人工冬虫夏草对IPF上皮间充质转_d3核转位和下游靶基因的干预作用_百

·194·

广东医学

2013

年

1

月第

34

卷第

2

期

GuangdongMedicalJournalJan．2013，Vol．34，No．2

人工冬虫夏草对

IPF

上皮间充质转分化过程中

Smad3

核转位和下游靶基因的干预作用

*

魏晓群

，

李时悦

△

广州医学院第一附属医院

、

广州呼吸疾病研究所

、

呼吸疾病国家重点实验室

（

广州

510120）

【

摘要

】

目的研究人工冬虫夏草

(culturedcordycepssinensis，Ccs)

在特发性肺纤维化

(idiopathicpulmonary

体外

fibrosis，IPF)

上皮间充质转分化

(epithelial－mesenchymaltransition)

过程中的干预作用和可能机制

。

方法

培养Ⅱ型肺泡上皮细胞系

A549，

以转化生长因子β

1

(TGF－

β

1

)5ng/

μ

L

诱导

A549

向肌成纤维细胞

(myofibro-

blast，MF)

转分化

。MTT

法测定不同浓度

(2.5、5.0、7.5、10

和

12.5mg/mL)Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

活化的

抑制作用

;Western－blotting

检测

10mg/mLCcs

对

A549

向

MF

转分化中

Smad3

蛋白表达的影响

;Real－timePCR

检测

10mg/mLCcs

对

A549

向

MF

转分化中Ⅰ型前胶原

(COL1A1)、

结缔组织生长因子

(CTGF)、

基质金属蛋白

酶

－2(MMP－2)、

血管生长因子

(VEGF)mRNA

表达的影响

。

结果

Ccs

可抑制

TGF－

β

1

诱导下

A549

的增殖活

化

(P＜0.05

和

P＜0.01)，

随药物浓度的增加

，

其抑制呈上升趋势

，

具有浓度依赖性

。10mg/mLCcs

可抑制

TGF－

CTGF、MMP－2、VEGFmRNA

表达水平

。

结下调

COL1A1、

β

1

诱导下

A549

向

MF

转分化中

Smad3

蛋白的核转位

，

论

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

增殖活化有抑制作用

，

可逆转

TGF－

β

1

诱导下

A549

转分化中

Smad3

的核转位

，

【

关键词

】

人工冬虫夏草

;

特发性肺纤维化

;A549;

