admin 管理员组文章数量: 1087135
2024年2月22日发(作者：aspire 1600x)
分类号 R392.12 密 级 公 开
91012 学 号 2002015135 学校代码
硕士学位论文
人卵巢癌CD8+PD-1+
T细胞CD38/CD101的表达
及其临床意义
周 剑
指导教师
导师组成员
培养单位
倪 兵 教授
叶丽林教授、周新元教授
陆军军医大学基础医学院
细胞生物学
2018年5月
申请学位类别
硕士学术学位
专业名称
论文提交日期 2018年5月 论文答辩日期
林治华 教授
答辩委员会主席
评 阅 人
刘帅 副教授、陈澄 副教授
二〇一八年五月
目 录
英文缩写索引 ...................................................................................................................... 1
英文摘要 .............................................................................................................................. 3
中文摘要 .............................................................................................................................. 8
论文正文 人卵巢癌CD8+PD-1+ T细胞CD38/CD101的表达及其临床意义 ..............12
第一章 前 言......................................................................................................12
第二章 CD38和CD101在卵巢癌肿瘤组织浸润淋巴细胞上表达与定位 ...........15
2.1 实验材料 ......................................................................................................15
2.2 实验方法 ......................................................................................................16
2.3 实验结果 ......................................................................................................18
2.4 小 结 ......................................................................................................20
第三章 CD38和CD101在卵巢癌患者外周血PD-1+CD8+T细胞上表达及临床
相关性分析 ..................................................................................................21
3.1 实验材料 ......................................................................................................22
3.2 实验方法 ......................................................................................................23
3.3 实验结果 ......................................................................................................25
3.4 小 结 ......................................................................................................36
第四章 CD38和CD101在卵巢癌TILs PD-1+CD8+T淋巴细胞上表达与临床
相关性分析 ..................................................................................................38
4.1 实验材料 ......................................................................................................38
4.2 实验方法 ......................................................................................................40
4.3 实验结果 ......................................................................................................42
4.4 小 结 ......................................................................................................50
第五章 讨 论......................................................................................................52
全文结论 .....................................................................................................................56
参考文献 .....................................................................................................................57
文献综述 T细胞中PD-1信号转导途径 ........................................................................63
参考文献 .....................................................................................................................71
硕士在读期间撰写发表文章 .............................................................................................78
致 谢 .............................................................................................................................79
陆军军医大学硕士学位论文
英文缩写索引
英文缩写
APC
Ab
BSA
cADPR
CTL
CTLA-4
DMEM
DAPI
ECM
FBS
FCM
FITC
HE4
hr
HRP
HC
IFN-γ
IF
IL-2
LAK
LAG3
kDa
NCCN
min
NC
Non
OC
PD-1
英文全称
Allophycocyanin
Antibody
Albumin from bovine serum
Cyclic ADP-ribose
Cytotoxic lymphocyte
Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4
Dulbecco's modified Eagle's medium
4',6-diamidino-2-phenylindole
Extracellular matrix
Fetal bovine serum
Flow Cytometry
Fluorescein isothiocyanate
Humanepididymisprotein4
Hour
Horseradish peroxidase
Healthy control
Interferon-γ
Immunofluorescence
Interleukin-2
Lymphokine-activated killer cell
Lymphocyte-activation gene 3
Kilo Dalton
National Comprehensive Cancer Network
Minute
Negative control
None
Ovarian cancer
Programmed cell death protein 1
1
中文对照
别藻蓝蛋白
抗体
牛血清白蛋白
环腺苷二磷酸核糖
细胞毒性T淋巴细胞
细胞毒T细胞相关抗原4
细胞基本培养基
4',6-二脒基-2-苯基吲哚
细胞外基质
胎牛血清
流式细胞术
异硫氰酸荧光素
人附睾蛋白4
小时
辣根过氧化物酶
健康对照
γ-干扰素
免疫荧光
白细胞介素-2
淋巴因子激活杀伤细胞
淋巴细胞活化基因3
千道尔顿
美国国立综合癌症网络
分钟
阴性对照
不是
卵巢癌
程序性死亡受体1
陆军军医大学硕士学位论文
PD-L1
PD-L2
PBS
PBMC
Programmed death-ligand 1
Programmed death-ligand 2
Phosphate buffered saline
Peripheral blood mononuclear cell
程序性死亡配体1
程序性死亡配体2
磷酸盐缓冲液
外周血单核细胞
PE Phycoerythrin
Percp Peridinin-chlorophyll protein
PH Potential of hydrogen
rpm Rotation per minute
sec Second
TIL Tumor infiltrating lymphocyte
TNF-α Tumor necrosis factor
TME Tumor microenvironment
TST Tumour-specific CD8 T cells
2
藻红蛋白
多甲藻叶绿素蛋白
酸碱度
转/分钟
秒钟
肿瘤浸润淋巴细胞
肿瘤坏死因子α
肿瘤微环境
肿瘤特异性CD8 T细胞
陆军军医大学硕士学位论文
Co-expression of CD38 and CD101 on CD8+PD-1+ T Cells
of Ovarian Cancer and Its Clinical Significance
Abstract
1.1 Background
Ovarian cancer is the third most common gynecological malignancyand the leading
cause of death in gynecological cancers, leading to approximately14,080 deaths in the
United States in 2017. In recent decades, three major advances have significantly improved
the 5-year survival of ovarian cancer patients (~35% to 50%), includingsurgical or
pathologicstaging system, maximaltumor resectionsurgery and chemotherapy
combiningplatinum and paclitaxel. However, no biomarker has been identified for
effectiveearly diagnosis. Thus,70-80% of patients are in the advanced stages at diagnosis
and lose the chance for cure by treatment of surgery, chemotherapy and radiotherapy.
Despite temporary remission and prolonged progression-free survival (PFS), tumor
recurrence still occurs in more than 60% of ore, it is of great significance to
identify potential prognostic biomarkers for ovarian cancer, thus enablingdevelopment of
new therapeutic targets and improvementof patientoutcome.
CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) can specifically kill tumor cells and play an
important role in anti-tumor immunity. However, many factors in the tumor
microenvironment (TME) could induce CD8+T cells to upregulatethe expression of
inhibitory receptor programmed cell death protein-1(PD-1), which binds to the ligand on
tumor cell surface,
tumor-suppressing
programmed
of
death-ligand 1(PD-L1), thus decreasingthe
Despiteaccumulating evidence that CD8+CTLs. ability
anti-PD-1/PD-L1 antibodies couldsignificantly enhance the body's ability to remove tumors,
approximately 80% of patients still show poor effects aftertreatmentwith anti-PD-1/PD-
L1antibodies. Current clinical data have demonstrated thatPD-1 blocker is only effective for
a small number of patients with certain tumours. Then why dothe patients universally
3
陆军军医大学硕士学位论文
positive forPD-1 showremarkablydifferent effects? Why are PD-1-positive tumor-specific T
cells still unable to restoretheir anti-tumor immunity after treatment withPD-1
blockers?These problems become the bottleneck in the development of immunotherapy for
ovarian cancer.
Recently, Mary Philip et al. reported that PD-1 was highly expressed in
tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in mice, and the differentiation of TILs underwent
two separate chromatin states. Thesetwo states could be reflected by surface markers: one
was reversible dysfunctional state (state 1), in which CD8+T cells lowly expressed CD38
andCD101, and couldregain the ability to secrete interferon-γ (IFN-γ) and tumor necrosis
factor alpha (TNF-α) after in vitro stimulation, thus restoring the tumor-killing ability of
CD8+T cells;the other wasirreversible dysfunctional state (state 2), in which CD8+T cells
highly expressed CD38 and CD101, and could notregain the ability to secrete IFN-γand
TNF-αafter several rounds of in we speculate that the co-expression
of CD38/CD101 in PD-1+CD8+T cells inthese two states may probably relate to the
therapeutic effects of PD-1/PD-L1 blockers, and the frequency of these two groups of
PD-1+CD8+
T cells may be a key predictor of the prognosis of ovarian cancer patients.
Therefore, we investigatedthe expression and distribution of the surface molecules
CD38/CD101 in PD-1+CD8+T cells in the peripheral blood and cancer tissues of ovarian
cancer patients, andanalyzed the correlationsof PD-1+CD8+T cell subpopulationwith the age,
clinical stage, histopathological grade, lymph node metastasis and postoperative
chemotherapy outcome indices(serum CA125 and HE4)of ovarian cancer on
these experiments, we would be able to determine whether CD38/CD101 could be used as a
biomarker to facilitate diagnosis and to predict prognosis of ovarian cancer.
1.2Methods
1.2.1 Immunofluorescence (IF) staining was used to detect the expression and
localization of CD38 and CD101 in tumor TILs of patients with ovarian cancer.
1.2.2 The peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and TILsof ovarian cancer
patients and the healthy frequency of CD8+Tcell subsetsin
PD-1+/PD-1+CD38+CD101-/PD-1+CD38-CD101+/PD-1+CD38+CD101+/PD-1+CD38-CD101-/PD-1-/PD-1-CD38+CD101-/PD-1-CD38-CD101+/PD-1-CD38+CD101+/PD-1-CD38-CD101-
4
陆军军医大学硕士学位论文
cellswas detected by flow cytometry.
1.2.3 A variety of statistical methods was used to analyze thecorrelationof
PD-1+CD8+Tand PD-1-CD8+T cell subsets frequencywiththe clinicopathological parameters
andtherapeutic indices of ovarian cancer.
