成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化_百

2024 年 3月

第 61 卷 第 2 期

四川大学学报（自然科学版）

Journal of Sichuan University （Natural Science Edition）

Mar. 2024

Vol. 61 No. 2

成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞

体外增殖、迁移和成骨分化

2

杨雅丽

1，

， 司琪琦

1

， 王思瑜

1

， 周嘉裕

1

， 郭泰林

2

（1.西南交通大学生命科学与工程学院， 成都 610031； 2.西南交通大学医学院， 成都 610031）

摘 要

:

为探究成骨细胞（OBs）线粒体移植对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨分化的影

响，本研究体外人工提取BMSCs线粒体和OBs线粒体，分别移植入受体BMSCs.实验结果发

现，接受成骨细胞线粒体的BMSCs表现出显著增强的增殖、迁移、抗凋亡和成骨能力.此外，

接受成骨细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平降低、氧气消耗速率上调、ATP产量增加.以

上结果表明，（1）成骨细胞线粒体移植能够增强体外BMSCs功能，促进其向成骨分化；（2）相

较于接受骨髓间充质干细胞线粒体，接受成骨细胞线粒体移植的受体BMSCs具有更强的有

氧代谢能力以及更强的成骨分化能力，有望为骨生长与骨损伤修复提供一种候选方法.

关键词

:

线粒体移植； 骨髓间充质干细胞； 成骨细胞； 成骨分化； 代谢

中图分类号

:

Q599

文献标志码

: A

DOI

:

10.19907/j.0490-6756.2024.026001

Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes proliferation，

migration and osteogenic differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell in vitro

2

YANG Ya-Li

1，

， SI Qi-Qi

1

， WANG Si-Yu

1

， ZHOU Jia-Yu

1

， GUO Tai-Lin

2

（ of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 6100031， China；

of Medicine， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China）

Abstract

:

To explore the effect of mitochondrial transplantation of osteoblasts （OBs） on osteogenic differen‑

tiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）， this study artificially extracted BMSCs mitochon‑

dria and OBs mitochondria in vitro and transplanted them into recipient BMSCs experimen‑

tal results showed that BMSCs receiving osteoblast mitochondria showed significantly enhanced proliferation，

migration， anti-apoptosis and addition， the level of intracellular ROS in BMSCs receiving os‑

teoblast mitochondria decreased， the rate of oxygen consumption increased， and ATP production increased.

These results indicated that：（ 1） Mitochondrial transfer can enhance the function of BMSC in vitro and pro‑

mote its osteogenic differentiation；（ 2） Compared with bone marrow mesenchymal stem cell mitochondria，

recipient BMSCs receiving osteoblast mitochondrial transplantation may have stronger aerobic metabolic ca‑

pacity and osteogenic differentiation ability， which is expected to provide a candidate method for bone growth

and bone injury repair.

Keywords

:

Mitochondria transplantation； Bone marrow mesenchymal stem cells； Osteoblasts； Osteogenic

differentiation； Metabolism

收稿日期

:

基金项目

:

作者简介

:

通讯作者

:

2023-02-13

四川省科技厅应用基础研究项目（Q114321S01003）

杨雅丽（1998-）， 女， 陕西商县人， 硕士研究生， 研究方向为代谢与骨组织工程.E-mail： yangyali0331@

周嘉裕.E-mail： spinezhou@

026001-1

第 2 期杨雅丽，等： 成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化

第 61 卷

1　引言2　材料与方法

2.1 材 料

1-2 w Sprague Dawley大鼠（成都达硕实验动

物有限公司，中国）.

2.2 方 法

2.2.1　细胞提取、培养及传代 采取断颈法处死

大鼠，提取骨髓间充质干细胞：剪下大鼠的后腿股

骨，用针管将细胞从骨髓腔中吹出，在配置好的

α-MEM培养基（90% α-MEM培养基+10%

FBS+1%双抗）中培养；提取OBs：剪下大鼠的头

盖骨，用刮刀轻轻的将头盖骨刮至透明状态，放入

α-MEM培养基（同上）培养.细胞在培养箱（37 ℃，

5%，CO

2

）中培养，2~3 d换一次培养基.细胞生长

至80%~90%，进行传代培养：去除培养基，加入

胰蛋白酶（0.25%，含1 mmol/L EDTA）消化下来

后离心（1200 r/min，5 min），除去上清液至培养瓶

中继续培养

［14］

.所有实验均使用3~5代的细胞.