转化生长因子β

1

;Smad3

CTGF、MMP－2、VEGF

等基因表达

，

通过下调

COL1A1、

延缓

IPF

的进展

。

肺纤维化

（pulmonaryfibrosis）

是多种肺部疾病的

［1］

最终转归

。

上皮间充质转分化

（epithelial－mesen-

chymaltransition，EMT）

是肺纤维化的关键事件

。EMT

受多种细胞因子和生长因子的调节

，

其中最重要的是

转化生长因子β

1

（TGF－

β

1

）。TGF－

β

1

是一种公认的

强烈致纤维化细胞因子

，

在肺纤维化的发生发展中起

重要的作用

。

寻找具有抑制

TGF－

β

1

致纤维化效应

的药物具有十分重要的临床意义

。

冬虫夏草是我国补

肺益肾的传统名药

，

应用于临床实践中已有

2000

多

年的历史

。

人工冬虫夏草

（culturedcordycepssinensis，

Ccs）Ccs

是以其无性型经人工培养发酵而成

，

具有相

［2］

似的化学成分

，

在防治肺纤维中已有一定的探讨

，

然

而

，

其具体作用机制仍十分不清楚

。2011

年

1

月至

2012

年

4

月本实验拟对

Ccs

的生物学作用进行探讨

，

toplasmicExtractionReagents

和

PierceECLWestern

BlottingSubstrate

为美国

Thermo

公司产品

；

总

RNA

分

离提取试剂

Trizol

为美国

Invitrogen

公司产品

；

逆转录

试剂盒

PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser

（PerfectRealTime）

及实时荧光定量试剂盒

SYBR

PremixExTaq

Ⅱ

（TliRNaseHPlus）

为

Takara

宝生物

公司产品

；Real－timePCR

引物由生工生物工程

（

上

海

）

有限公司合成

。

1．2

试剂和药物的配制

TGF－

β

1

储存液配制

：

按照

0.22

μ

m

滤器说明书将配置成

1000ng/mL

的贮存液

，

－20℃

保存备用

。Ccs

储存液的配制

：

将过滤除菌后

，

1

体积

Ccs

加入

11.5

倍体积高糖

DMEM

中

，

涡旋振荡

器混匀

，

多次

8000r/min，

离心

15min

后弃沉渣

，

直到

0.22

μ

m

滤器过滤除菌液完全澄清

，

未见原液颗粒

，

－20℃

保存备用

。

菌

，

配制成

0.1g/mLCcs

储存液

，

1.3

细胞来源Ⅱ型肺泡上皮细胞系

A549

本实验室

保存

，

购自

ATCC。

方法

Ⅱ型肺泡上皮细胞

A549

的培养用含

10%

胎牛血清和双抗的高糖

DMEM

培养液将

A549

培养于

着重观察

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下Ⅱ型肺泡上皮细胞

EMT

的影响

。

1

1．1

材料与方法

主要材料

Ccs

菌液为杭州中美华东制药提供

，

浓度为

1.25g/mL；

重组人

TGF－

β

1

为美国

Perprotech

1．4

1．4．1

公司产品

；

高糖

DMEM

培养基

、

胎牛血清为美国

Hy-

clone

公司产品

；MTT、DMSO

为美国

Amresco

公司产

品

；

兔抗人

GAPDH

单克隆抗体为

Sigma

公司产品

，

兔

抗人

Smad3

多克隆抗体为

Abcam

公司

；NuclearandCy-

*

广州市科技计划项目

（

编号

：2010－Y1－C251）

△通信作者

。

教授

，

硕士研究生导师

；E－mail：li．shiyue@yahoo．

com．cn

37℃，5%CO

2

培养箱中

，

每

3d

换液

1

次

，

细胞约

80%

0.25%

胰酶消化

、

融合时

，

传代

。

1．4．2MTT

比色法检测

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

4－1

细胞增殖活化的抑制作用将

A549

以

1×10·mL

接种于

96

孔板中

，

待细胞贴壁

24h

后

，

换用无血清高

糖

DMEM

同步化

24h，

使其处于

G

0

期

。

将细胞如下分

组

：（1）

对照组

：A549；（2）TGF－

β

1

诱导组

：A549+

广东医学

2013

年

1

月第

34

卷第

2

期

GuangdongMedicalJournalJan．2013，Vol．34，No．2

表

1

基因

GAPDH

Real－timePCR

引物序列

引物序列

（5'－3'）

正义链

：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC

反义链

：TGGTGAAGACGCCAGTGGA

COL1A1

正义链

：GAACGCGTGTCATCCCTTGT

反义链

：GAACGAGGTAGTCTTTCAGCAACA

CTGF

正义链

：GGCCCAGACCCAACTATGATTAG

反义链

：CTGCAGGAGGCGTTGTCATT

MMP－2

正义链

：TGATCTTGACCAGAATACCATCGA

反义链

：GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT

VEGF

正义链

：ACACACCCACCCACATACATAC

反义链

：TCTCTCATCTCCTCCTCTTCCC

·195·

TGF－

β

1

5ng/mL；（3）

不同浓度

Ccs

共干预组

：A549+

5、7.5、10TGF－

β

1

5ng/mL+Ccs（

终浓度分别为

2.5、

48、72h

后

，

和

12.5mg/mL）。

分别培养

24、

弃培养上

加入含有

0.5mg/mLMTT

无血清高糖

DMEM

清后

，

100

μ

L，

于

37℃

继续培养

4h

后

，

翻转弃上清

。

加入

150

μ

LDMSO，

振荡

10min

后于酶联免疫检测仪上检测

OD490

处吸光值

A

490

。

1．4．3Westernblotting

法检测

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

向肌成纤维细胞

(myofibroblast，MF)