1.3Results
1.3.1 Expression and localization of CD38 and CD101 in TILs of ovarian cancer
We detected the expression and common location of CD38 and CD101 in the surgical
resection of ovarian cancer patientsusing immunofluorescence found that both
CD38 and CD101 were highly expressed in ovarian carcinoma, which was mainly
expressed in the infiltrating lymphocyte envelope and had a common was no
CD38 and CD101 expression in the adjacent tissuesbecause of less lymphocyte infiltration.
1.3.2 Expression of PD-1, CD38 and CD101 in peripheral blood CD8+T cells of
ovarian cancer patients and its clinical correlation
After successfully separatingthe PBMCSof ovarian cancer patients and from those of
the healthy control, we detectedthe expression frequency of subgroups of CD8+Tcells by
flow cytometrythrough anti-CD3-PerCP, anti-CD8-FICT, anti-PD-1-PE/Cy7,
anti-CD38-PE,and frequency of total PD-1+CD8+T cell in
peripheral blood of patients was significantly higher than that in the healthy control group,
and the frequency of PD-1+CD38-CD101+/PD-1+CD38+CD101+CD8+Tcell subsets was
alsosignificantly higher than thatin the healthy control group. The frequency of
PD-1+CD38+CD101-/PD-1+CD38-CD101-CD8+T cell subsets was significantly lower than
that in the healthy control group, and the total PD-1-CD8+T cell frequency was significantly
lower in patients than in the healthy control subgroup frequency of
PD-1-CD38-CD101+/PD-1-CD38+CD101+CD8+Tcells was significantly higher than that in
the healthy control group, and PD-1-CD38+CD101-/PD-1-CD38-CD101-CD8+Tcell
subgroup frequency was significantly lower than that in the healthy control group.
Byanalyzingthe correlation between the expression frequency of peripheral blood
PD-1, CD38 and CD101 in CD8+T cells and the clinical parameters of ovarian cancer using
the statistical card test, we discovered that all CD8+T cell subsets were not related to the
age and histopathological grade(p>0.05) of patients. The total frequency of PD-1+/PD-1-
5
陆军军医大学硕士学位论文
CD8+T cell subsets was unrelated to the clinicopathological parameters of ovarian cancer
(p>0.05), and the single positive expression of CD38 and CD101 in PD-1+/PD-1-CD8+T
cell subsets was unrelated to the clinicopathological parameters of ovarian cancer (p>0.05).
Thepositive or negative co-expression of CD38/CD101 in PD-1+/PD-1-CD8+T cell subsets
was significantly correlated with clinical stage, tumor grade and lymph node
metastasis(p<0.05).
We also analyzed the correlation between the expression frequency of PD-1, CD38 and
CD101 in peripheral blood CD8+Tcells of ovarian cancer and postoperative
expression frequency of total PD-1+CD8+Tcell was not
correlated with curative effect (p>0.05).The single positive expression of CD38 and CD101
in PD-1+CD8+ T cell subsetswasnot correlated with curative effect (p>0.05).However, the
frequency ofpositive or negative co-expressionof CD38/CD101 in PD-1+CD8+ T cell
subsets was significantly correlated with the curative effect (p<0.05). The frequency oftotal
PD-1-CD8+Tcell was not correlated with curative effect (p>0.05). The frequency of single
positive expression of CD38 on PD-1-CD8+ T cell subsets was not correlated with curative
effect (p>0.05), whilethe frequency ofsingle positive expression of CD101 on PD-1-CD8+ T
cell subsets was significantly correlated with the curative effect (p<0.05). And the
frequency of positive or negative co-expression of CD38 and CD101 in PD-1-CD8+ T cell
subsets was significantly correlated with the curative effect (p<0.05).
1.3.3 Expression of PD-1, CD38 and CD101 in TILs CD8+T cells of ovarian cancer
patients and its clinical correlation
A single cell suspension of tumor infiltrating lymphocytes was prepared by mechanical
method, chemical method and enzymatic digestion process, and then gradient centrifugation
was carried out using lymphocyte separation proportion of
PD-1+/PD-1-CD8+Tcellsubgroupswas
anti-CD8-FICT, anti-PD-1-PE/Cy7,
determinedbyFCMthrough
anti-CD38-PE
anti-CD3-PerCP,
correlation between the expression of PD-1, CD38, and CD101 inCD8+Tcells and the
clinical parameters of ovarian carcinoma was analyzedby nonparametric r to the
findings with peripheral blood, the frequencyof single positive expression of CD38 and
CD101 in PD-1+CD8+ T cell subsetsof ovarian carcinoma infiltrating lymphocyteswas not
6
陆军军医大学硕士学位论文
correlated with the clinicopathological parameters and curative effect, while the frequency
of positive or negative co-expression of CD38 and CD101was significantly correlated with
clinical stage, lymph node metastasis and curative effect.
1.4 Conclusions
The proportion of CD38+/CD101+ double-positive cells in PD-1+/PD-1-CD8+T cells
significantly increasesin peripheral blood and tumor tissues of ovarian cancerpatients,
compared with other PD-1+/PD-1-CD8+T cell frequency of
PD-1+CD38+CD101+CD8+T cells is most closely related to the clinical stage, lymph node
