SG融合蛋白

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.8

(22)申请日 2008.10.20

(71)申请人 中国人民解放军第二军医大学

地址 200433 上海市翔殷路800号

(72)发明人 居小萍 张晓青 徐斌 刘永明 陈樱

(74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限公司

代理人 丁振英

(51)

C07K19/00

C12N15/62

A61K38/19

A61P7/00

A61P37/04

(10)申请公布号 CN 101372513 A

(43)申请公布日 2009.02.25

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

SG融合蛋白

(57)摘要

本发明涉及医学生物学技术领域，

目前临床常用于造血损伤修复的药物是

GM－CSF、G－CSF，GM－CSF主要作用

于粒单系祖细胞，促进其增殖分化，它对

造血干细胞、髓系多能祖细胞以及红系、

巨核系造血均有作用。但是它促进造血增

殖的作用为暂时性，维持时间短暂，停药

后效果即消失。本发明提供一种可用于预

防和治疗放、化疗所引起的造血损伤和具

有增强免疫功能的融合蛋白。编码本发明

SG融合蛋白的基因具有如SEQ ID NO：4

所示的核苷酸序列，全长为850bp。体外

生物学实验显示本发明的SG融合蛋白能

促进骨髓集落细胞形成，能有效趋化未成

熟的树突状细胞，其作用强于GM－CSF。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种SG融合蛋白，编码该蛋白的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的SG融合蛋白在制备用于预防和治疗放疗或化疗所引起的造

血损伤药物中的应用。

3.如权利要求1所述的SG融合蛋白在制备用于增强免疫功能药物中的应用。

说 明 书

技术领域：

本发明涉及医学生物学技术领域，是一种可用于预防和治疗放、化疗所引起的造血

损伤和具有增强免疫功能的融合蛋白。

背景技术：

放疗和化疗是治疗多种恶性肿瘤的有效手段，肿瘤患者在放、化疗过程中造血系统

最容易诱发损伤，同时出现免疫功能下降。目前同步放化疗的应用提高了肿瘤患者

的生存率，但患者的造血和免疫系统损伤加重，使得感染、出血等并发症的发生率

增加，影响疗效，因此尽快重建造血功能对治疗顺利进行至关重要。目前临床常用

于造血损伤修复的药物是GM-CSF、G-CSF，GM-CSF主要作用于粒单系祖细胞，

促进其增殖分化，它对造血干细胞、髓系多能祖细胞以及红系、巨核系造血均有作

用。但是它促进造血增殖的作用为暂时性，维持时间短暂，停药后效果即消失，因

此寻找新的能够修复造血损伤，同时尽快恢复患者免疫功能的方法十分必要。

近年来趋化因子及其受体在造血调控中的作用日益引起人们的关注，趋化因子超家

族的成员多为分子量8～12KD的小分子蛋白，现在已经知道有5O多种趋化因子，

其中基质细胞衍生因子(stromal cellderived factor，SDF-1)对造血功能的调节显得最

为突出。SDF-1属CXC型趋化因子，较低浓度的SDF-1能够产生趋化及抗肿瘤免

疫反应。同时不会诱导肿瘤细胞产生对放化疗的抵抗作用。SDF-1可与多种造血生

长因子协同，促进髓系、巨核系造血前体细胞的增殖与分化。

GM-CSF是一种能促进骨髓粒系、单核细胞系、巨噬细胞系发育和成熟，增加外周

血成熟粒细胞、单核细胞功能的一种细胞因子，主要应用于各种原因引起的白细胞

减少症，与其它造血调控因子如EPO、G-CSF不同，它不是刺激单一一种细胞增

殖，而是作用于多种细胞而发挥效应。临床已应用于放化疗患者的造血恢复，但效

果不十分满意，大部分患者停药后白细胞即下降，再次应用疗效不佳。

发明内容：

本发明的目的是提供一种可用于预防和治疗放、化疗所引起的造血损伤和具有增强

免疫功能的融合蛋白。

本申请人在实验中发现当SDF-1与GM-CSF联用后，能够快速趋化、动员造血干/

祖细胞，促进造血重建效应，与单独应用GM-CSF相比，效果更为迅速和持久。

本发明构建SDF-1与GM-CSF的融合基因，该融合基因由SDF1基因、rhGM-CSF

基因，连接肽设计合成。

SDF-1基因(genebank号AY802782)序列如SEQ ID NO:1所示，具体序列如下：

atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60

gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240

gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatg 279

rhGM-CSF基因(genebank号M11734)序列如SEQ ID NO:2所示，具体序列如下：

aaagttctct ggaggatgtg gctgcagagc ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc 60

atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc agcacacagc cctgggagca tgtgaatgcc 120

atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa 180

acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc 240

ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc 300

atgatggcca gccactacaa acagcactgc cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc 360

cagattatca cctttgaaag tttcaaagag aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc 420

tttgactgct gggagccagt ccaggagtga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg 480

gagctgctct ctcatgaaac aagag 505

连接肽为(Gly₄Ser)₃，编码该连接肽的基因序列如

SEQ ID NO:3所示，具体序列如下：

本发明提供一种SG融合蛋白，编码该蛋白的基因具有如SEQ IDNO:4所示的核苷

酸序列，全长为850bp，具体序列如下：

cgccaaggtcgtggtcgtgctggtcctcgtgctgaccgcgctctgcctcagcgacgggaagcccgtcagcctgagctacagat

gcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtcaagcatctcaaaattctcaacactccaaactgtgcccttcag

attgtagcccggctgaagaacaacaacagacaagtgtgcattgacccgaagctaaagtggattcaggagtacctggagaaagc

tttaaacaagaggttcaagatgaaagttctctggaggatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatct

ctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacacagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaa

cctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgccta

cagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagc

cactacaaacagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctga

aggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtgagaccggccagatgaggctggccaagccggg

gagctgctctctcatgaaacaagagTGAGAATTC

Stop EcoRI

上述基因中，头尾部分添加了酶切位点，CTC GAG和GAA TTC；中间部分用小

写字母表示的为目的序列，加框的为连接肽；末尾添加了终止密码子TGA，通过

XhoI/EcoRI这两个位点亚克隆入pPIC9k载体中。

SG融合蛋白的表达，因为pPIC9K质粒载体带有两个Xho I位点，分别位于

1193(MCS)和5710处，需要将5710处的XhoI进行了点突变，对pPIC9K载体进行

改造，之后才能将上述目的基因在Xho I和EcoR I双酶切位点转入载体，这样表

达的蛋白为分泌蛋白，而且不带有任何多余的氨基酸，不会对重组蛋白的结构和功

能造成影响。

本发明构建新型细胞因子SDF-1/GM-CSF(SG)，这种新型细胞因子会具有比单一细

胞因子更好的生物学功能，有望成为一种在造血调控及抗肿瘤免疫中具有应用价值

的新型细胞因子。

上述的SG融合蛋白可用于制备预防和治疗放疗或化疗所引起的造血损伤药物。

上述的SG融合蛋白可用于制备增强免疫功能药物。

附图说明：

图1是改造后的pPIC9K载体的结构示意图。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：SG融合蛋白的制备

9K-SDF1-rhGM-CSF1克隆的制备：

1)SDF1-rhGM-CSF1基因委托invitrogen公司合成，装载在pMD18-T(购自

TAKARA公司)载体中。用EcoRI和Xho I(TAKARA公司产品)双酶切pMD18-T-

SDF1-rhGM-CSF1，割胶回收小片断，即得到两端带有EcoRI和Xho I多克隆位点

的SDF1-rhGM-CSF1基因片断。

2)pPCI9K质粒(购自Invitrogen公司)同样用EcoRI和Xho I进行双酶切处理后进行

琼脂糖凝胶电泳，结果显示条带大小正确，割胶后用Axygen公司胶回收试剂盒回

收。

pMD18-T-SDF1-rhGM-CSF1和pPCI9K质粒酶切反应体系如下：

3)将酶切好的片段SDF1-rhGM-CSF1和载体PPIC9K用T4DNALigase(MBI公司产

品)16℃连接3小时，连接体系如下：

4).将连接产物PPIC9K-SDF1-rhGM-CSF1进行转化大肠杆菌Top10感受态细胞，37℃

培养过夜，挑取转化子，选用pPIC9K通用引物，进行煮菌PCR验证。

5).挑取其中的4个菌株抽提质粒进行测序验证，得到正确的pPIC9K-SDF1-rhGM-

CSF1克隆。

9K-SDF1-rhGM-CSF1亚克隆转化酵母菌株GS115

1)重组质粒的抽提，采用华舜公司的质粒大量提取试剂盒抽提pPIC9k及pPic9k-

SDF1-rhGM-CSF1质粒(各50ml菌液)，具体操作依试剂盒说明书进行。获得

pPic9k及pPic9k-HbsAg质粒各约40ug，重新测序验证。

2)质粒线性化，用Sal I酶切pPIC9k及pPic9k-SDF1-rhGM-CSF1质粒，条件如下：

3)将上述酶切后的质粒分别用酚-氯仿，氯仿各抽提一次，随后加入1/10体积3M

的NaAc(pH4.8)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min后，15000g离心15min