转分化中

Smad3

蛋白表达影响

Ccs

浓度参考文献

［3］

取

10

mg/mL。

将细胞分为对照组

（A549），TGF－

β

1

诱导组

（A549+TGF－

β

1

5ng/ml）

和

Ccs

共干预组

（A549+

TGF－

β

1

5ng/mL+Ccs10mg/mL），

培育

48h

收集细

胞

。

按照

NuclearandCytoplasmicExtractionReagents

试

剂盒说明提取胞浆蛋白

。BCA

法测定蛋白浓度

。

以

80V30min，120V2h

电泳

，300mA90min

转膜

，

封闭

Smad31∶1000），HRP

标并加入一抗

（GAPDH1∶5000，

记二抗

（1∶10000）

后

，

进行

ECL

反应

。

扫描后

imageJ

1．43

分析结果

。

1．4．4Real－timePCR

法检测

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导

下

A549

向

MF

转分化中

I

型前胶原

(COL1A1)、

结缔

组织生长因子

(CTGF)、

基质金属蛋白酶

－2(MMP－

2)、

血管生长因子

(VEGF)mRNA

表达的影响实验分

并进行组及培养同

1.4.3。

采用

Trizol

法提取总

RNA，

实时荧光定量

PCR

反应

。Real－timePCR

扩增相关

GAPDH、COL1A1、CTGF、MMP－2、VEGF

基因

（

引物见

95℃

变性

5s，

表

1）。

反应条件为

：95℃

预变性

30s，

60℃

退火延伸

30s，

共

40

个循环

。

各基因相对表达量

采用

2

－

Δ

Ct

产物大小

（bp）

137

95

121

89

220

1．3

2

2．1

响

±s

表统计学方法实验数据所有计量资料用

x

珋

示

，

采用

SPSS13.0

统计软件进行单因素方差分析

。

结果

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

细胞表型改变的影

对照组

A549

呈圆形或多角形生长

；

在

TGF－

β

1

刺激

48h

后

，

可见细胞呈长梭状

，

细胞联系变松散

，

而

上述细胞形态可逆转

，

几经

10mg/mLCcs

共干预后

，

乎同对照组

。

2．2

用

A549

增殖活化具有抑制作用

，

除

72h2.5mg/mLCcs

外

，

余

Ccs

共干预组与同时间点对照组比较

，

差异有统

呈浓度依赖性

。

除计学意义

（P＜0.05

或

P＜0.01），

48h

和

72h2.5mg/mLCcs

组外

，

余

Ccs

共干预组与同

时间点

TGF－

β

1

诱导组比较

，

差异有统计学意义

（P＜

0.05

或

P＜0.01），

呈浓度依赖性

。

见表

2。

x±s

珋

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

增殖活化的抑制作

MTT

结果显示

，

不同浓度

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

进行计算

。

表

2Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

增殖活化的影响

（

吸光值

，n=6）

Ccs

作用时间

24h

0．168±0．001

0．163±0．005

＊△△

0．135±0．003

＊

＊△△

0．137±0．003

＊

＊△△

0．133±0．004

＊

＊△△

0．139±0．004

＊

＊△△

0．130±0．003

＊

组别

对照组

TGF－

β

1

诱导组

2．5mg/mLCcs

共干预组

5mg/mLCcs

共干预组

7．5mg/mLCcs

共干预组

10mg/mLCcs

共干预组

12．5mg/mLCcs

共干预组

48h

0．4610±0．032

0．4590±0．016

0．4060±0．043

*

＊△

0．3830±0．051

＊

＊△△

0．3700±0．061

＊

＊△△

0．3339±0．029

＊

＊△△

0．2480±0．031

＊

72h

1．094±0．083

1．049±0．081

0．920±0．097