metastasis and postoperative chemotherapeutic effects, but has norelationto the age and
histological grade. Furthermore, the co-expressionlevel of CD38 and CD101 is positively
correlated with themalignancydegree of ovarian cancer and negatively correlated with the
effects ofpostoperative together, the co-expression frequency of
CD38 and CD101 in PD-1+/PD-1-CD8+T cells can be used as an indicator to assist
diagnosis and to predict prognosis of ovarian cancer, and may become anadjuvant
biomarkerto determinethe applicability of anti-PD-1 immunotherapy forovarian
cancerpatients.
Keywords: Ovarian cancer;CD38;CD101;PD-1
7
陆军军医大学硕士学位论文
人卵巢癌CD8+PD-1+ T细胞CD38/CD101的表达及其
临床意义
摘 要
1.1研究背景
卵巢癌的发病率在女性生殖恶性肿瘤中位居第三，其致死率则高居榜首。例如，2017年在美国约有14,080人死于卵巢癌。近几十年来，卵巢癌的诊疗有三大进展，即科学的手术病理分期、最大限度的减瘤手术及铂类和紫杉醇配伍的联合化疗，这些进展使卵巢癌患者的5年生存率已由70年代的35%左右上升到目前的50%。但截至目前，仍无有效的生物标志分子应用于卵巢癌的早期诊断，导致70-80%的患者就诊时已属晚期，此阶段的病人用传统的手术、化疗和放疗常常难以治愈。即使暂时缓解和无进展生存期延长，但仍有约60%以上的患者会复发。因此，找出潜在的预后生物标志物对于开发卵巢癌新的治疗靶点、最终改善这种疾病的结局具有重大的意义。
CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）能特异性杀死肿瘤细胞，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）中的诸多因素会诱导CD8+T细胞上调抑制性受体程序性死亡受体-1（Programmed cell
death protein-1, PD-1）的表达，后者通过与肿瘤细胞表面的配体即程序性死亡-配体1（Programmed death-ligand 1, PD-L1）结合，显著抑制CD8+ CTL清除肿瘤细胞的能力。虽然大量的基础研究和临床实验已经证明抗PD-1或抗PD-L1的抗体能显著增强机体清除肿瘤的效率，但仍有80%左右的患者在使用抗PD-1或抗PD-L1的抗体治疗后显示效果不佳。从现有的临床数据来看，PD-1阻断剂仅对某些肿瘤的一小部分患者有效。那么，为何同样是PD-1表达阳性的患者却有着截然不同的疗效？为何PD-1阳性的肿瘤特异性T细胞在接受PD-1阻断剂处理之后仍无法恢复其抗肿瘤的免疫活性？这些问题也是目前卵巢癌免疫治疗发展遇到的瓶颈。
最近，Mary Philip等人的研究报道，小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）高表达PD-1，其分化会经历两个独立的染色质状态，并且这些状态能够反应到相应的表面标记上：一种是可逆的功能紊乱状态（状态1），这个状态的CD8+T细胞低表达CD38、CD101，这群细胞经体外刺激能重新恢复分泌γ-干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）8
陆军军医大学硕士学位论文
的能力，从而恢复了CD8+ T细胞对肿瘤的杀伤能力；另一种则是不可逆的功能紊乱状态（状态2），这个状态的CD8+T细胞高表达CD38、CD101，这群细胞即使经过体外数轮刺激仍不能重新恢复分泌IFN-γ和TNF-α。这两种状态中的PD-1+CD8+T细胞上CD38和CD101的共表达状况很可能与PD-1/PD-L1阻断剂的治疗效果有关，且这两群不同功能状态的PD-1+CD8+
T细胞在卵巢癌患者体内的频率可能是卵巢癌患者预后的关键指标。
因此，我们对卵巢癌患者的外周血、癌组织中的PD-1+CD8+T细胞表面CD38/CD101的表达和分布情况进行研究，分析PD-1+CD8+T细胞亚群与卵巢癌患者年龄、临床分期、组织病理学分级、淋巴结转移以及术后化疗的疗效指标（血清CA125和HE4检测值）是否恢复正常的相关性。判断CD38/CD101在PD-1+CD8+T细胞的表达对卵巢癌病人诊断和疗效的指示性作用，为卵巢癌的临床诊断、治疗以及预后判断提供帮助。
1.2研究方法
1.2.1运用免疫荧光染色技术（Immunofluorescence，IF）检测CD38分子和CD101分子在卵巢癌患者TILs中的表达和定位情况。
1.2.2应用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）检测卵巢癌患者、正常人外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）和卵巢癌TILs中PD-1+/PD-1+CD38+CD101-/PD-1+CD38-CD101+/PD-1+CD38+CD101+/PD-1+CD38-CD101-/PD-1-/PD-1-CD38+CD101-/PD-1-CD38-CD101+/PD-1-CD38+CD101+/PD-1-CD38-CD101-的CD8+T细胞亚群频率。
1.2.3运用多种统计学方法分析各PD-1+CD8+T和PD-1-CD8+T细胞亚群的频率及其与卵巢癌临床病理参数和疗效指标的相关性。
1.3 研究结果
1.3.1 CD38和CD101在卵巢癌TILs中表达与定位
我们运用免疫荧光双染技术检测了卵巢癌患者手术切除组织中CD38和CD101的共定位情况和表达水平，结果显示CD38和CD101都在卵巢癌组织中高表达，其主要表达在组织浸润淋巴细胞包膜上，且存在共定位。癌旁组织中淋巴细胞浸润非常少且都不表达CD38和CD101。
1.3.2 CD38和CD101在卵巢癌患者外周血PD-1+CD8+T细胞上表达及临床相关性9
陆军军医大学硕士学位论文
分析
本章实验中，我们成功运用梯度密度离心法分离了卵巢癌患者组和健康对照组PBMCs，anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体染色后，用FCM检测分析PD-1+/PD-1-CD8+T细胞各亚群频率。用独立样本T检验统计分析卵巢癌患者组与健康对照组PD-1+/PD-1-CD8+T细胞各亚群频率。结果显示：卵巢癌患者组外周血PD-1+CD8+T细胞亚群中，总PD-1+CD8+T细胞频率显著高于健康对照组，PD-1+CD38-CD101+/PD-1+CD38+CD101+CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著升高，PD-1+CD38+CD101-
/PD-1+CD38-CD101- CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著降低；在PD-1-CD8+T细胞亚群中，总PD-1-CD8+T细胞频率显著低于健康对照组，PD-1-CD38-CD101+/PD-1-CD38+CD101+CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著升高，PD-1-CD38+CD101-/PD-1-CD38-CD101-CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著降低。
我们运用统计学卡方检验分析了卵巢癌患者外周血PD-1、CD38、CD101在CD8+T细胞上表达频率与卵巢癌临床参数的相关性，结果显示：所有CD8+T细胞亚群均与患者年龄、组织病理学分级不相关（p>0.05）；总PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群频率均与卵巢癌临床病理参数不相关（p>0.05）；CD38、CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群中的单阳性表达均与卵巢癌临床病理参数不相关（p>0.05），CD38/CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群中的双阳和双阴性表达与临床分期、肿瘤等级和淋巴结转移显著相关(p<0.05)。
我们还分析了卵巢癌外周血CD8+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达频率与术后化疗疗效的相关性。结果显示：总PD-1+CD8+T细胞表达频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38、CD101在PD-1+CD8+ T细胞亚群上单表达与疗效也不相关(p>0.05)，但CD38/CD101在PD-1+CD8+T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。总PD-1-CD8+T细胞频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38在PD-1-CD8+ T细胞亚群上表达频率与疗效不相关(p>0.05)，但CD101在PD-1-CD8+ T细胞亚群上表达频率与疗效显著相关(p<0.05)，且CD38/CD101在PD-1-CD8+ T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。
1.3.3 CD38和CD101在卵巢癌TILs PD-1+CD8+T淋巴细胞上表达与临床相关性分析
我们通过机械法、化学法及酶消化处理相结合制备肿瘤浸润淋巴细胞单细胞悬液，再利用淋巴细胞分离液进行梯度离心。anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、10
陆军军医大学硕士学位论文
anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体染色后，用FCM检测分析PD-1+/PD-1-CD8+T细胞各亚群的频率。用非参数检验分析卵巢癌组织浸润淋巴细胞中PD-1、CD38、CD101 在CD8+T细胞的表达水平及其与卵巢癌临床病理参数和术后化疗疗效的相关性。结果显示与外周血非常类似，即在卵巢癌组织浸润淋巴细胞PD-1+CD8+T细胞中，CD38、CD101单阳性表达频率与临床病理参数和疗效不相关，而CD38和CD101表达双阳性和双阴性与临床分期、淋巴结转移以及疗效显著相关。
1.4结论
PD-1+/PD-1-CD8+T细胞中CD38/CD101双阳性细胞在卵巢癌患者外周血和肿瘤组织中的比例显著升高，相较于其它PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群，PD-1+CD38+CD101+
