admin 管理员组文章数量: 1086019
2024年12月29日发(作者：hibernate怎么配置)
中 文 说 明 书
Caspase-Glo 1
Inflammasome Assay
®
适用产品目录号：
G9711, G9712 and G9713
G9951、G9952和G9953
2020
原英文技术手册
版 CTM456
TM456
Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay
所有技术文献的英文原版均可在/ protocols 获得。请访问该网址以确定您使用的说明书是否为最新版本。如果您
在使用该试剂盒时有任何问题，请与Promega 北京技术服务部联系。
电子邮箱：*************************
1.产品描述..................................................................................................................................................................2
2.产品组分和储存条件................................................................................................................................................6
3.试剂制备和储存 .......................................................................................................................................................7
e-Glo
®
1 Inflammasome Assay操作步骤 ....................................................................................................8
4.A 在培养细胞中测量Caspase-1活性的操作步骤.............................................................................................8
4.
B 在细胞培养基中测量释放的
Caspase-1 活性的操作步骤 ............................................................................ 11
4.C 使用纯化的Caspase测量Caspase-1活性的操作步骤 ..............................................................................13
5.代表性数据 ............................................................................................................................................................15
6.一般注意事项 ........................................................................................................................................................20
6.A 炎症小体活化的动力学和Caspase Glo
®
1 Infl20
6.B Caspase-1的特异性 ...................................................................................................................................22
6.C 检测灵敏度 .................................................................................................................................................24
6.D 温度 ............................................................................................................................................................25
6.E 化学品 .........................................................................................................................................................25
6.F 混匀.............................................................................................................................................................25
6.G 发光检测仪 .................................................................................................................................................25
7.参考文献................................................................................................................................................................26
8.缓冲液和溶液的成分..............................................................................................................................................27
9.相关产品................................................................................................................................................................28
10.内容变更总结 ........................................................................................................................................................30
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
1
1. 产品描述
Caspase Glo
®
1 Inflammasome Assay
（a,b）
是一种均质的基于生物发光反应的检测方法，可用于选择性地测量半胱天冬
酶-1（caspase-1）活性。Caspase-1是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteine aspartic acid-specific protease ，
caspase，即半胱天冬酶）家族的成员之一，也是炎症小体的主要成分之一（1）。炎症小体是由多种炎症刺激诱导的
蛋白复合物。先天免疫细胞对病原体和其他危险信号作出反应，从而形成炎症小体，并将无活性的Caspase-1酶原转
化为有催化活性的Caspase-1。Caspase-1的活化导致：1）细胞因子IL-1β和IL-18的处理和释放；以及2细胞焦亡
（pyroptosis），一种免疫原性形式的细胞死亡（2-5）。
ption (continued)
®
Caspase Glo
1 Inflammasome Assay提供一种caspase-1特异的底物，即萤光素前体Z-WEHD-氨基萤光素，以
®
及为caspase-1活性和萤光素酶活性优化的裂解试剂。只需要一次简单的添加该试剂的操作，就可以裂解细胞，使
1 Inflammasome Assay provides a luminogenic caspase-1 substrate, Z-WEHD-aminoluciferin, in a
The Caspase-Glo
caspase-1剪切特异性底物，同时利用一种专有的耐热重组萤光素酶（即Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase）与底
lytic reagent optimized for caspase-1 activity and luciferase activity. A single addition of this reagent results in cell lysis,
物反应产生光信号（如图1所示）。耦合酶系统在底物的半胱天冬酶剪切和氨基萤光素的萤光素酶转化之间达到一个
substrate cleavage by caspase-1 and generation of light by a proprietary, thermostable, recombinant luciferase
稳定的状态。这些同时发生的反应产生一个稳定的发光信号，并且该信号与半胱天冬酶（caspase）活性成正比（参
(Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase) as described in Figure 1. The coupled-enzyme system reaches a steady state
见图2）。在该试剂中加入蛋白酶体抑制剂，即MG-132，可消除由非特异性蛋白酶体介导的底物剪切，从而实现对
between caspase cleavage of the substrate and luciferase conversion of aminoluciferin. These simultaneous reactions
caspase-1活性的灵敏检测。
generate a stable luminescent signal, which is proportional to caspase activity (Figure 2). Inclusion of the proteasome
inhibitor, MG-132, in the reagent eliminates nonspecific proteasome-mediated cleavage of the substrate, enabling
sensitive detection of caspase-1 activity.