2.2.2　线粒体提取和移植 使用线粒体提取试

剂盒Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Tis‑

sue and Cultured Cells（Biovison，美国）提取线粒

体.将受体细胞和供体细胞都接种在6孔板中（10

万/孔），供体细胞长至融合度80%~90%时消化

供体细胞.加入1 mL线粒体分离缓冲液并用注射

器吹打5 s，加入10 µL试剂A，冰上孵育5 min.4 ℃

下以600 g离心10 min，收集到的上清液在4 ℃下

以7000 g离心10 min，将得到的线粒体使用培养基

重悬后加入受体细胞，缓慢均匀摇晃促进线粒体

进入

［11］

.

2.2.3　线粒体、细胞骨架荧光染色 用不含血

清、酚红的DMEM培养基（Sigma，美国）稀释线粒

体绿色荧光探针MitoGreen（江苏凯基生物，中国）

原液至500 nmol/L.供体细胞接种在6孔板中

（10万/孔），每组设置三个平行样，待供体细胞长

至融合度80%~90%时消化供体细胞.用预热的

染色液悬浮细胞，37 ℃孵育30 min.完成染色后，

避光提取线粒体，转移至受体细胞中共同培养24

h.消化受体细胞后用无血清、无双抗的DEME培

养基重悬（1×10

6

细胞/mL），每孔加入100 µL ，20

µg/mL鬼笔环肽-罗丹明（Sigma，美国）进行细胞

骨架染色.避光室温孵育30 min，离心弃上清，用

PBS悬浮细胞，重复两次以上洗涤步骤后每个样

随机选取5个视野使用荧光显微镜（FV1000，

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床上

2］

常见的病症

［1，

.间充质干细胞（MSCs）是一种多

能、自体更新的成体干细胞，可分化为多种组织

［3］

.

骨髓间充质干细胞（BMSCs）易于从骨髓中分离，

并可以在体外扩增到足够数量用于临床应用

［4］

，因

此被认为是骨组织工程中很好的治疗工具.然而，

在体外长期分离培养后，BMSCs的功能特性可能

会受损

［5］

，因此修饰BMSCs以增强其功能已成为

干细胞介导的骨组织再生研究的主要焦点.

成骨细胞谱系细胞包括骨髓间充质干细胞、

前成骨细胞、成骨细胞（OBs）（通常称为成熟成骨

细胞）、骨内衬细胞和骨细胞.骨健康取决于成骨

细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间

的动态平衡

［6］

.成骨细胞源于骨髓间充质干细胞，

成熟的成骨细胞分化后形成骨基质并开始矿化形

成骨组织.成骨细胞是骨重塑的基础，对骨骼的生

长和维持至关重要.

能量代谢是从营养物质中产生能量（即ATP）

的过程

［7］

.这一过程对于维持细胞稳态和对不同条

件作出反应是必不可少的.细胞需要能量来生长

和维持，并且已经进化成具有多种产生能量的途

9］

径

［8，

.遗传和功能研究都表明，能量代谢，如葡萄

糖、脂肪酸和氨基酸代谢，在骨细胞（包括成骨细

胞、骨细胞和破骨细胞）的形成和功能中起着重要

作用

［10］

.

此前有文献证明移植骨髓间充质干细胞线粒

体增强了干细胞的增殖、迁移以及成骨分化能

力

［11］

.在骨骼发育和重塑的过程中成骨细胞发挥

重要功能

［12］

，有研究证实成骨细胞比骨髓间充质

干细胞更依赖糖酵解产生能量，其中的线粒体

DNA的拷贝数、呼吸酶的蛋白亚基、耗氧率和

ATP含量均有所增加

［13］

.然而，有关成骨细胞线粒

体移植对于干细胞分化影响有关的研究尚未见

报导.

为了探究不同来源线粒体移植对干细胞增殖

和分化的影响，实验同时设置了3个组别，采用体

外人工提取骨髓间充质干细胞线粒体和成骨细胞

线粒体的方法，分别移植入受体骨髓间充质干细

胞，通过CCK-8，RT-qPCR，Western Blot等手段评

估不同来源线粒体移植对BMSCs增殖、迁移以及促

成骨能力的影响，以期为进一步探究改善提供参考.