CD8+T细胞的频率与卵巢癌患者的临床分期、淋巴结转移及术后化疗疗效的相关性最为密切，而与卵巢癌患者年龄、组织病理分级无关。且CD38和CD101共表达水平越高，卵巢癌恶性程度越高，术后化疗疗效越差。因此，CD38和CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞共表达频率可作为卵巢癌患者辅助诊断和预测预后的指标之一，并有可能作为判断卵巢癌患者抗PD-1免疫治疗适用性的辅助生物学指标。
关键词：卵巢癌；CD38；CD101；PD-1
11
陆军军医大学硕士学位论文
人卵巢癌CD8+PD-1+ T细胞CD38/CD101的表达
及其临床意义
第一章 前 言
卵巢癌是最致命的妇科癌症，是女性生殖器官常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，也是妇女癌症相关死亡的第五大原因，仅在2017年美国有近14080人死于卵巢癌[1]。卵巢癌致死率居各类妇科肿瘤的首位，是严重威胁妇女生命的恶性肿瘤[2]。因卵巢位于盆腔深处，难以扪及或筛查，且卵巢癌早期多无症状，70%的卵巢癌在诊断时就已扩散到子宫，双侧附件，大网膜及盆腔各器官，而且卵巢癌组织类型复杂，所以卵巢癌的诊断和治疗都是目前研究急需解决的问题[3]。尽管侵袭性手术和联合化疗取得进展，但卵巢癌的预后仍然很差，截至目前其5年生存率为46％[4]。因此找到潜在的预后生物标志物并开发卵巢癌新的治疗靶点以改善这种疾病的结局具有重大意义。
T细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中种类、数量最多，功能最复杂的一类细胞[5]。其中的杀伤性T细胞，也叫细胞毒性T细胞，它能通过释放γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α等细胞因子杀死靶细胞，如被病原体感染的细胞和表达有肿瘤特异性抗原的细胞[6]。但是，许多癌症抗原是自身抗原，对这些蛋白质的耐受性可阻碍抗肿瘤T细胞应答[7]。为保证T细胞不被过度激活，还有调节T细胞的负性共刺激分子，主要有CTLA4-B7通路和PD-1／PD-L1通路[8-10]。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员[11]。PD-1是重要的免疫检查点，通过与其两个配体PD-L1和PD-L2的相互作用，抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥至关重要的作用[12]。肿瘤细胞入侵后，会利用这一抑制性的通路来抑制T细胞激活，从而逃脱免疫系统的围剿。目前临床上研究和应用最广泛的免疫检查点阻断剂包括PD-1和PD-L1单抗，通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫抑制因子，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用[13-16]。利用抗PD-1/PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1信号通路，在多种实体瘤中显示出卓越的抗肿瘤疗效[17, 18]。研究发现，在实体瘤内的细胞毒性T细胞功能紊乱，无法杀死癌细胞，任由肿瘤自由发展[19]。这也是免疫治疗只能在五分之一左右的患者身上有效，而12
陆军军医大学硕士学位论文
且只针对某些类型的癌症，其余的都没有回应，或者回应不会持续的原因[20, 21]。
研究发现，卵巢癌患者PD-1/在外周血和组织中也是高表达的，且PD-L1与患者临床病理参数和预后密切相关[22, 23]，但PD-1/PD-L1阻断剂对卵巢癌的治疗效果却不及其他几种肿瘤，PD-1阳性的肿瘤特异性T细胞在接受PD-1阻断剂刺激之后为何仍无法恢复其抗肿瘤的免疫活性？此外，如何判断卵巢癌患者是否适合接受免疫检查点阻断剂的治疗？这些问题是目前卵巢癌免疫治疗发展的瓶颈。
Schietinger及其同事在研究小鼠实验中，发现T细胞在肿瘤发育早期就会出现功能紊乱的状态，但此时这种状态是可逆的，经过PD-1阻断剂的阻断，T细胞还可以恢复功能，再次对抗癌症。后来，经过进一步的分化，这种功能紊乱状态固定下来，即使把这些出现T细胞从肿瘤微环境中移植到正常环境中，经过多轮细胞分裂也无法恢复T细胞功能[24]。随后，Mary Philip等人也证实了T细胞分化过程中确实会经历这两个独立的染色质状态阶段，并且这些状态能够反应到细胞表面标记上：即CD38和CD101[25]。
CD38是一个定位于膜上的45kDa的单链跨膜糖蛋白，CD38在人外周血淋巴细胞中的表达水平随着年龄的变化而变化，新生婴儿中90%的循环淋巴细胞为阳性；6-10岁时只有50-60%的淋巴细胞呈阳性表达。成年人中，CD38在大多数自然杀伤细胞、T细胞、B细胞，单核细胞和巨噬细胞。CD38可能参与信号传递的第一条线索来自在外周血单核细胞和T细胞系上CD38与配体的连接可诱导激活和增殖信号现象。后续的实验发现人CD38与特异性抗体的连接诱导细胞因子白细胞介素（IL-1）、肿瘤坏死因子-α和粒-巨噬细胞集落刺激因子的转录，其表达水平与刺激T细胞受体CD3的效应相似[26, 27]。HBV和HIV等研究显示CD38分子通过接受外来信号激活T细胞活化，因而CD38+可作为T细胞活化标志[28, 29]。有研究发现在前列腺癌中CD38的表达与预后密切相关[30]，但是在卵巢癌中CD38的表达水平及其临床意义尚未见文献报道。
CD101是240kDa二硫键连接的同二聚体I型糖蛋白。该肽由7个细胞外V型IgSF结构域组成[31]。CD101在单核细胞，粒细胞，粘膜T细胞和活化的外周血T细胞上高表达。在大多数造血细胞系中，缺乏血小板和弱或不存在的休眠T、B、NK细胞的低表达[32]。CD101被认为在TCR/CD3介导的T细胞活化中起共同刺激作用。针对CD101的单克隆抗体抑制同种异体T细胞应答[33]。研究表明，CD101在皮肤树突状细胞激活T细胞中起重要作用。作为CD3诱导T细胞增殖的阻断剂发挥作用。抑制活化的T细胞上IL-2RA的表达和IL-2的分泌。抑制IL-2产生和细胞增殖所需的酪氨酸激酶。抑制磷脂酶C-γ-1 / PLCG1磷酸化和随后的CD3诱导的细胞内游离钙的变化。阻止激13
陆军军医大学硕士学位论文
活的T细胞的核因子核移植到细胞核。在通过皮肤树突状细胞分泌IL-10抑制T细胞增殖中发挥作用。可能是CD4
+ CD56
+白血病肿瘤细胞的标志[34]。
CD38和CD101分子都是T细胞的表面活化标记，我们推测在PD-1+CD8+T细胞上， CD38/CD101的共表达可能说明CD8+T细胞的处于持续耗竭状态，进而无法正常活化以发挥T细胞的功能[35]。在类风湿性关节炎的研究中也发现在高表达CD8+T细胞中，CD101+T细胞的细胞毒性作用相较于CD101−T细胞受抑制程度更低[36]。尽管有文献报道CD4+CD56+胚胎肿瘤细胞表达CD101分子[34]，但是在卵巢癌中CD101的表达及其临床意义尚未见文献报道。
在肿瘤组织中低表达CD38/CD101的PD-1+CD8+T细胞通过一系列干预能够恢复分泌IFN-γ和TNF-α的能力，而高表达CD38/CD101的
PD-1+CD8+T细胞则持续处于功能紊乱状态，其抑制功能失不再来[25]。我们推测这两种状态中的PD-1+CD8+T细胞上CD38和CD101的共表达状况很可能与PD-1/PD-L1阻断剂的治疗效果有关，且这两群不同功能状态的PD-1+CD8+
T细胞在卵巢癌患者体内的频率可能是卵巢癌患者预后的关键指标。因此，我们在卵巢癌中进行PD-1、CD38、CD101在CD8+T细胞的临床相关性研究，为CD38、CD101两个细胞表面标志物在卵巢癌的诊断、治疗以及预后判断提供帮助。
14
陆军军医大学硕士学位论文
第二章 CD38和CD101在卵巢癌肿瘤组织浸润淋巴细胞上
表达与定位
CD8+细胞毒性T淋巴细胞能特异性杀死肿瘤细胞，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而肿瘤微环境会上调CD8+ T细胞抑制性受体PD-1的表达，通过与肿瘤细胞表面的PD-L1结合后，显著抑制CD8+ CTL清除肿瘤细胞的能力。大量的基础研究和临床实验已经证实抗PD-1/PD-L1的阻断剂能显著增强机体清除肿瘤的能力，但仍有很多患者在使用抗PD-1/PD-L1的免疫治疗效果不佳。有研究发现T细胞在肿瘤发育早期就会出现功能紊乱，但此时这种状态是可逆的，经过PD-1抗体的阻断，T细胞可以恢复功能，再次对抗癌症。T细胞在肿瘤微环境中进一步分化，这种功能紊乱状态将被固定下来，此时即使把这些T细胞从肿瘤微环境中移植到正常环境中，经过多轮细胞分裂刺激也无法恢复T细胞功能。
最近，Mary Philip等人报道了小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的分化会经历两个独立的染色质状态，并且这些状态能够反映到相应的表面标记上：一种是可塑的功能失调状态（state 1），这个状态的CD8+T细胞低表达CD38、CD101，这群细胞通过体外刺激能够重新分泌IFN-γ和TNF-α，从而恢复CD8+T细胞的肿瘤杀伤功能；另一种则是稳定的功能失调状态（state 2），这个状态的T细胞高表达CD38、CD101，体外刺激不能使其恢复分泌IFN-γ和TNF-α的能力。
CD38和CD101是T细胞表面的活化标记，其分别与PD-1共表达可以作为T细胞衰竭标记。因此，我们推测CD38/CD101共表达于PD-1+CD8+T细胞表面可能预示这群CD8+T细胞处于一种不可恢复的持续耗竭状态。目前卵巢癌中尚未有CD38和CD101在T细胞的相关报道。基于此，我们首先运用免疫荧光双染技术检测了卵巢癌患者手术切除组织中CD38和CD101的共定位表达情况，确定卵巢癌组织确实存在这群细胞，为后续卵巢癌患者外周血和肿瘤组织的流式细胞检测提供实验依据。
2.1 材料与试剂
2.1.1主要试剂
试剂名称
PBS
15
公司
合肥biosharp公司
陆军军医大学硕士学位论文
小鼠抗人CD38单克隆抗体
兔抗人CD101多克隆抗体
免疫荧光封片剂
二甲苯
无水乙醇
柠檬酸组织抗原修复液
牛血清白蛋白（BSA）
驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 555荧光二抗
山羊抗兔Alexa Fluor 488荧光二抗
DAPI
4%多聚甲醛
高效切片石蜡
抗荧光淬灭封片剂
2.1.2主要实验仪器和器材
仪器名称
微量加样枪
高压锅
避光湿盒
4℃冰箱
Leica RM2235石蜡切片机
恒温箱
电磁炉
粘附载玻片
正置显微镜
北京中杉金桥生物技术有限公司
北京博奥森生物技术有限公司
美国SouthernBiotech公司
中国华东化工公司
中国华东化工公司
福州迈新公司
中国Solarbio公司
美国Invitrogen公司
美国Invitrogen公司
中国碧云天公司
北京雷根生物公司
上海江莱生物有限公司
上海碧云天生物技术有限公司
公司
德国Eppendorf公司
中国顺发精品公司
北京泰泽瑞达公司
中国海尔公司
美国Leica公司
美国shellab公司
中国美的公司
中国世泰公司
日本Olympus公司