＊△△

0．577±0．065

＊

＊△△

0．310±0．029

＊

＊△△

0．272±0．023

＊

＊△△

0．233±0．018

＊

与对照组比较

*P＜0．05，

＊＊

P＜0．01；

与

TGF－

β

1

诱导组比较△

P＜0．05，

△△

P＜0．01

2．3Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

向

MF

转分化中

Smad3

蛋白表达的影响

Westernblotting

结果显示

，

组别

表

3Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

向

MF

转分化中

Smad3

蛋白表达的影响

（n=3）

Smad3

蛋白表达量

1．010±0．080

0．720±0．077

*

0．990±0．061

△

x±s

珋

TGF－

β

1

刺激

48h

后

，Smad3

在胞浆中的表达明显下

降

，

与对照组比较

，

差异有统计学意义

（P＜0.05）；10

mg/mLCcs

共干预

48h

后

，

可上调

TGF－

β

1

诱导下

A549

胞浆中

Smad3

蛋白表达

，

与对照组比较

，

差异无

统计学意义

（P＞0.05），

与

TGF－

β

1

诱导组比较

，

差异

图

1。

有统计学意义

（P＜0.05）。

见表

3、

对照组

TGF－

β

1

诱导组

10mg/mLCcs

共干预组

*

与对照组比较

P＜0．05；

△与

TGF－

β

1

诱导组比较

P＜0．05

·196·

广东医学

2013

年

1

月第

34

卷第

2

期

GuangdongMedicalJournalJan．2013，Vol．34，No．2

COL1A1、MMP－2、CTGF、VEGF

等基因表达明显上调

，

与对照组比较

，

差异均有统计学意义

（P＜0.01）。10

mg/mLCcs

共干预

48h

后

，

可抑制

TGF－

β

1

诱导下上

述各基因表达的上调

，

与

TGF－

β

1

诱导组比较

，

除

图

1Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

向

MF

转分化中

Smad3

蛋白表达

影响

VEGF

外

，

差异有统计学意义

（P＜0.01）。

见表

4。

3

讨论

特发性肺纤维化

（idiopathicpulmonaryfibrosis，

IPF）

是一种慢性

、

弥漫性

、

致纤维化性间质性肺疾病

，

其病因未明

，

预后不良

。

肺泡上皮细胞

（AECs）

向肺

x±s

珋

2．4Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

向

MF

转分化中

COL1A1、MMP－2、CTGF、VEGFmRNA

表达的影响

Real－timePCR

结果显示

，TGF－

β

1

刺激

48h

后

，

表

4

分组

对照组

TGF－

β

1

诱导组

10mg/mLCcs

共干预组

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

A549

向

MF

转分化中各基因表达

（n=3）

A549

COL1A1

1．00±0．063

12．06±1．423

*

1．83±0．019

△

MMP－2

1．00±0．174

5．89±0．364

*

1．20±0．025

△

CTGF

1．00±0．128

7．85±0．322

*

4．01±0．089

△

VEGF

1．00±0．496

7．05±4．396

*

3．09±1．115

*

与对照组比较

P＜0.01；

△与

TGF－

β

1

诱导组比较

P＜0.01

MF

转分化是参与肺纤维化的重要机制之一

［4］

。

TGF－

β

1

是

IPF

形成和发展的关键性细胞因子

，

与

EMT

的发生密切相关

［5］

。

寻找有效拮抗

TGF－

β

1

和

EMT

的药物是治疗肺纤维化的热点

。

冬虫夏草是我国中药三大瑰宝之一

，

具有益精髓

、

补虚损

、

纳气平喘等作用

。

冬虫夏草始见于公元

1694

《

本草备要

》，

年的指出其具有

“

保肺益肾

，

止血化痰

，

止劳咳

”