026001-2

第 61 卷四川大学学报（自然科学版）

第 2 期

Olympus，日本）进行观察并拍照.

2.2.4　流式细胞术 为了进行定量验证，在分离

前使用浓度为500 nmol/L的MitoGreen FM（吸

收/发射=530 nm/590 nm）标记供体OBs中的线

粒体（方法同上2.2.3）.使用BD Accuri C6 Plus流

式细胞仪（Becton Dickinson，美国）对受体BMSCs

进行定量，每组设置三个平行样，每个样本至少有

10 000个细胞，使用FlowJo软件分析FITC发射区

的平均荧光强度（MFI）.

2.2.5　CCK-8 按实验组别在96孔板中接种接

受了线粒体移植后的受体细胞（1万/孔），每组设

置三个复孔.培养24 h后每孔加入10 μL的CCK-

8溶液（DOjinDO，中国上海），孵育2 h后用酶标仪

（SPECTROstar Nano，BMG LABTECH，德国）测

定450 nm处的吸光度.对照组和实验组分别以空

白组为参照，用公式计算细胞存活率=［（As-

Ab）］×100%（As：对照孔/实验孔吸光度；Ab：空

白孔吸光度），得到的数据使用GraphPad Prism 8

软件分析制作直方图.

2.2.6　细胞划痕 按组别在6孔板中接种接受了

线粒体移植后的受体细胞进行培养，每组设置三

个复孔，待细胞生长至80%~90%左右时，在每孔

的中间用1 mL移液枪枪头轻轻划一道粗细相同的

空隙.将孔板放至光学显微镜下拍照（10

×

）后继续

放入培养箱培养，48 h后再次拍照（10

×

），对比每

组别细胞迁移情况.

2.2.7　细胞凋亡 按组别在6孔板中接种接受了

线粒体移植后的受体细胞进行培养，每组设置三

个复孔，待细胞生长至80%~90%时收集细胞上

清.向孔板中加入胰蛋白酶（0.25%）消化细胞，

2~5 min后用收集的上清终止消化收集细胞；用

PBS清洗细胞两次后用DAPI染色液（Biosharp，中

国安徽）和细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-

EGFP/PI Cell Apoptosis Detection kit （Service‑

bio，中国武汉）处理，随后在每个样随机选取5个

视野在荧光显微镜下用三色滤光片进行观察，

DAPI呈蓝色荧光信号，Annexin V-EGFP呈绿色

荧光信号，PI呈红色荧光信号.

2.2.8　RT-qPCR 按组别在6孔板中接种接受了

线粒体移植后的受体细胞，每组三个平行样，分别培

养4，7，14 d.培养结束后加入Trizol试剂（Life

Technologies，美国）提取RNA.使用逆转录试剂盒

（Thermo Fisher，美国）按照一定的体系逆转录（25 ℃，

5 min→42 ℃，60 min→70 ℃，5 min→4 ℃，∞）为

cDNA.通过 NCBI（https：//.

gov/）查找所需目的基因序列，使用 Primer-BLAST

设计目的基因的引物序列，引物由擎科生物科技有

限公司（成都）进行合成.引物序列见表1.以逆转录

得到的 cDNA为模板链，在ABI QuantStudio3实时

聚合酶链式反应系统（CFX96，Bio-rad，美国）上进行

定量实时聚合酶链式反应｛95 ℃，5 min→（95 ℃，15 s →

60 ℃，1 min）循环39次→70 ℃到95 ℃梯度升温

［15］

（0.02 ℃/s）｝

.