2.2 实验方法
2.2.1 制作卵巢癌组织和癌旁组织石蜡切片
（1）取材，收取卵巢癌患者手术切除组织和癌旁组织；
（2）将样本修剪形状及大小后，浸入4%多聚甲醛固定至少24小时，封闭瓶口；
（3）将固定组织块放入广口瓶，瓶口用纱布包好，置流水下水洗，水洗时间依固16
陆军军医大学硕士学位论文
定时间而定，一般12h以上，固定时间越长水洗时间越长；
（4）脱水，50%酒精脱水12h、70%酒精脱水1h、80%酒精脱水1h、90%酒精脱水1h、100%酒精I脱水1h、100%酒精II脱水1h、100%酒精II脱水1h；
（5）透明，浸泡酒精:二甲苯=1:1溶液30min、二甲苯I透明10-20min、二甲苯II透明10-20min；
（6）浸蜡，石蜡I、石蜡II、石蜡III各1h；
（7）包埋，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固后即可取出备用。
（8）切片，使用Leica RM2235切片机将制备好的蜡块进行切片。具体操作如下：
①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上；
②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上；
③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口；
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右；
⑤调整厚度调节器到5μm的切片厚度；
⑥调整好后可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起；
⑦切成的蜡带到一定长度时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带
（9）将切好的蜡带轻柔放入45℃温水中，光面贴水，在水浴中展开后拨去多余的蜡。用载玻片（注意标记和记录）捞取组织，并调节到最佳位置。将玻片放在60℃摊片夹上，摊片15-30min，将拨片上的水分全部烘干后放入石蜡切片盒中保存待用。
2.2.2 免疫荧光
（1）取石蜡切片烤片，在恒温箱中65℃烘片4h；
（2）脱蜡和水化。二甲苯I、二甲苯II分别浸泡15min。100%酒精I、100%酒精II、100%酒精III 、90%酒精、80%酒精、70%酒精分别浸泡10min。然后在水龙头下，流水冲洗10min；
（3）抗原修复修复，用0.1mol/L且pH=6.0枸橼酸抗原修复液，高压修复，高压锅喷气后2min。然后取出，放置自然降温后用PBS洗3次，每次10min；
17
陆军军医大学硕士学位论文
（4）甩干液体，用免疫组化笔画圈；
（5）滴加0.4%TritonX-100，4℃透化10min，PBS洗3次，每次10min；
（6）5%BSA 37℃封闭1h（室温也可）；
（7）甩干液体，用1%BSA配制一抗并滴在组织上，室温孵育30min，然后放入湿盒4℃冰箱过夜；
（8）第二天取出，室温复温30min，PBS洗3次，每次10min；。
（9）甩干液体，避光加稀释的二抗，孵育1min，避光PBS洗3次，每次10min；
（10）滴加DAPI染核，避光孵育2min，避光PBS洗3次，每次10min；
（11）水溶性防粹灭封片剂封片，荧光显微镜观察并照相留档。
2.3 实验结果
我们用免疫荧光共定位探索了CD38/CD101在卵巢癌瘤组织和癌旁组织上的表达。用卵巢癌组织和癌旁组织制作石蜡切片，经脱蜡至水、抗原修复、BSA封闭、一抗4℃过夜孵育，避光孵育二抗以及DAPPI染核、封片。使用荧光显微镜观察，照相存档。再用Photoshop进行图片处理分析，发现CD38（红）CD101（绿）荧光表达在肿瘤浸润淋巴细胞上，且都表达在肿瘤浸润淋巴细胞包膜上（图1）。但在癌旁组织几乎看不到CD38/CD101蛋白表达。
18
陆军军医大学硕士学位论文
图1. CD38/CD101在卵巢癌和癌旁组织表达情况。使用免疫荧光双染技术验证CD38/CD101在卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞和癌旁组织的表达及部位。使用以下荧光染料的单克隆标记：小鼠抗人CD38单克隆抗体和兔抗人CD101多克隆抗体。荧光二抗分别为488 山羊抗兔 IgG和555 驴抗小鼠 IgG。同型对照使用正常小鼠，山羊或兔IgG用作阴性对照。
19
陆军军医大学硕士学位论文
2.4 小 结
本部分通过免疫荧光双标检测，发现相对于癌旁组织CD38和CD101在卵巢癌组织TILs中均高表达，并且能在部分TILs细胞膜上共定位表达。结果证实了CD38和CD101在卵巢癌TILs上有表达，但是其在PD-1+/PD-1-细胞中的表达水平尚不清楚。
20
陆军军医大学硕士学位论文
第三章 CD38和CD101在卵巢癌患者外周血PD-1+CD8+T细胞上表达及临床相关性分析
PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，其功能是抑制细胞的激活，这是免疫系统的一种正常自稳机制，因为过度的T、B细胞激活会引起自身免疫病。但是，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2[12]。它与T细胞上的PD-1结合，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞，最终诱导免疫逃逸。最近，有文献报道了CD38和CD101在功能失调但可逆的小鼠肿瘤TILs上低表达，在稳定的功能失调TILs高表达[25]。
CA125是目前最常用的卵巢癌生物标志物[37, 38]。它是一种高分子量糖蛋白，在75％至90％的上皮性卵巢肿瘤患者血清中升高[39]。它被用作卵巢癌的诊断工具[40, 41]，评估对卵巢癌治疗的效果[40]，并监测复发[42]。作为诊断标志物，CA125与良性妇科疾病患者中的假阳性率高有关[43]，并且其在早期疾病中的敏感性不足[37]。
人类附睾蛋白4（HE4）于1991年由Kirckhoff等人发现[44]。HE4（基因名称WFDC2）是由卵巢癌高表达的糖蛋白[45, 46]。其在正常气管和唾液腺组织高表达[47]。在卵巢癌中HE4过度表达，但发现在肺癌，乳腺癌，胃肠道和泌尿系统癌中表达较少[47]。HE4存在于血液中，在浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌和子宫癌患者中过度表达[47, 48]。它被认为是卵巢癌的潜在生物标志物，因为它可以被32％的卵巢癌无CA125表达，并且与CA125结合后，血清HE4可以改善卵巢肿瘤恶性程度的预测[49]。美国食品和药物管理局（FDA）批准HE4用于监测卵巢癌患者的疾病复发。有文献已经证实，HE4诊断高危和平均风险女性的病例与健康对照的诊断准确性相似（AUC分别为0.931和0.928，P = 0.94）[50]。
我们已经证实了在卵巢癌TILs上CD38和CD101较癌旁组织高表达，但是其在PD-1+/PD-1-细胞中的表达水平尚不清楚。目前也未发现有相关文献报道。因此，为了探索卵巢癌PD-1+/PD-1-CD8+T细胞上CD38和CD101表达水平及其临床意义，我们用流式细胞术检测卵巢癌患者和正常人PBMCs中的PD-1、CD38、CD101在CD8+T淋巴细胞亚群的表达，以探讨卵巢癌患者与正常人外周血CD8+T淋巴细胞上PD-1、CD38、CD101表达的差异。结合临床病历资料和流式细胞技术检测结果，统计分析PD-1、CD38、CD101表达水平与卵巢癌临床参数以及疗效的相关性。为卵巢癌临床诊断、治疗以及预后提供参考依据。
21
陆军军医大学硕士学位论文
3.1 实验材料
3.1.1 病历资料
本课题实验样本来源于96名卵巢癌患者。排除标准为：卵巢良性肿瘤，腹部结核，卵巢囊肿，其他转移癌。其中，年龄37-68岁。患者根据美国国立综合癌症网络（NCCN）TNM分期（第四版，2017年）进行临床资料统计：I~II期24例，III~IV期72例。组织病理学分级：高中分化45例，低分化51例。肿瘤分级：T1-T2 25例，T3-T4 71例。淋巴结转移；有淋巴结转移者70例，无淋巴结转移者26例。远处转移情况：有远处转移者3例，无远处转移者93例。患者血清CA125和HE4检测值数据均为术后经一次化疗治疗后的检测值，且96例患者入院检查时CA125>35U/ml，HE4>76.2pmol/ml。对照组为体检中心健康体检者26例。所有患者均于2017年3月至2018年2月在中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院妇产科就诊。这些患者和健康对照的临床特征见（表1）。受试者在参与之前，所有患者均获得书面知情同意书。本研究也经陆军军医大学伦理委员会批准。
表1 96例卵巢癌患者临床病理资料
临床病理参数
年龄（最小值-最大值）
临床分期（I~II期/III~IV期）
组织病理学分级（高中分化/低分化）
肿瘤分级（T1-T2/T3-T4）
淋巴结转移（无（N0）/有（N1））
远端转移（无（M0）/有（M1））
CA125(U/ml)（≤35/＞35）
HE4(pmol/ml)（≤76.2/＞76.2）
病例数（96）
37-68
24/72
45/51
25/71
26/70
93/3
25/71
31/65
3.1.2主要试剂
试剂名称
PBS
红细胞裂解液
公司
合肥biosharp公司
合肥biosharp公司
22
陆军军医大学硕士学位论文
人淋巴细胞分离液
anti-CD3-PerCP
anti-CD8-FICT
anti-PD-1-PE/Cy7
anti-CD38-PE
anti-CD101-APC
APC Mouse IgG1 kappa Isotype Control
PE Mouse IgG1 kappa Isotype Control
FITC Mouse IgG1 kappa Isotype Control
PerCP Mouse IgG1 kappa Isotype Control
PE/Cy7 Mouse IgG1 kappa Isotype Control
DMEM培养基
FBS
3.1.3主要实验仪器和器材
仪器名称
微量加样枪
水平离心机
BD FACSCantoTMⅡ流式细胞分析仪
正置显微镜
血球计数板
流式管
15ml离心管
1.5mL离心管
4℃冰箱
滴管
挪威Axis-Shield公司
美国BioLegend公司
美国eBioscience公司
美国BioLegend公司
美国Invitrogen公司
美国BioLegend公司
美国Biolegend公司
美国eBioscience公司
美国eBioscience公司
美国Biolegend公司
美国Biolegend公司
美国Hyclone公司
澳大利亚Gemini公司
公司
德国Eppendorf公司
长沙平凡仪器有限公司
美国BD公司
日本Olympus公司
上海医用光学仪器厂
美国BD公司
无锡Nest公司
无锡Nest公司
中国海尔公司
上海晶安公司
3.2 实验方法
3.2.1提取卵巢癌患者组和正常健康对照组PBMCs
（1）用抗凝管抽取待抽血者静脉血3ml；
（2）低速离心机1500rpm，10min；
23
陆军军医大学硕士学位论文