Z-WEHD-
H
N
S
N
N
S
COOH
Caspase-1
Z-WEHD +
H
2
N
氨基萤光素
S
N
N
S
COOH
1
3
1
2
1
M
A
1
3
1
2
2
M
A
同时反应
Ultra-Glo
™
Recombinant
Luciferase
ATP和Mg
2+
氧
光
masome Assay chemistry. Following caspase cleavage of
图1. Caspase Glo
1 Inflammasome Assay的化学反应过程。Z-WEHD Substrate（即Z-WEHD-氨基萤光素）发生
半胱天冬酶（caspase）剪切，并释放萤光素酶底物（即氨基萤光素） ，从而导致萤光素酶反应和光产生。
α-hemolysin treatment
90,000
80,000
70,000
60,000
50,000
40,000
30,000
20,000
10,000
2
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
®
α-hemolysin treatment
+ YVAD-CHO Inhibitor
Vehicle control
R
2
= 0.9954
R
2
= 0.9997
R
2
= 0.9934
0
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
010,00020,00030,00040,00050,00060,00070,00080,00090,000
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
Figure 2. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay is linear. THP-1 cells grown in RPMI 1640 medium supplemented
with 10% FBS in a 37°C incubator with 5% CO
2
were titrated in 96-well plates and treated with α-hemolysin (2.0µg/ml,
Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay chemistry. Following caspase cleavage of the Z-WEHD S
HD-aminoluciferin), a substrate for luciferase (aminoluciferin) is released, resulting in the luciferas
d light production.
100,000
α-hemolysin treatment
90,000
α
80,000
+ YVAD-CHO Inhibitor
-hemolysin treatment
R
2
= 0.9954
Vehicle control
70,000
e
c
n
60,000
e
c
)
s
U
e
L
n
R
50,000
i
(
m
u
40,000
L
30,000
20,000
10,000
R
2
= 0.9997
A
0
R
2
= 0.9934
M
2
2
010,00020,00030,00040,00050,00060,00070,00080,00090,000
1
3
1
Cell Number per Well
图2. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay具有线性。THP-1细胞培养在含10% FBS的RPMI 1640培养基中，
置于含有5% CO
2
的37℃培养箱中在96孔板中滴定该细胞，使用α-溶血素进行处理（2.0
μg/ml
，2.5小时），之后
添加Caspase-Glo
®
1 Reagent或Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent。在GloMax
®
Multi+ Detection System上记
录发光信号。
Caspase Glo
®
1 Inflammasome Assay是为在96和384孔板中使用而设计的，这使该检测系统成为对caspase活性
或炎症小体活化进行自动化高通量筛选的理想方法。该检测无需清洗细胞、去除培养基和重复的移液步骤（参见图3）。
这款新开发的caspase-1检测系统可以更加快捷有效地评估炎症小体的活化，并实现对炎症小体调节剂的高通量筛选。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