沉淀DNA，质粒干燥后溶于5ul无菌超纯水中。

4)将已线性化的pPIC9K-SDF1-rhGM-CSF1质粒DNA电转化宿主菌GS115感受态

细胞(购自Invitrogen公司)中。将转化产物涂布于缺乏组氨酸的RDB营养缺陷平板，

3--4天后可见重组克隆长出。电转化仪为Bio-Rad公司产品；电转条件：电压，

1.5KV；电容，25μF；电阻，200Ω；电击时间，3.8～5ms。

3.毕赤酵母表达菌株的筛选和条件优化

1)挑取48个长势较好的酵母转化菌落进行小规模发酵，用DoltBolting方法进行初

步筛选。

①在48孔深孔版中加入3mL BMGY培养基中，接种单菌落，于30℃，250rpm培

养至OD₆₀₀约5-6(20-24h)

②1500g，5min离心收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀约在

10-15左右(约1mL)，于30℃，250rpm继续培养至OD₆₀₀约为20(6-8h)

(另取一部分菌株在YPD培养基中做快速表达实验)。

③每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5-1.0％

④表达48小时后取样，在醋酸纤维膜上点样1ul(x2)，用SDF1抗体做Dolt Bolting

检测目的蛋白的表达情况。

2)高拷贝重组子煮菌PCR验证

以上35个循环

挑取以上7个表达菌株按以上程序进行PCR

3)将上述筛选出有表达的酵母转化子菌株进行放大诱导表达实验。用SDS-PAGE

和免疫印迹(Western Bolt)验证筛选高水平表达菌株。

①.挑选上述的4个菌落和空载体对照株，接种于装有25ml BMGY培养基的250ml

摇瓶中，于30℃/250rpm培养至OD₆₀₀＝2-6(16～18h)；

②.室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的BMMY

重悬菌体(约10～20ml)；

③.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于

30℃/250rpm的摇床上继续生长；

④.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0％；

⑤.按时间点分别取菌液样品，取样量约为1ml(似需要量取样)，置于1.5ml EP管中，

最大转速离心2～3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳

收获时间。时间点一般取：0、24、48、72、96和120h；

⑥.12,000rpm离心30分钟，收集样品的上清液，用SDS-PAGE和Western blotting

鉴定融合蛋白的表达。

4)SDS-PAGE

①.取第一天发酵上清15ul上样，12％SDS PAGE检查蛋白表达情况。

②.发酵液上清浓缩10倍SDS-PAGE电泳

实验方法：在第6天样品发酵上清液中加入2倍体积的乙醇，-20℃沉淀2h，用

1/10体积的1Xloading buffer溶解，上样15ul，15％SDS PAGE胶电泳，考马斯亮

蓝染色，扫描胶片。

5)表达上清的Western Blotting检测

取发酵液上清原液10ul上样，SDS-PAGE蛋白电泳完成后，将蛋白转印至PVDF

膜上，结合一抗(SDF1单抗，鼠抗)和HRP标记的二抗(兔抗鼠)，然后用

immobion western chemiluminescent hrpsubstrate(Millipore公司产品)显色并显影到胶

片上。

将经过优化的化学全合成的SDF1-rhGM-CSF1基因装到毕赤酵母分泌表达载体

pPIC9k上，再重组入毕赤酵母菌株GS115中，优化诱导表达条件，并通过SDS-

PAGE、WESTERN Blotting检测SDF1-rhGM-CSF1重组蛋白的表达。

体外生物学实验显示SG融合蛋白能促进骨髓集落细胞形成，能有效趋化未成熟的

树突状细胞，其作用强于GM-CSF。

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>SG融合蛋白

<130>说明书，权利要求书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>279

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>505

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>850

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4