（3）吸取黄色上清（血清）到1.5mL离心管，-20℃保存；
（4）向抗凝管中加入2倍剩余液体体积PBS溶液进行稀释，轻轻混匀；
（5）取15mL离心管加入3mL人淋巴细胞分离液；
（6）将抗凝管内稀释后的液体缓慢加入到装有淋巴细胞分离液的15mL离心管，离心，2000rpm，20min（此步骤离心一定不能设置制动或设置低水平的制动，否则将分层混乱）；
（7）取一支干净的15mL离心管加入7mL含有适量DMEM的PBS溶液；
（8）吸取中间淡黄色淋巴细胞层到装有PBS的15mL离心管中，滴管吹打洗涤，离心，1500rpm，10min；
（9）弃上清，将红细胞裂解液加入离心管中，等待3min；
（10）加入PBS溶液洗涤，离心，1500rpm，10min；
（11）弃上清，再加入PBS溶液洗涤，离心，1500rpm，10min
（12）弃上清，离心管底沉淀即为PBMCs
3.2.2 PBMCs流式细胞染色
（1）加入适量含DMEM的PBS重悬细胞；
（2）取少许细胞悬液，滴加在细胞计数板盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。将计数板置于显微镜的低倍镜下观察，然后按公式计算：细胞数（mL）＝四大格细胞总数/4×104并计数；
（3）根据计数结果，取适量悬液到流式管中，按照一定的比例加入anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体，避光4℃孵育30min；
（4）避光加入PBS震荡洗涤，离心，1500rpm，10min；
（5）弃上清，再加入1mL PBS重复震荡洗涤细胞，1500rpm，10min；
（6）弃上清，沉淀即为anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC染色后的PBMCs，加入200uL PBS震荡重悬沉淀细胞，待流式细胞分析仪检测。
3.2.3 流式检测PBMCs
（1）根据待测样本实际情况，将待测PBMCs用美国BD FACSCantoTM Ⅱ流式细胞分析仪调节各项参数后进行检测；
（2）先同型对照上机检测，测定对照数据，以便划门；
（3）再将阳性待测样本上机检测；
24
陆军军医大学硕士学位论文
（4）将检测数据用FlowJo VX进行数据分析。
3.2.4 SPSS数理统计分析卵巢癌患者与健康对照组PBMCs流式结果
运用IBM SPSS Statistics 19进行统计学分析并用Graphpad prism 6做统计图，采用独立样本t检验进行统计，P＜0.05认为两组间有统计学差异。为了更好的统计分析各细胞亚群的表达情况，我们按表2进行细胞亚群分组比较。
表2 CD8+T细胞亚群分组
CD8+PD-1+亚群
PD-1+
PD-1+CD38+CD101-
PD-1+CD38-CD101+
PD-1+CD38+CD101+
PD-1+CD38-CD101-
CD8+PD-1-亚群
PD-1-
PD-1-CD38+CD101-
PD-1-CD38-CD101+
PD-1-CD38+CD101+
PD-1-CD38-CD101-
3.2.5临床病历资料及预后相关性分析
我们将整理好的临床资料数据和流式检测数据，运用IBM SPSS Statistics 19进行统计学分析并用Graphpad prism 6做统计图。将PD-1、CD38、CD101在CD8+T细胞表达频率，按中位数分为高、低表达，再用卡方检验来分析各CD8+T细胞亚群表达水平与临床相关性，但由于远端转移只有3例患者， R×C表中理论数小于5且R×C格子小于5的数目超过1/5，不符合卡方检验条件，故未做远端转移的相关性分析；以血清CA125检测值（≤35/＞35）U/ml和血清HE4检测值（≤76.2/＞76.2）pmol/ml分别将各CD8+T细胞亚群分组，再用非参数检验进行统计分析各CD8+T细胞与术后化疗疗效的相关性。
3.3 实验结果
3.3.1卵巢癌患者组与健康对照组外周血 CD8+T细胞表面PD-1的表达水平比较
我们流式细胞技术检测的96例卵巢癌患者组和26例健康对照组外周血CD8+T细胞表面PD-1的表达情况见（图2-1A），经统计分析卵巢癌患者外周血PD-1+CD8+T细胞的表达频率显著高于健康对照组，差异具有统计学意义;PD-1-CD8+T细胞的表达频率显著低于健康对照组，差异具有统计学意义。（p<0.01）（图2-1B）
25
陆军军医大学硕士学位论文
图2-1 卵巢癌患者组与健康对照组外周血CD8+T细胞表面PD-1的表达水平比较。A. 以CD3CD8阳性划门，检测卵巢癌患者与健康对照外周血中PD-1的表达情况。B. 96例卵巢癌患者与26例健康者外周血PD-1+/PD-1-CD8+T细胞频率的统计分析（p值来自独立样本T检验）。
3.3.2卵巢癌患者组与健康对照组外周血PD-1+CD8+T细胞表面CD38/CD101表达水平比较
我们分析了在PD-1+CD8+ T细胞表面CD38和CD101的单阳性以及双阳性细胞亚群表达水平（图2-2A）。结果显示，卵巢癌患者外周血PD-1+CD38-CD101+/PD-1+
CD38+CD101+CD8+T细胞亚群比例与健康人相比显著升高，PD-1+CD38+CD101-/PD-1+
CD38-CD101-CD8+T细胞亚群比例与健康人相比显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.001）（图2-2B）。
26
陆军军医大学硕士学位论文
图2-2 卵巢癌患者组与健康对照组外周血CD8+PD-1+T细胞表面CD38、CD101的表达水平比较。A. 以CD3+CD8+及PD-1+为门，分析卵巢癌患者与健康人外周血CD38、CD101的表达水平。B. 卵巢癌患者与健康人外周血CD38、CD101的表达水平比较的统计分析。
27
陆军军医大学硕士学位论文
3.3.3卵巢癌患者组与健康对照组外周血PD-1-CD8+T细胞表面CD38/CD101表达水平比较
我们分析了在PD-1-CD8+ T细胞表面CD38和CD101的单阳性以及双阳性细胞亚群表达水平（图2-3A）。结果显示，卵巢患者外周血PD-1-CD38-CD101+/PD-1-CD38+
CD101+CD8+T细胞亚群比例与健康人相比显著升高，PD-1-CD38+CD101-/PD-1-CD38-
CD101- CD8+T细胞亚群比例与健康人相比显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.001）（图2-3B）。
28
陆军军医大学硕士学位论文
图2-3卵巢癌患者组与健康对照组外周血PD-1-
CD8+T细胞表面CD38、CD101的表达水平比较。A.以CD3+CD8+及PD-1-为门，分析卵巢癌患者与健康人外周血CD38、CD101的表达水平。B. 卵巢癌患者与健康人外周血CD38、CD101的表达水平比较的统计分析。
3.3.4卵巢癌外周血CD8+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达水平的临床相关性分析
我们运用统计学卡方检验分析了卵巢癌患者外周血PD-1、CD38、CD101在CD8+T细胞比例与卵巢癌临床参数的相关性，结果显示：所有CD8+T细胞亚群均与患者年龄、组织病理学分级均不相关（P>0.05）（表3-1~表3-4）；总PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群频率均与卵巢癌临床病理参数不相关（P>0.05）（表3-1、表3-3）；CD38、CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群中的单阳性表达均与卵巢癌临床病理参数不相关（P>0.05）（表3-2），CD38/CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群中的双阳和双阴性表达与临床分期、肿瘤等级和淋巴结转移显著相关（P<0.05）（表3-1~表3-4）。
29
陆军军医大学硕士学位论文
表3-1 卵巢癌患者外周血PD-1+/PD-1+CD38+CD101+在CD8+T 细胞亚群比例与临床病理参数的相关性
Clinicopathological
Parameters
Age
<55
≥55
FIGO
Early (I-II)
Advanced(III-IV)
Pathological grade
Well/Moderately
differentiated(G1-G2)
Poorly differentiated(G3)
Tumor grade
T1 -T2
T3-T4
Lymph node metastasis
N0
N1
n
54
42
24
72
45
51
25
71
26
70
PD-1+
low
30
18
8
40
18
30
8
40
9
39
high
24
24
16
32
27
21
17
31
17
31
p
value
0.304
0.059
0.101
0.062
0.053
PD-1+CD38+CD101+
low
29
19
18
30
27
30
18
30
20
28
high
25
23
6
42
18
21
7
41
6
42
p
value
0.537
0.009
0.101
0.019
0.002
注：用卡方检验计算p值，黑体表示有统计学有差异。
表3-2 卵巢癌患者外周血CD38、CD101在PD-1+CD8+T 细胞亚群单表达以及双阴表达比例与临床病理参数的相关性
Clinicopathological
Parameters
Age
＜55
≥55
FIGO
Early(Ⅰ-Ⅱ)
n
54
42
24
CD38+CD101-
low
30
18
16
high
24
24
8
p
value
0.304
0.098
30
CD38-CD101+
low
22
26
15
high
32
16
9
p
value
0.063
0.238
CD38-CD101-
low
29
19
6
high
25
23
18
p
value
0.537
0.009
陆军军医大学硕士学位论文
Advanced(Ⅲ-Ⅳ)
Pathological grade
Well/Moderately
differentiated(G1-G2)
Poorly
differentiated(G3)
Tumor grade
T1 -T2
T3-T4
Lymph node
metastasis
N0
N1
72
45
32
18
40
27
0.101
33
15
39
20
42
26
30
19
0.22
0.051
51
25
71
26
70
30
15
33
16
32
21
10
38
10
38
33
17
31
15
33
18
8
40
11
37
0.062
0.491
22
7
41
8
40
29
18
30
18
30
0.019
0.038
0.352
0.251
注：用卡方检验计算p值，黑体表示有统计学有差异。
表3-3 卵巢癌患者外周血PD-1-/PD-1-CD38+CD101+在CD8+T
细胞亚群比例与临床病理参数的相关性
Clinicopathological
Parameters
Age
<55
≥55
FIGO
Early (I-II)
Advanced(III-IV)
Pathological grade
Well/Moderately
differentiated(G1-G2)