之功效

。

然而冬虫夏草产量有限

，

价格昂贵

，

不能被广泛应用

。

本实验采用的

Ccs

是应用现代生物

工程技术低温发酵精制而成的

，

其采用菌种为中华束

［6］

丝孢

，

是目前唯一得到学术界公认的冬虫夏草有效

Ccs

以剂量依赖性方式抑制

TGF－

β

1

菌

。

本实验中

，

拮抗

TGF－

β

1

诱导下

Smad3

的核转位

，

并且可抑表达

，

CTGF、MMP－2、COL1A1

靶制

TGF－

β

1

诱导下

VEGF、

基因的表达

，

提示

Ccs

对

EMT

有阻滞作用

，

一定程度

［10］

上延缓肺纤维化的进展

。

国内研究表明

，

冬虫夏草

可抑制卵清白蛋白致哮喘大鼠气道壁

TGF－

β

1

表达

和胶原沉积

，

上调

Smad7

表达而改善气道重塑的症状

。

也发现

，

虫草菌粉可抑制单侧输尿管梗阻大

鼠肾间质

TGF－

β

1

依赖性

p－smad2/3

信号通路延缓

张浩等

肾间质纤维化的进展

。

杨礼腾认为虫草菌液具有

抑制胶原过度沉积的作用

，

可能与抑制

TGF－

β

1

表

干扰

TGF－

β

－Smad

信号通路对靶基因的激活有达

，

关

。

此外

，

虫草菌粉可通过调整Ⅰ型

/

Ⅱ型细胞因子平

［13］

衡而对肺纤维化有预防作用

。

因此

，

本实验初步证

Ccs

可抑制

TGF－

β

1

诱导的

AECs

的

EMT，

实

，

可能与

［12］

［11］

诱导下

A549

的增殖活化

，

随着药物干预浓度的增加

，

对

A549

的抑制效应越明显

；

且可逆转

TGF－

β

1

诱导

下

A549

表型的改变

。AECs

是肺纤维化发生与发展过

AECs

大量增殖和功能改变

，

程的靶细胞

，

可产生大量

致纤维化细胞因子和生长因子参与肺纤维化

。

本实验

Ccs

对

TGF－

β

1

诱导下

AECs

增殖和表型改结果表明

，

变有抑制作用

，

提示

Ccs

对

IPF

有治疗作用

。

这与闵

［7］

亚丽等将

Ccs

应用于肾纤维化动物研究中的结果相

结果表明

Ccs

可下调

TGF－

β

1

表达

，

抑制上皮细一致

，

［8］

胞向

MF

转化

。

在体外实验同样证实

，

冬虫夏草水

提物通过诱导细胞凋亡而抑制

A549

的增殖

。

陈涛

［9］

等也发现

，

虫草多糖可抑制

TGF－

β

1

诱导人肾小管

其阻滞

TGF－

β

1

下游信号转导因子

Smad3

核转位有

并通过下调

TGF－

β

－Smad

信号通路下游效应因关

，

CTGF、MMP－2

和

COL1A1

的表达

，

子

VEGF、

从而延缓

肺纤维化的进展

。

本实验为进一步探讨

Ccs

治疗肺纤

维化提供一定的理论依据

。

参考文献

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上皮

EMT。

Smad3

是

TGF－

β

1

/Smad

信号转导通路的主要信

TGF－

β

1

可将胞浆中

Smad3

磷酸化并转号转导分子

，

CTGF、MMP－2

至胞核中而介导

EMT

的发生

。VEGF、

和

COL1A1

是

TGF－

β

1

－Smad3

下游的重要效应因

子

，

它们的过度表达可明显促进肺纤维化的进展

。

本

Ccs

可上调

A549

胞浆中

Smad3

蛋白的研究结果表明

，

广东医学

2013

年

1

月第

34

卷第

2

期

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收稿日期

：2012－07－22

编辑

：

祝华

）