⅠ是以一种特殊的方式同EXTⅠ

一道发挥作用？或是在EXTⅠ不能正常发挥作用的特定生长

发育时期和特定的组织细胞内行使功能？或是具有完全不同

的另外的功能？目前尚不清楚。有证据显示EXTⅠ表达缺失的

细胞中仍有明显的较短HS链合成，EXTⅡ或EXTLⅡ再表达

缺失将显著阻断HS链的合成，EXTLⅡ的连接第一个GlcNAc

到起始四糖片段上的GlcNAcT-Ⅰ活性对于HS链的合成非常

关键

10

。因此，可以猜测EXTL的GlcNAcT-Ⅱ活性也可能替

代了EXTⅠ，参与了这些短的HS链的合成。然而需要实验来

证实。HS链的合成调节了胚胎发育和体内自动平衡过程中的

关键事件，HS链合成失控将导致一些疾病，特别是遗传性多

发性外生骨疣（HME）。HME是一种以形成多发性软骨肿瘤

为特征的显性遗传性障碍

11

。而EXTⅠ或EXTⅡ的表达失控或

突变失活则是导致遗传性多发性外生骨疣的重要原因

11-12

。

EXTLⅠ在体内细胞中的真实生理或病理意义还有待进一步的

阐明。

研究HS链的合成与修饰，并用生物技术手段来规模化合

成专一的HS片段，将可能在今后利用不同的结构专一的HS

片段（及其抗体）来反向地研究其在体内细胞表面的分布、与

发育分化和疾病发生等的关系，以及其应用前景，加快研究速

度。并可极大地缩短相关理论成果转化为生产力（如抗病毒

HS片段或其结构相似物的规模化合成）的时间。

致谢：这一研究受CSC scholarship (2006102368)和JISTEC资

助项目（2007）资助。作者感谢Sugahara教授和Dr. Mizumoto

在实验过程中给与的帮助。

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(收稿：2010-12-07；修回：2011-)

(编辑 张维)