表1　实时定量聚合酶链式反应引物序列

Tab.1　RT-qPCR primer sequences

基因名（Gene name）

GAPDH

Osteopontin （OPN）

Osteocalcin（OCN）

RUNX family transcription factor 2 （Runx 2）

Alkaline phosphastase （ALP）

上游引物序列（5′→3′）

CCCTTAAGAGGGATGCTGCC

CTTGCTTGGGTTTGCAGTCTT

CCGTTTAGGGCATGTGTTGC

AATTAACGCCAGTCGGAGCA

GGGCCTGCTCTGTTTCTTCA

下游引物序列（5′→3′）

TACGGCCAAATCCGTTCACA

GCCACTGCAGGCTTACCTTG

TTTCGAGGCAGAGAGAGGGA

CACTTCTCGGTCTGACGACG

CTGAGATTCGTCCCTCGCTG

2.2.9　Western Blot 按组别在6孔板中接种接

受了线粒体移植后的受体细胞，每组三个平行样，

分别培养4，7，14 d.培养结束后每孔加入 120~

150 μL RIPA裂解液（Boster，美国），1%广谱蛋白

酶抑制剂（Boster，美国）和1% PMSF（Boster，美

国）裂解蛋白.加5× loading buffer（Boster，美国）

95 ℃水浴10 min.总蛋白提取液（30 μg）经10%

（w/v）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分

离后，转移到PVDF膜上.用5%（w/v）的脱脂牛

奶封闭膜，在4 ℃下与Runx2鼠源一抗（1∶100，sc-

390351，SANTA CRUZ，美国），β-actin鼠源一抗

（1∶5000，bam-33036M，Bioss，中国北京）孵育过

夜，然后羊抗鼠二抗（1∶5000，BA1054，Boster，美

国）孵育2 h.使用Clarityt

TM

Western ECL Sub‑

strate（BIO-RAD，美国）进行显色，适当时间后用

凝胶成像系统（ChemiDoc MP，Bio-rad，美国）进行

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第 2 期杨雅丽，等： 成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化

第 61 卷

放射自显影.蛋白质表达水平归一化为β-actin.

2.2.10　茜素红染色 按组别在6孔板中接种接

受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设

置三个复孔.将培养板放在培养箱预培养（37 ℃，

5%，CO

2

的条件下）培养.贴壁后更换成骨诱导培

养基（100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷

［16，17］

酸钠、50 μmol/L抗坏血酸），培养14 d后每组

混匀配置成检测液.培养好的贴壁细胞中的培养

基置换为配置好的检测液，置放入37 ℃，无CO

2

细

胞培养箱培养60 min后加入药物（A孔加入

20 μL，15 μmol/L oligomycin，B孔加入22 μL，

15 μmol/L FCCP，C孔加入25 μL，2.5 μmol/L

FCCP ，D孔加入207 μL，5 μmol/L FCCP）.上机

运行XFp Cell Mito Stress Test实验.

2.2.14　统计分析 本研究通过t检验（Graph‑

pad， Version 8.0， SanDiego， CA， USA）比较两

组的数据，通过Tukey多重比较检验及方差分析

（ANOVA）对多组间数据进行分析.P＜0.05表示

差异具有统计学意义.

随机选取5个视野在光学显微镜下拍照观察细胞

密度，随后用PBS清洗，加入95%乙醇固定15

min，每孔加入1 mL，1%的茜素红（源叶生物，中

国上海），室温放置30 min，对细胞进行染色后用体

式显微镜（SG-700，萨伽，中国苏州）观察.

2.2.11　碱性磷酸酶染色 按组别在6孔板中接种

接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设

置三个复孔.贴壁后更换成骨诱导培养基（100 nmol/L

地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏

血酸）培养14 d后每组随机选取5个视野在光学显微

镜下拍照观察细胞密度，随后移除培养基，加入95%

乙醇，固定15 min.用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色

试剂盒（碧云天，中国上海）进行染色，每孔加入1 mL

BCIP/NBT染色工作液，室温避光孵育30 min，去除

BCIP/NBT染色工作液，用体式显微镜（SG-700，萨

伽，中国苏州）观察.

2.2.12　ROS 按组别在6孔板中接种接受了线粒

体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置3个复孔.

待细胞生长至80%~90%时，用无血清α-MEM培养

基（1%双抗）稀释活性氧检测试剂盒（YEASEN，中

国上海）中的DCHA-DA，使其终浓度为10 mmol/L.

每孔加入1 mL稀释好的DCFH-DA工作液，37 ℃培

养箱避光孵育30 min；用无双抗α-MEM培养基（10%

胎牛血清）洗涤细胞1~2次后每个样随机选取5个视

野使用荧光显微镜（488 nm激发波长，525 nm发射波

长）观察并拍照.