Poorly differentiated(G3)
54
42
24
72
45
51
24
24
16
32
27
21
n
PD-1-
low high
30
18
8
40
18
30
0.101
0.059
p
value
0.304
30
18
4
44
22
26
PD-1-CD38+CD101+
low
24
24
20
28
23
25
1.000
0.0004
high
p
value
0.304
31
陆军军医大学硕士学位论文
Tumor grade
T1 -T2
T3-T4
Lymph node metastasis
N0
N1
25
71
26
70
17
31
17
31
8
40
9
39
0.053
0.062
5
43
4
44
22
26
22
26
0.0001
0.0002
注：用卡方检验计算p值，黑体表示有统计学有差异。
表3-4卵巢癌患者外周血CD38、CD101在PD-1-CD8+T 细胞亚群单表达
以及双阴表达频率与临床病理参数的相关性
Clinicopathological
Parameters
Age
<55
≥55
FIGO
Early (I-II)
Advanced (III-IV)
Pathological grade
Well/Moderately
differentiated(G1-G2)
n
54
42
24
72
45
CD38+CD101-
low
28
20
14
34
27
21
14
34
15
33
high
26
22
10
38
18
30
11
37
11
37
0.491
0.642
0.101
0.440
p
value
0.837
CD38-CD101+
low
24
24
15
33
26
22
15
23
15
33
high
30
18
9
39
19
29
10
38
11
37
p
value
0.304
0.238
0.22
CD38-CD101-
low
30
18
2
46
22
26
5
43
3
45
high
24
24
22
26
23
25
22
26
23
25
p
value
0.304
0.000002
1.000
0.0002
0.00006
0.093
0.491
Poorly differentiated(G3) 51
Tumor grade
T1 -T2
T3-T4
Lymph node metastasis
N0
N1
25
71
26
70
注：用卡方检验计算p值，黑体表示有统计学有差异。
3.3.5卵巢癌外周血CD8+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达频率与治疗效果的相关性分析
32
陆军军医大学硕士学位论文
血清CA125和HE4是常用的卵巢癌诊断的生物标志物，评估对卵巢癌治疗的效果，用于监测病情进展以及卵巢癌患者的疾病复发。临床上，血清CA125正常值为≤35U/ml，HE4≤76.2pmol/ml，所以我们将卵巢癌患者术后经一次化疗治疗后血清CA125检测值（≤35/＞35）U/ml和血清HE4检测值（≤76.2/＞76.2）pmol/ml分别将各CD8+T细胞亚群分组，再用非参数检验进行统计分析各CD8+T细胞亚群频率与治疗效果的关系。结果显示（图3）：PD-1+CD8+T细胞表达频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38、CD101在PD-1+CD8+T细胞亚群上单表达频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38/CD101在PD-1+CD8+T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。PD-1-CD8+T细胞表达频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38在PD-1-CD8+ T细胞亚群上表达频率与疗效不相关(p>0.05)，CD101在PD-1-CD8+ T细胞亚群上表达频率与疗效显著相关(p<0.05)，CD38/CD101在PD-1-CD8+ T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。
33
陆军军医大学硕士学位论文
34
陆军军医大学硕士学位论文
35
陆军军医大学硕士学位论文
图3 卵巢癌患者外周血各CD8+T细胞表达频率与治疗后血清CA125和HE4检测值恢复情况的统计分析。
3.4 小 结
本章实验中，我们成功运用梯度密度离心法分离了卵巢癌患者组和健康对照组PBMCs，anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体染色后，用FCM检测分析PD-1+/PD-1-CD8+T细胞各亚群频率。用独立样本T检验统计分析卵巢癌患者组与健康对照组PD-1+/PD-1-CD8+T细胞各亚群频率。结果显示：卵巢癌患者组外周血PD-1+CD8+T细胞亚群中，总PD-1+CD8+T细胞频率显著高于健康对照组，PD-1+CD38-CD101+/PD-1+CD38+CD101+CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著升高，PD-1+CD38+CD101-
/PD-1+CD38-CD101- CD8+T细胞亚36
陆军军医大学硕士学位论文
群频率比健康对照组显著降低；在PD-1-CD8+T细胞亚群中，总PD-1-CD8+T细胞频率显著低于健康对照组，PD-1-CD38-CD101+/PD-1-CD38+CD101+CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著升高，PD-1-CD38+CD101-/PD-1-CD38-CD101-CD8+T细胞亚群频率比健康对照组显著降低。
我们运用统计学卡方检验分析了卵巢癌患者外周血PD-1、CD38、CD101在CD8+T细胞上表达频率与卵巢癌临床参数的相关性，结果显示：所有CD8+T细胞亚群均与患者年龄、组织病理学分级不相关（p>0.05）；总PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群频率均与卵巢癌临床病理参数不相关（p>0.05）；CD38、CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群中的单阳性表达均与卵巢癌临床病理参数不相关（p>0.05），CD38/CD101在PD-1+/PD-1-CD8+T细胞亚群中的双阳和双阴性表达与临床分期、肿瘤等级和淋巴结转移显著相关(p<0.05)。
我们还分析了卵巢癌外周血CD8+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达频率与术后化疗疗效的相关性。结果显示：总PD-1+CD8+T细胞表达频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38、CD101在PD-1+CD8+ T细胞亚群上单表达与疗效也不相关(p>0.05)，但CD38/CD101在PD-1+CD8+T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。总PD-1-CD8+T细胞频率与疗效不相关(p>0.05)，CD38在PD-1-CD8+ T细胞亚群上表达频率与疗效不相关(p>0.05)，但CD101在PD-1-CD8+ T细胞亚群上表达频率与疗效显著相关(p<0.05)，且CD38/CD101在PD-1-CD8+ T细胞亚群上双阳性和双阴性表达频率与疗效显著相关(p<0.05)。
上述结果说明，在卵巢癌患者外周血中PD-1在CD8+T细胞高表达，CD38/CD101在PD-1+CD38+T细胞上也是高表达。通过临床病理参数统计分析发现PD-1+CD8+T细胞上，高表达CD38/CD101的患者组病情较低表达CD38/CD101更严重。卵巢癌外周血CD8+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达频率与疗效的相关性分析结果与文献报道的高表达CD38/CD101的PD-1+CD8+T细胞的处于持续耗竭状态相吻合，该群细胞将无法再次活化和发挥T细胞抗肿瘤功能。CD38和CD101双阳和双阴性表达频率有利于辅助卵巢癌的诊断和判断疗效，也可以用于辅助预测治疗后病情的进展。同时还间接支持了在卵巢癌患者外周血PD-1+CD8+T细胞上低表达CD38/CD101的术后化疗疗效优于高表达CD38/CD101这一假说。
37
陆军军医大学硕士学位论文
第四章 CD38和CD101在卵巢癌TILs PD-1+CD8+T淋巴细胞上
表达与临床相关性分析
TIL是白细胞，例如T细胞，B细胞，巨噬细胞或自然杀伤细胞，其已经离开脉管系统并且已经位于肿瘤基质或上皮内。TIL通常被分隔为穿透肿瘤小岛（上皮内）和那些位于瘤周间隙（间质）的。上皮内TIL在免疫系统，被认为在控制几乎所有实体瘤中的肿瘤生长方面起着广泛的作用，其中也包括了卵巢癌[51]。虽然现在已经明确CD8+或CD4+T细胞可以识别癌症抗原或过度表达自身抗原并抑制癌症的进展，但是一些癌细胞会阻碍免疫识别和应答。如果内源性免疫系统能够识别组织中正在生长的肿瘤，它会增加损伤部位的炎症信号[52]。在这种情况下，肿瘤特异性抗原呈递细胞引发T细胞的应答，IFN-γ等细胞因子促进局部炎症，导致肿瘤完全破坏。存活的肿瘤进入平衡期，细胞因子和淋巴细胞攻击形式的免疫选择压作用与肿瘤生长维持平衡。这种情况直到免疫选择压作用迅速变异并且不稳定，肿瘤细胞即获得免疫抗性。最后，肿瘤可进入逃逸阶段，逃避免疫识别和杀伤，变成恶性肿瘤，最终转移[52]。
前期我们研究了卵巢癌患者组和健康对照组外周血CD8+T细胞上PD-1、CD38、CD101表达差异及其临床意义。肿瘤的侵袭范围一般仍在肿瘤组织范围内（包括浸润的淋巴结），一般肿瘤中都有大量的正常细胞存在的。为了进一步验证结果的准确性和有效性，我们探索了卵巢癌TILs CD8+ T细胞上PD-1、CD38、CD101表达及其临床意义。我们用FCM检测卵巢癌TILs中PD-1、CD38、CD101在CD8+T细胞亚群的表达频率，用以探讨卵巢癌组织CD8+ T细胞上PD-1、CD38、CD101的表达及其临床意义。进一步验证卵巢癌患者PBMCs研究结果的可靠性，为卵巢癌临床诊断、治疗以及预后提供参考依据。
4.1 实验材料
4.1.1 病历资料
本课题实验样本来源于来源于15名卵巢癌手术患者。排除标准为：卵巢良性肿瘤，腹部结核，卵巢囊肿，其他转移癌。其中，年龄44-65岁。15例患者根据美国国立综合癌症网络（NCCN）TNM分期（第四版，2017年）进行临床资料统计：I~II期3例，III~IV期12例。组织病理学分级：高中分化4例，低分化11例。淋巴结转移情况；有淋巴结转移者12例，无淋巴结转移者3例。远处转移情况：有远处转移者0例，无38
陆军军医大学硕士学位论文
远处转移者15例，由于远处转移样本量为0，后续的数理统计未做此参数分析。患者血清CA125和HE4检测值数据均为手术后经一次化疗治疗后的检测值，且15例患者入院检查时CA125>35U/ml，HE4>76.2pmol/ml。所有患者均于2017年3月至2018年2月在中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院妇产科就诊。这些患者和健康对照的临床特征见（表4）。受试者在参与之前，所有患者均获得书面知情同意书。本研究也经陆军军医大学伦理委员会批准。
