壬二酸在制备抗急性髓系白血病和化疗增敏药物中的应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.4

(22)申请日 2016.12.27

(71)申请人 武汉大学

地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学

(72)发明人 周芙玲 潘运宝 金艳霞 丁路 刘盼

(74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)

代理人 张火春

(51)

A61K31/20

A61K31/7068

A61P35/02

(10)申请公布号 CN 106580942 A

(43)申请公布日 2017.04.26

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

壬二酸在制备抗急性髓系白血病和

化疗增敏药物中的应用

(57)摘要

本发明公开了壬二酸（AZA）制备

抗急性髓系白血病（AML）和化疗增敏药

物中的应用。经实验证明，AZA对多种

AML细胞株

（U937,THP‑1,KG‑1,NB4,and HL‑60）

具有杀伤作用，抑制这些AML细胞增

殖，同时诱导细胞凋亡，与阿糖胞苷

（Arac）联用，能促进Arac对AML细胞

的杀伤作用。AZA无毒副作用，价格为大

多数患者所接受，与化疗药物阿糖胞苷

（Arac）联用，一方面能促进阿糖胞苷

（Arac）对AML细胞的杀伤作用，另一方

面，能减少Arac剂量，减轻化疗毒副作

用，将为治疗和治愈急性髓系白血病提供

一种新的途径和手段。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.壬二酸在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为以壬二酸为活性成分,加入一

种或多种药学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填

充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜

味剂及色素。

3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为增加急性髓系白血病细胞对

阿糖胞苷敏感性的增敏剂。

4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为一种抗急性髓系白血病药物

组合物,该组合物含有药学上有效量的壬二酸和药学上有效量的阿糖胞苷及药学上

可接受的载体。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的应用,其特征在于,所述药物被制成任何一种药

学上可接受的剂型。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述任何一种药学上可接受的剂型选自片

剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。

说 明 书

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物领域,具体涉及壬二酸在制备抗急性髓系白血病和化疗增敏

药物中的应用。

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是血液系统最常见的恶性肿瘤,属于一

类造血系统组织的克隆性恶性疾病。急性髓系白血病的诱导方案始终以蒽环类抗生

素联合标准剂量阿糖胞苷(Arac)为基础,化疗后可出现骨髓抑制、胃肠道毒性、心脏

毒性等毒副反应。此外,还存在化疗耐药,我们前期研究工作发现在AML复发患者

总体抗氧化能力(T-AOC)降低,体内ROS水平显著增加,并且8-OHdG这一公认的氧

化DNA损伤标志物也显著增加^[1]。此外,随着ROS水平增加,促进NK、

T细胞的凋亡,白血病细胞通过逃逸细胞介导的免疫从而大量增殖^[2]。

如何提高疗效,减轻化疗毒副作用,保证患者生活质量,提高生存率是需要解决的问题。

壬二酸(Azelaic Acid,AZA)是9碳直链饱和二元酸,别名杜鹃花酸,分子式

C₉H₁₆O₄和

(CH₂)₅(CH₂COOH)₂。壬二酸是

一种无毒无害的物质^[3],AZA在临床上主要用于皮肤痤疮的治疗;已被

证明AZA能抗人皮肤恶性黑色素瘤^[4]、人脉络膜黑色素瘤

^[5],目前认为其抗癌作用的机理是清除氧自由基和抑制多种氧化还原酶,

并且AZA是硫氧还蛋白Trx蛋白的抑制剂^[6]。但其在急性髓系白血病

中的作用尚未见报道。

参考文献

[1]Zhou,F.L.,,,et al.,Involvement of oxidative stress in the relapse of

acute myeloid leukemia.J Biol Chem.2010;285(20):15010-5.10.1074/jbc.M110.103713.

[2]Zhou,F.L., ,Novel roles of reactive oxygen species in the

pathogenesis of acute myeloid leukemia.J Leukoc Biol.2013;94(3):423-

9.10.1189/jlb.0113006.