3
使用Caspase Glo
®
Caspase-Glo
®
1 Buffer1 Buffer重悬冻干的
Z-WEHD Substrate。
添加MG-132 Inhibitor，
以抑制非特异活性。
Caspase-Glo
®
1
Reagent
最多将一半的Caspase Glo
®
1
Reagent转移至一个单独的
试管，并添加Ac-YVAD-CHO
Inhibitor，以制备Caspase
Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent。
添加等体积的Caspase Glo
®
1
Reagent或Caspase Glo
®
1
YVAD-CHO Reagent至样品，
并在室温下进行培养。
测量发光信号。
GloMax
®
Discover System
图3. Caspase Glo
®
1 Inflammasome Assay基于细胞的操作步骤的示意图。
为了验证caspase-1的特异性，Caspase Glo
®
1 Assay含有一种caspase-1选择性抑制剂， Ac-YVAD-CHO（6）。该
抑制剂可抑制99%的caspase-1活性，但却不能显著地抑制交叉反应的半胱天冬酶（参见图4）。在含有或不含Ac-
YVAD-CHO的平行孔中进行检测，可特异地测量caspase-1的活性。有关检测特异性的更多信息参见6.B。
也可用于测量培养基中释放的caspase-1活性。
Caspase Glo
®
1 Assay可用于直接在细胞培养物中测量caspase-1活性，
检测培养基中释放的caspase-1活性时不会破坏细胞，这使该生物样品仍可用于其他检测。Caspase Glo
®
1 Assay也
可用于监测caspase-1活性对多种炎症小体诱导剂的反应。代表性数据参见7.B。
4
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
1
3
1
2
3
M
A
450,000
Caspase (125pM)
400,000
Caspase (125pM) + YVAD-CHO Inhibitor (1µM)
)
350,000
U
L
R
300,000
(
e
c
n
250,000
e
c
s
200,000
5%
e
n
i
m
150,000
u
L
100,000
50,000
15%
0
99%
Control
A
M
4
2
1
3
1
Inflammation caspasesApoptosis caspases
Caspase Isoforms (125pM)
图4.Z-WEHD-
EHD-aminoluciferin substrate and Ac-YVAD-CHO Inhibitor selectivity.
氨基萤光素底物和Ac-YVAD-CHO Inhibitor的选择性。在存在或不存在终浓度为1
μM Ac-YVAD-CHO
Ten ca
Inhibitor的情况下，检测十种125 pM caspase。caspase-11是唯一的小鼠半胱天冬酶；其他的则都是人类半胱天冬酶。
caspase-8也是一种非典型的炎症半胱天冬酶。百分比表示的是Ac-YVAD-CHO Inhibitor的抑制量。
Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay的优点包括：
方法简单：该检测可直接在多孔板上培养的细胞或细胞培养基中测量caspase-1活性，从而无需裂解物制备或多次移
液步骤。这种均质操作方法使该检测能够在96和384孔板中实现自动化。
特异性检测caspase-1：通过Caspase-Glo
®
1 Reagent中的选择性caspase-1底物Z-WEHD-氨基萤光素，和MG-
132 Inhibitor，该检测可在多孔板上的细胞或培养基中直接进行，检测caspase-1活性。通过添加Caspase Glo
®
1
YVAD-CHO Reagent至平行孔，可验证此活性为caspase-1的特异活性（参见6.B）。
速度：该检测无需样品制备或处理。仅需添加Caspase Glo
®
1 Reagent至各孔，该检测可在仅一小时之后测量细胞和
细胞培养基中的发光信号。与蛋白印迹分析和ELISA相比，该检测所需的时间和工作均更少。
准确度：Caspase Glo
®
1 Assay仅测量具有催化活性的caspase-1，从而可获得酶功能的精确时程（参见6.A）。蛋白
印迹分析和ELISA则不一定监测到活性酶。
灵敏度更高：Caspase Glo
®
1 Assay可提供测量caspase-1活性所需的灵敏度（参见6.B）。