表4 15例卵巢癌组织样本患者临床病历资料
临床病理参数
年龄（最小值-最大值）
临床分期（I~II期/III~IV期）
组织病理学分级（高中分化/低分化）
淋巴结转移（无（N0）/有（N1））
远端转移（无（M0）/有（M1））
CA125(U/ml)（≤35/＞35）
HE4(pmol/ml)（≤76.2/＞76.2）
病例数（15）
37-68
3/12
4/11
3/12
15/0
4/11
4/11
4.1.2主要试剂
试剂名称
PBS
IV型胶原酶
胰酶
人淋巴细胞分离液
红细胞裂解液
anti-CD3-PerCP
anti-CD8-FICT
anti-PD-1-PE/Cy7
anti-CD38-PE
anti-CD101-APC
DMEM培养基
39
公司
合肥biosharp公司
美国GIBCO公司
美国GIBCO公司
挪威Axis-Shield公司
合肥biosharp公司
美国BioLegend公司
美国eBioscience公司
美国BioLegend公司
美国Invitrogen公司
美国BioLegend公司
美国Hyclone公司
陆军军医大学硕士学位论文
4.1.3主要实验仪器和器材
仪器名称
微量加样枪
BD FACSCantoTMⅡ流式细胞分析仪
水平离心机
流式管
15ml离心管
1.5mL离心管
滴管
4℃冰箱
10cm培养皿
200目筛网
恒温摇床
公司
德国Eppendorf公司
美国BD公司
长沙平凡仪器有限公司
美国BD公司
无锡Nest公司
无锡Nest公司
上海晶安公司
中国海尔公司
中国Biosharp公司
中国易佰聚公司
中国上海世平公司
4.2 实验方法
4.2.1 分离卵巢癌TILs
（1）取新鲜待分离组织用PBS清洗干净；
（2）将洗净组织放入培养皿中，加入3ml血清剪碎或1mm左右组织碎片；
（3）向培养皿中加入3-4ml IV胶原酶（0.1 mg/ml）和2-3ml胰酶；
（4）将培养皿中组织碎片和混合液转移到15ml离心管中，放入37℃恒温摇床，低速缓慢摇晃消化1.5-2h（每20-30min观察一次，并拿出离心管震荡一次）；
（5）将消化后的细胞悬液过200目筛网，并轻轻研磨剩下的组织碎片（可加入适量DMEM冲洗200目筛网）；
（6）取15ml离心管加入3ml人淋巴细胞分离液，将过滤的单细胞悬液缓慢铺于淋巴细胞分离液上，离心，2000rpm，20min（此步骤离心一定不能设置制动或设置低水平的制动，否则将分层混乱）；
（7）吸取中间淡黄色淋巴细胞层到装有PBS的15mL离心管中，滴管吹打洗涤，离心，1500rpm，10min；
（8）弃上清，将红细胞裂解液加入离心管中，等待3min；
（9）加入PBS溶液洗涤，离心，1500rpm，10min；
40
陆军军医大学硕士学位论文
（10）弃上清，再加入PBS溶液洗涤，离心，1500rpm，10min
（11）弃上清，离心管底沉淀即为组织淋巴细胞
4.2.2 卵巢癌TILs流式染色
（1）在15ml离心管中，加入含适量DMEM的PBS重悬细胞；
（2）取少许细胞悬液，滴加在细胞计数板盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。将计数板置于显微镜的低倍镜下观察，然后按公式计算：细胞数（mL）＝四大格细胞总数/4×104并计数；
（3）根据计数结果，取适量悬液到流式管中，按照一定的比例加入anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC流式抗体，避光4℃孵育30min；
（4）避光加入PBS震荡洗涤，离心，1500rpm，10min；
（5）弃上清，再加入1mL PBS重复震荡洗涤细胞，1500rpm，10min；
（6）弃上清，沉淀即为anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FICT、anti-PD-1-PE/Cy7、anti-CD38-PE和anti-CD101-APC染色后的组织淋巴细胞，加入200uL PBS震荡重悬沉淀细胞，待流式细胞分析仪检测。
4.2.3 流式细胞术检测卵巢癌TILs
（1）根据待测样本实际情况，将待测TILs用美国BD FACSCantoTM Ⅱ流式细胞分析仪调节各项参数后进行检测；
（2）先同型对照上机检测，测定对照数据，以便划门；
（3）再将阳性待测样本上机检测；
（4）将检测数据用FlowJo VX进行数据分析。
4.2.4 SPSS数理统计分析卵巢癌TILs流式结果
运用IBM SPSS Statistics 19进行统计学分析并用Graphpad prism 6做统计图，采用非参数检验进行统计，P＜0.05认为两组间有统计学差异。为了更好的统计分析各细胞亚群的表达情况，我们按表2进行细胞亚群分组比较。
4.2.5临床病历资料相关性分析
我们将整理好的临床资料数据和流式检测数据，运用IBM SPSS Statistics 19进行统计学分析并用Graphpad prism 6做统计图。以卵巢癌患者临床病理参数以及术后经一次化疗治疗后血清CA125检测值（≤35/＞35）U/ml和血清HE4检测值（≤76.2/＞76.2）pmol/ml分别将各CD8+T细胞亚群分组，再用非参数检验进行统计分析各CD8+T细胞亚群频率与治疗效果的关系。
41
陆军军医大学硕士学位论文
4.3 实验结果
4.3.1卵巢癌组织浸润淋巴细胞流式细胞技术检测结果
我们采集了15例卵巢癌患者手术切除癌组织，分离组织中浸润淋巴细胞，流式染色后用BD FACSCantoTM Ⅱ流式细胞分析仪检测了5标记细胞。用FlowJo VX分析流式检测结果（图4），以同型对照结果划门，划门原则同PBMCs流式细胞技术检测结果，分析了TILs中各CD8+T细胞亚群的频率。结果显示：在卵巢癌组织浸润的细胞中，PD-1+CD8+T细胞频率46.84±13.81%，PD-1+CD38+CD101-CD8+细胞频率36.42±16.55%，PD-1+CD38-CD101+CD8+细胞频率13.22±6.81%，PD-1+CD38+CD101+
CD8+细胞频率41.233±15.01%，PD-1+CD38+CD101+CD8+细胞频率39.4±18.47%；PD-1-CD8+T细胞频率53.16±13.81%，PD-1-CD38+CD101-CD8+细胞频率25.8±10.27%，PD-1-CD38-CD101+CD8+细胞频率19.36±10.32%，PD-1-CD38+CD101+CD8+细胞频率19.04±15.43%，PD-1-CD38-CD101-CD8+细胞频率45.15±20.78%。
图4 卵巢癌TILs流式检测结果。用荧光染料标记的单克隆抗体对浸润淋巴细胞进行如下染色:
anti-CD3-PerCP,anti-CD8-FICT,anti-PD-1-PE/Cy7,anti-CD38-PE,anti-CD101-APC。同型对照使用正常小鼠，山羊或兔IgG用作阴性对照。划门策略同前。
42
陆军军医大学硕士学位论文
4.3.2卵巢癌TILs CD8
+ T淋巴细胞表面PD-1、CD38、CD101表达频率与临床相关性分析
血清CA125和HE4是常用的卵巢癌诊断的生物标志物，评估对卵巢癌治疗的效果，用于监测病情进展以及卵巢癌患者的疾病复发。临床上，血清CA125正常值为≤35U/ml，HE4≤76.2pmol/ml，所以我们以治疗后血清CA125检测值（≤35/＞35）U/ml和血清HE4检测值（≤76.2/＞76.2）pmol/ml以及临床病理参数分别将各CD8+T细胞亚群分组，再用非参数检验进行统计分析各CD8+T细胞亚群频率与临床病理参数和治疗效果的相关性。结果显示（图5）：
1. PD-1+CD8+T细胞亚群比例与年龄、临床分期、组织病理学分级、淋巴结转移以及术后经一次化疗后血清CA125和HE4检测值均无关（P＞0.05）（图5-1）；
图5-1 PD-1+在CD8+淋巴细胞的比例与临床病理参数相关性
2. PD-1+CD38+CD101- CD8+T细胞亚群比例与年龄、临床分期、淋巴结转移以及术后经一次化疗后血清CA125和HE4检测值无关（P＞0.05），其与组织病理学分级相关（P＜0.05）。组织病理高、中分化较组织病理低分化PD-1+CD38+CD101- CD8+T细胞亚群比例低（图5-2）；
43
陆军军医大学硕士学位论文
图5-2 PD-1+CD38+CD101-在CD8+淋巴细胞的比例与临床病理参数相关性
3. PD-1+CD38-CD101+ CD8+T细胞亚群比例与年龄、临床分期、组织病理学分级、淋巴结转移以及术后经一次化疗后血清CA125和HE4检测值均无关（P＞0.05）（图5-3）；。
图5-3 PD-1+CD38-CD101+在CD8+淋巴细胞的比例与临床病理参数相关性
44
陆军军医大学硕士学位论文
4. PD-1+CD38+CD101+ CD8+T细胞亚群比例与年龄和组织病理学分级无关（P＞0.05），其与临床分期、淋巴结转移以及血清CA125和HE4检测值相关（P＜0.05）。临床分期（I-II）较临床分期（III-IV）PD-1+CD38+CD101+ CD8+T细胞亚群比例低；未发生淋巴结转移较发生淋巴结转移PD-1+CD38+CD101+ CD8+T细胞亚群比例低。血清CA125和HE4检测值恢复正常值范围内较未恢复PD-1+CD38+CD101+ CD8+T细胞亚群比例低。说明PD-1+CD38+CD101+ CD8+T细胞亚群比例低的患者治疗效果优于比例高的患者（图5-4）；
图5-4 PD-1+CD38+CD101+在CD8+淋巴细胞的比例与临床病理参数相关性
5. PD-1+CD38-CD101-CD8+T细胞亚群比例与年龄和组织病理学分级无关（P＞0.05），其与临床分期、淋巴结转移以及血清CA125和HE4检测值相关（P＜0.05）。临床分期（I-II）较临床分期（III-IV）PD-1+CD38-CD101CD8+T细胞亚群比例高；未发生淋巴结转移较发生淋巴结转移PD-1+CD38-CD101-CD8+T细胞亚群比例高。血清CA125和HE4检测值恢复正常值范围内较未恢复PD-1+CD38-CD101- CD8+T细胞亚群比例高。说明PD-1+CD38-CD101- CD8+T细胞亚群比例高的患者可能在治疗效果优于比例低的患者（图5-5）；
45
陆军军医大学硕士学位论文
图5-5 PD-1+CD38-CD101-在CD8+淋巴细胞的比例与临床病理参数相关性
6. PD-1-CD8+T细胞亚群比例与年龄、临床分期、组织病理学分级、淋巴结转移以及术后经一次化疗后血清CA125和HE4检测值均无关（P＞0.05）（图5-6）；
图5-6 PD-1-在CD8+淋巴细胞的比例与临床病理参数相关性
46
版权声明：本文标题：人卵巢癌CD8-+PD-1-+T细胞CD38-CD101的表达及其临床意义 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://roclinux.cn/p/1708607378a527817.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
发表评论