2.2.13　细胞线粒体压力测定 实验前一天预热

海马生物能量测定仪（Agilent Seahorse XFp，Sea‑

horse，美国）；在前一天专用Seahorse XFp 细胞培

养板（Agilent Seahorse XFp，103025-100，美国）中

按组别加入BMSCs（1万/孔），每组三个平行样.

实验当天，从Seahorse XF DMEM Medium

（103575-100）中分装出9.7 mL，向其中分别加入

100 μL glucose、100 μL pyruvate、100 μL glutamine

3　结果

3.1　成骨细胞线粒体在体外成功移植入骨髓间

充质干细胞

为了验证从成骨细胞中提取的线粒体能否有效

地移植到骨髓间充质干细胞中，在提取线粒体前用

MitoGreen标记供体成骨细胞中的线粒体（图1a）供

体细胞/受体细胞比例为1∶1）.线粒体移植24 h后，

染受体细胞的细胞骨架（图1b），然后在荧光显微镜

下进行观察，在受体细胞出观察到了供体线粒体的

荧光（图1c）.这表明来自成骨细胞中的线粒体能够

成功移植进入受体细胞.

用流式细胞术检测线粒体成功移植的效率，线

粒体在分离前也用MitoGreen标记，受体细胞或对照

细胞的平均荧光强度通过FACS定量.对照组中阳

性细胞的百分比设定为0.15%，接受成骨细胞线粒

体移植的受体细胞阳性率为34.1% （图1d），表示

受体细胞中34.1%成功移植了线粒体.

3.2　成骨细胞线粒体移植增强骨髓间充质干细

胞的体外增殖、迁移、抗凋亡能力

骨髓间充质干细胞需要很强的增殖能力才可

以有足够的数量治疗骨缺损，本实验研究了成骨

细胞线粒体移植对体外培养的骨髓间充质干细胞

增殖能力的影响.在移植线粒体24 h后进行

CCK8检测，移植了线粒体的细胞的增殖能力比未

移植线粒体的细胞强，其中，接受成骨细胞线粒体

的细胞（实验组）的增殖能力比接受骨髓间充质干

细胞线粒体的细胞（对照组）的增殖能力增强了

21.5%（图2a）.

026001-4

第 61 卷四川大学学报（自然科学版）

第 2 期

图1　线粒体成功移植入受体细胞

（a，b，c）免疫荧光染色（n=3）；（d）流式细胞术分析每组受体细胞内标记线粒体的数量（显示为每个细胞的荧光强度）（n=3）

Fig.1　Successful mitochondrial transplantation was tested by fluorescence staining

（a，b，c） Immunofluorescence staining （n=3）；（ d） Flow cytometry was used to analyze the number of labeled mitochondria in each group of

recipient cells （shown as fluorescence intensity per cell）（ n=3）

图2　线粒体移植促进BMSCs生长，迁移，抑制凋亡

（a） CCK-8分析结果（n=3）（

P<0.01）；（b） 细胞凋亡染色以及DAPI细胞核染色（n=3）；（c） 细胞划痕实验检测细胞迁移能力（n=3）

**

Fig.2　Mitochondrial transplantation promoted the growth， migration and apoptosis of BMSCs

（a） Results of CCK-8 analysis （n=3）（

**

P<0.01）；（ b） Apoptosis staining and DAPI nuclear staining （n=3）；（ c） Cell migration ability

was detected by cell scratch assay （n=3）

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第 2 期杨雅丽，等： 成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化

第 61 卷

由于MSCs在体外长期或连续传代培养后可

能凋亡，本实验研究了成骨细胞线粒体移植是否

可以抑制骨髓间充质干细胞的凋亡.线粒体移植

后，第6~8代的细胞进行DAPI和Annexin V-

EGFP/PI染色，观察到未转入线粒体的细胞处于

凋亡晚期，转入骨髓间充质干细胞线粒体的细胞

处于凋亡早期，而转入了成骨细胞线粒体的细胞

未发生凋亡（图2b）.因此，成骨细胞移植能够有效

抗凋亡.