灵活的检测板选择：只需添加等体积的试剂至样品孔中的细胞培养基，可使其轻易地缩放到不同的多孔板中。
批量处理：caspase-1的发光信号在Caspase Glo
®
1 Reagent中保持稳定（半衰期大于三小时），使孔板读取时间可
以长达几个小时。该检测无需使用带有自动试剂进样器的发光检测仪。
多重检测：该检测可在细胞培养基中监测caspase-1活性，从而保存生物样品，以供其他检测使用。此外，该检测也
可使用兼容的检测系统（如CellTox™Green Cytotoxicity Assay），以进行同孔多重检测。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
5
2. 产品组分和储存条件
产品
Caspase-Glo
®
1 Assay
规格
10 ml
目录号
G9951
该系统含有足以在96孔板中进行100次100
μl
检测或在384孔板中进行400次25
μl
检测的试剂。包括：
•
•
•
•
产品
Caspase-Glo
®
1 Assay
1×10 m
1瓶
2×30
μl
1×10
μl
Caspase-Glo
®
1 Buffer
Z-WEHD Substrate（冻干的）
MG-132 Inhibitor
Ac-YVAD-CHO Inhibitor
规格
5×10 ml
目录号
G9952
该系统含有足以在96孔板中进行500次100
μl
检测或在384孔板中进行2000次25
μl
检测的试剂。包括：
•
•
•
•
5×10 ml
5瓶
1×300
μl
5×10
μ
l
Caspase-Glo
®
1 Buffer
Z-WEHD Substrate（冻干的）
MG-132 Inhibitor
Ac-YVAD-CHO Inhibitor
产品
Caspase-Glo
®
1 Assay
规格
100 ml
目录号
G9953
该系统含有足以在96孔板中进行1000次100
μl
检测或在384孔板中进行4000次25
μl
检测的试剂。包括：
•
•
•
•
1×100 ml
1瓶
2×300
μ
l
1×100
μl
Caspase-Glo
®
1 Buffer
Z-WEHD Substrate（冻干的）
MG-132 Inhibitor
Ac-YVAD-CHO Inhibitor
储存条件：在-20℃下避光储存Caspase-Glo
®
1 Buffer、Z-WEHD Substrate、MG-132 Inhibitor和Ac-YVAD-CHO
而不会导致发光信号丢失。Inhibitor。Caspase-Glo
®
1 Buffer可以在4℃融化并储存长达三个月或在室温下储存长达四天，
保质期参见产品标签。
6
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
3. 试剂制备和储存
在使用当天制备Caspase Glo
®
1 Reagent和Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent。不建议将这些试剂储存超过一
天。如果你并不打算当天用完所有制备好的试剂，那么建议按照以下方法先单独配制和保存重悬的Z-WEHD 底物，
然后在实验当天，再添加MG-132 Inhibitor和Ac-YVAD-CHO Inhibitor以配制成完整的Caspase-Glo
®
1 Reagent and
Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent 用于检测。如果已确认了模型系统的特异性，那么可能无需使用Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent。根据实验需求来调整需要制备试剂的总量。
1. 使用前将Caspase Glo
®
1 Buffer和Z-WEHD Substrate平衡至室温（22–25℃）。
2. 将一个Caspase Glo
®
1 Buffer瓶中的内容物全部转移到一个含有Z-WEHD Substrate的琥珀瓶中，以配制Z-WEHD
Substrate。通过旋转或倒置混匀，直至底物完全溶解。配制好的的Z-WEHD-氨基萤光素浓度为40
μM
，从而在最
终的检测反应中达到终浓度20
μM
，即caspase-1的表观Km值。
3. 在室温下解冻MG-132 Inhibitor和Ac-YVAD-CHO Inhibitor。
注：对于纯化组分构成的生化酶反应来说，这些抑制剂是不必要的。如果使用重组的caspase-1进行分析，那么可
以直接使用上述用Caspase Glo
®
1 Buffer重悬的Z-WEHD-氨基萤光素作为检测试剂，不需要添加其他成分。参
见4.C。
4. 添加60
μl