[3]Breathnach AS:Azelaic acid:potential as a general antitumoural l

hypotheses 1999,52(3):221-226.

[4]Zaffaroni N,Villa R,Silvestro L,Sanfilippo O,Silvestrini R:Cytotoxic activity of azelaic

acid against human melanoma primary cultures and established cell ncer

research 1990,10(6):1599-1602

[5]Breathnach AS,Robins EJ,Patzold HC,Bhasin YP,Ethridge LB,Garner A,Nazzaro-

Porro M:Effect of dicarboxylic acids(C6 and C9)on human choroidal melanoma in cell

igative ophthalmology&visual science 1989,30(3):491-498.

[6]Y UT,Furuke K,Masutani H,Nakamura H,Yodoi J:Cell cycle inhibition of HTLV-I

transformed T cell lines by retinoic acid:the possible therapeutic use of thioredoxin

reductase gy research 1995,7(3-4):183-189.

发明内容

本发明要解决的问题是提供壬二酸的新用途,即在制药中的新应用。

本发明的目的是提供壬二酸在制备抗急性髓系白血病和化疗增敏药物中的应用。

进一步地,本发明提供一种以壬二酸为活性成分的抗急性髓系白血病药物,需要的时

候,还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域常规的稀释

剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定

剂等,必要时还可以加入香味剂、甜味剂及色素等。

所述的药物可以为本领域的常用药物剂型,例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、

缓释制剂、纳米制剂、注射剂等等。

进一步地,本发明提供一种抗肿瘤药物组合物,该组合物含有药学上有效量的壬二酸

和药学上有效量的抗急性髓系白血病药物及药学上可接受的载体。

所述药学上有效量的抗急性髓系白血病药物是阿糖胞苷(Ara-c)。

本发明检测了壬二酸对多株AML细胞株(U937,THP-1,KG-1,NB4,and HL-60)的杀伤

作用,发现AZA能呈剂量和时间依赖性抑制这些细胞的活力;其次,采用软琼脂糖克

隆形成实验,发现AZA能抑制这些AML细胞的克隆增殖;利用Annexin-V/PI染色,

通过流式细胞仪检测,发现AZA能诱导AML细胞的凋亡。由于阿糖胞苷(Ara-C)是

治疗AML的经典化疗药物,本发明也探索了AZA对Ara-C的疗效的影响,通过

Alamar Blue实验,发现AZA能够促进Ara-C杀伤AML细胞的疗效;通过Western

Blot实验,发现AZA能够诱导凋亡标志物(C-PARP),同时也能抑制Jab1,p-Akt,Trx的

蛋白量。通过Alamar Blue实验,我们发现抑制AML细胞株内的Jab1水平后,细胞

对AZA更加敏感,提示AZA可能通过Jab1机制杀伤AML细胞。

本发明提出一种治疗急性髓系白血病(AML)的新药物——壬二酸,该药物无毒副作

用,价格为大多数患者所接受,与化疗药物阿糖胞苷(Arac)联用,一方面能促进阿糖胞

苷(Arac)对AML细胞的杀伤作用,另一方面,能减少Arac剂量,减轻化疗毒副作用。

附图说明

图1采用MTT的方法检测了壬二酸对多种AML细胞株(U937,THP-1,KG-

1,NB4,and HL-60)的杀伤作用。

图2A软琼脂糖克隆形成实验观察AML细胞的克隆形成。

图2B利用Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测AZA对AML细胞凋亡的影响。

图3 AZA能够促进AraC对AML细胞的杀伤作用。

图4 AZA对C-PARP、Jab1,p-Akt,Trx蛋白表达量的影响。

图5抑制AML细胞株内的Jab1表达后影响AZA对AML细胞的杀伤作用。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例

仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

一、细胞株:人急性髓系白血病M5细胞株(U937,THP-1,MOLM-13),M3细胞株(HL-

60),M6细胞株(KG-1),以上细胞株均从ATCC(Manassas,VA)获得。

二、试剂:RPMI-1640培养液(Invitrogen,Carlsbad,CA),IMDM培养液

(Invitrogen,Carlsbad,CA),10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA),L-谷氨酸

(Invitrogen,Carlsbad,CA),PARP(BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA,USA),Jab1

抗体(Santa Cruz,CA,USA),p-Akt抗体(Santa Cruz,CA,USA),T-Akt抗体(Santa

Cruz,CA,USA),β-actin抗体(Sigma-Aldrich,,MO,USA),Annexin V/PI试剂盒

(BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA,USA),Alamar blue检测试剂

(Invitrogen,Carlsbad,CA),ECL化学发光增强试剂(Bio-Rad,Hercules,CA),AZA(Sigma-

Aldrich,Inc,,MO),DMSO(Sigma-Aldrich,Inc,,MO),MTT(Sigma-

Aldrich,Inc,,MO),Nucleofector Kit V(Amaxa Biosystems,Lonza,Allendale,NJ)

【实施例1】MMT法检测壬二酸对多种AML细胞株的杀伤作用

将U937、THP-1、MOLM-13、U937、THP-1、MOLM-13、KG-1细胞种植在96孔

板上面,各100μL 6×10⁴个/mL的细胞,分别加入0、1.25、2.5、5、

10mM>

如图1所示,AZA能呈剂量和时间依赖性抑制这些细胞的活力。

【实施例2】软琼脂糖克隆形成实验

将AML细胞(U937、THP-1、MOLM-13、U937、THP-1、MOLM-13、KG-1)种植

在六孔板上面,先将2ml包含0.7%琼脂的培养基倒入六孔板,待琼脂凝固,每孔加入

1ml含有5000个细胞的0.35%琼脂的培养基,每次更换3ml指定AZA浓度的新鲜培

养基,孵育14天后剩余细胞数>50的样本进行计数处理。

如图2A所示,AZA能抑制这些AML细胞的克隆增殖。

【实施例3】流式检测AZA对AML细胞细胞凋亡的影响

将1×10⁵-1×10⁷的细胞放入1.5ml>

【实施例4】AZA

能够促进AraC对AML细胞的杀伤作用

在96孔板中每孔接种1×10⁴个AML细胞(U937、THP-1、MOLM-13、

U937、THP-1、MOLM-13、KG-1),AML细胞使用Ara-c(5μM),AZA(5mM),或者两

者联合处理((5μM>

【实施例5】Western Blot实验检测AZA对C-PARP、

Jab1,p-Akt,Trx的蛋白量的影响

细胞通过PBS清洗、收集之后,使用RIPA裂解,在离心后总蛋白储存在-80°C环境

中,蛋白质浓度使用蛋白浓度试剂盒检测,等量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺

凝胶电泳(15%SDS-PAGE),转膜到PVDF膜(Millipore corp),5%脱脂牛奶浸没PVDF

膜,室温摇床上封闭2h。按PARP,Jab1,p-Akt,T-Akt and β-actin抗体说明书4°C过夜

孵育,将膜与辣根过氧化物酶标记抗体室温孵育1h,最后用SuperSignal West Pico

Chemiluminescent HRP Substrate(Thermo)检测。

如图4所示,AZA能够诱导凋亡标志物(C-PARP),同时也能抑制Jab1,p-Akt,Trx的蛋

白相对表达量。

【实施例6】Alamar Blue实验检测抑制AML细胞株内的Jab1表达后是否影响

AZA对AML细胞的杀伤作用

用Nucleofector Kit V(Amaxa Biosystems,Lonza,Allendale,NJ)将siRNA对AML细胞

进行转染,抑制AML细胞株内的Jab1水平后,通过Alamar Blue实验,如图5所示,发

现AML细胞对AZA更加敏感,提示AZA可能通过Jab1机制杀伤AML细胞。