骨髓间充质干细胞有足够的迁移能力才能迁

移到骨缺损部位进行骨修复，为了测试受体细胞

的迁移能力，本研究做了细胞划痕实验.在细胞长

至融合度80%~90%时，在三个组别划同样宽度

的划痕，48 h后在倒置显微镜下观察细胞迁移情

况，发现接受成骨细胞线粒体的实验组迁移能力

最强，接受骨髓间充质干细胞的对照组次之，空白

组迁移能力最弱（图2c）.因此，成骨细胞线粒体移

植显著促进了BMSCs的迁移，综上结果表明其可

能通过促进干细胞增殖、迁移、抗凋亡而在组织修

复中发挥积极作用.

3.3　成骨细胞线粒体移植提高骨髓间充质干细

胞体外成骨能力

Alp、Ocn、Opn与Runx2是骨髓间充质干细胞

成骨分化的标记基因.因此，分别在线粒体移植第

4，7，14 d进行mRNA表达水平的RT-qPCR检测，

结果表明，随着时间的增加，转录水平增加，且第7

天接受成骨细胞线粒体移植的骨髓间充质干细胞

的Alp表达水平比接受干细胞线粒体的骨髓间充

质干细胞的Alp表达水平高38.1%，Runx2表达水

平提高了39.9%（图3a）.对Runx2进行蛋白水平

的Western Blot验证，同样观察到第7天实验组中

Runx2的表达水平比对照组高42.2%（图3b）.

图3　成骨细胞线粒体移植促进BMSCs成骨发育

（a） RT-qPCR分析成骨标志基因的表达；（b） Western Blot检测成骨分化蛋白Runx2的表达（n=3）（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

Fig.3　Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes osteogenic development of BMSCs

（a） The expression of osteogenic marker genes was analyzed by RT-qPCR；（ b） Western Blot analysis of Runx2 expression （n=3）（ *P<

0.05，

**

P<0.01，

***

P<0.001）

地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸盐的化学

混合物可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成

骨细胞.在线粒体移植后，用成骨分化培养基培养

细胞14 d，在光学显微镜下观察到细胞密度相当

（图4a，c），随后对其进行茜素红染色和碱性磷酸

酶染色（图4b，d），结果表明成骨细胞线粒体移植

提高了骨髓间充质干细胞的体外成骨能力.

3.4　成骨细胞线粒体移植减少受体细胞的ROS

水平、增加ATP生成

线粒体是细胞产生能量的主要场所，为了揭示

线粒体移植后细胞增殖、迁移能力和成骨分化增强

的潜在机制，对成骨细胞线粒体移植后细胞ROS水

平和线粒体功能进行了检测.ROS荧光染色结果显

示，相较于空白组和对照组，移植了成骨细胞线粒体

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第 61 卷四川大学学报（自然科学版）

第 2 期

的实验组细胞产生的ROS最少（图5a），表明移植成

骨细胞线粒体有助于减少胞内ROS水平.使用海马

生物能量测定仪对三个组别进行线粒体压力水平测

定，结果（图5b）表明，移植了成骨细胞线粒体的细胞

OCR（氧气消耗速率）最大，同时ATP生成率、基础

呼吸率、最大呼吸率也最高，其中实验组ATP生成率

比对照组高50.1%，实验组的基础呼吸率比对照组

高71.9%，表明移植了成骨细胞线粒体的BMSCs线

粒体功能最优.结果表明，线粒体移植能够增加细胞

的有氧代谢水平和线粒体ATP的产生.

图4　成骨细胞线粒体移植促进BMSCs成骨发育

（a） 茜素红染色前显微镜下照片；（ b） 茜素红染色；（c） 碱性磷酸酶染色前显微镜下照片；（d） 碱性磷酸酶染色（n=3）

Fig.4　Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes osteogenic development of BMSCs

（a）Microscopic photographs before alizarin red staining；（ b） Alizarin red staining；（ c） Microscopical photograph before alkaline phosphatase

staining；（ d） Alkaline phosphatase staining （n=3）

图5　海马生物代谢仪检测线粒体功能

*****

（a） ROS染色；（b） 线粒体压力检测（n=3，

*

P<0.05，P<0.01，P<0.001）

Fig.5　Mitochondrial function was measured by hippocampal biometrics

（a） ROS dyeing；（ b） Mitochondrial pressure detection （n=3，

*

P<0.05，

**

P<0.01，

***

P<0.001）

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第 2 期杨雅丽，等： 成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化

第 61 卷

4　讨论与结论

本实验分别将骨髓间充质干细胞和成骨细胞

的线粒体移植入受体骨髓间充质干细胞，并评估

其对细胞功能变化的影响.（1）通过CCK8、细胞划

痕和细胞凋亡实验可得出结论，成骨细胞线粒体

移植可以显著增加体外BMSCs的增殖、迁移和抗

凋亡能力.增强BMSCs的功能是优化干细胞介导

的骨修复的关键，增加的增殖能力使MSCs能够在

体外扩增到足够数量，用于临床移植；增强的迁移

能力使MSCs能够迁移至损伤部位；抗凋亡能力使

MSCs抵抗老化带来的对生存和功能的影响.（2）

RT-qPCR结果表明，成骨细胞线粒体移植能够有

效促进ALP等成骨相关指标基因表达水平的提

高；由于OCN与OPN为分泌型蛋白，因此，我们选

用位于细胞内部的Runx2作为成骨标志蛋白，

Western Blot结果同样表明其含量增加；茜素红可

以与钙发生显色反应，反应体外细胞钙结节沉淀

情况，侧面说明成骨分化程度；ALP是成熟后成骨

细胞的标识酶，成骨细胞内的ALP酶在碱性条件

下能被水解成萘酚，而萘酚能与重氮盐物质结合

形成不溶于水的蓝色沉淀物

［18］

.以上结果从基因

及蛋白质等层面均证实成骨细胞线粒体移植有利

于MSCs成骨分化.（3）ROS荧光染色和海马生物

能量代谢仪检测线粒体压力结果表明，移植骨髓

间充质干细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平

降低、氧气基础消耗速率较空白组上调了96.3%、

ATP产量增加了80.7%，与前人的实验结果吻

合

［11］

.同时证实移植成骨细胞线粒体较骨髓间充

质干细胞线粒体的受体细胞线粒体功能更优，氧

气基础消耗速率上调了71.9%、ATP产量增加了

50.1%.

本研究观察到干细胞功能的变化，可能有以

下几个的原因.首先，细胞在体外增殖过程中需要

增加耗氧量和ATP的产生，尤其是进入细胞周期

后氧化磷酸化起到主导作用提供能量

［19］

；其次，细

胞分化过程也与线粒体的含量和功能有关

［20］

；最

后，在细胞迁移过程中需要ATP提供能量

［21］

.同

时，已有研究表明ATP不仅能够直接提供能量，还

发挥着信号转导的作用，其主要作用受体分为两

类：P2X和P2Y，其中P2X受体的激活具有促进成

骨的作用，而P2Y受体的激活则抑制成骨作用，它

们的激活状态主要受到ATP浓度调控

［22］

PGE2，导致成骨细胞钙离子的内流

［23］

；以及促进

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein

Kinase，MAPK）信号通路的激活等

［24］

.因此本研

究推测线粒体移植通过增加细胞的有氧代谢水平

和线粒体ATP的产生来增强细胞的增殖、成骨分

化能力和迁移能力.

然而本研究结果仍需进一步延伸.（1） 虽然移

植了成骨细胞线粒体的BMSCs具有更强的骨再

生能力，但是否为通过激活信号通路从而促进成

骨的尚待进一步研究.（2） 本研究显示移植了成骨

细胞线粒体的BMSCs功能优于移植了干细胞线

粒体的BMSCs，对于成骨细胞线粒体和干细胞的

线粒体，还未研究得到结论究竟是什么差异带来

这种区别.（3） 虽然成骨细胞线粒体移植有助于干

细胞功能优化，而且骨髓间充质干细胞可以在体

外扩增到足够的数量，在骨组织工程具有很大的

23］

潜力

［22，

，但其临床应用有待进一步载体优化.水

凝胶作为一种聚合物生物材料，以其生物相容性

和生物可降解性在各种治疗中输送功能性药物、

分子和细胞

［24］

.作为缓释药物的载体，水凝胶可以

保护受损区域免受不良外部刺激，保持受损部位

26］

湿润，提高药物的利用率

［25，

.设想将载有接受线

粒体移植的骨髓间充质干细胞的水凝胶涂覆于骨

支架表，这可能为骨缺损治疗提供了新策略.

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