MG-132 Inhibitor至10 ml（或添加600
μl
MG-132 Inhibitor至100 ml）配制好的Z-WEHD Substrate，
以制备Caspase-Glo
®
1 Reagent。通过旋转或颠倒混匀内容物，直至试剂完全混匀。Caspase-Glo
®
1 Reagent中
的MG-132 Inhibitor浓度为120
μM
，从而在检测中达到60
μM
的最终浓度。
注：如果使用10 ml的试剂盒（目录号：G9951），那么可添加两个试管中的MG-132 Inhibitor至整瓶（10 ml）
的配好的Z-WEHD Substrate。或者，可添加一个试管中（30
μl
）的MG-132 Inhibitor至半瓶（5 ml）配制好的Z-WEHD
Substrate。如果使用5×10 ml的试剂盒（目录号：G9952），那么可分别添加60
μl
MG-132 Inhibitor至每一份
10 ml配制好的Z-WEHD Substrate。首次解冻后，MG-132 Inhibitor可以再耐受5次冻融循环，保持活性不变。
如果使用100 ml的试剂盒（目录号：G9953），那么可添加两个试管中的MG-132 Inhibitor至整瓶（100 ml）配
制好的Z-WEHD Substrate，或者，可添加一个试管中（300
μl
）的MG-132 Inhibitor至半瓶（50 ml）配制好的Z-WEHD
Substrate。
5. 转移多达一半的Caspase Glo
®
1 Reagent至一个单独的试管，并以1：1000的比例添加Ac-YVAD-CHO Inhibitor
（即添加5
μl Ac-YVAD-CHO Inhibitor
至5 ml Caspase Glo
®
1 Reagent），以制备Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO
Reagent。通过旋转或颠倒完全混匀试剂。试剂中的Ac-YVAD-CHO浓度为2
μM
，检测中的最终浓度则为1
μM
。
注：如果已确认了模型系统的特异性，那么可能无需使用Caspase Glo® 1 YVAD-CHO Reagent。根据需要调整要
制备试剂的总量。
试剂储存：与新制备试剂相比 已配制好的Z-WEHD Substrate 在4℃下储存长达两天未显示出活性损失。配制好的
Z-WEHD Substrate在4℃下储存一周产生的发光信号约为新制备试剂的80%。配制好的Z-WEHD Substrate 在-20℃
下储存一周产生的发光信号约为新制备试剂的85%。配制好的Z-WEHD Substrate 在-20℃下储存六周产生的发光信
号约为新制备试剂的80%。含有MG-132 Inhibitor 的Caspase-Glo
®
1 Reagent可在4℃或室温下过夜储存，而不会导
致活性损失。MG-132 Inhibitor 在经过五次额外的冻融循环后可保持稳定，但可能对长时间光照敏感，建议避光保存。
Ac-YVAD-CHO Inhibitor 在经过五次额外的冻融循环后可保持稳定。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
7
4. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay操作步骤
在进行Caspase-Glo
®
1 Assay之前，建议确定您所使用的特定细胞的最佳细胞数量和处理时间。一般来说，以96孔
板为例，可以用每孔40000-60000个细胞作为初始条件。
4.A. 在培养细胞中测量caspase-1活性的操作步骤
此操作步骤为使用96孔板的总反应体积为200
μl
的检测步骤。在Caspase-Glo
®
1 Reagent和样品的体积比保持
为1：1的情况下，该检测也可调整为其他的体积（如在384孔板中，样品和Caspase-Glo
®
1 Reagent的体积均
为25
μl
）。
请在可以与发光检测仪兼容的细胞培养级别的多孔板中培养细胞。准备以下反应，以检测细胞培养物中的caspase-1
活性。“溶媒”（“Vehicle”）是指用于溶解试验化合物或靶蛋白的溶剂。
•
•
•
空白反应：无细胞，添加溶媒和细胞培养基
阴性对照：细胞培养基中的溶媒处理细胞
实验反应：培养基中的实验因素处理细胞（用于测试炎症小体诱导），或添加测试化合物或靶蛋白的已诱导炎症小
体产生的细胞（用于检测炎症小体诱导抑制）
空白反应用于测量与细胞培养基和Caspase-Glo
®
1 Reagent相关的本底发光信号。空白反应的发光值可从阴性对照
细胞和实验细胞的发光值中扣除。阴性对照反应对确定细胞培养体系的本底活性具有重要意义。实验反应用于监测
caspase-1的活化或caspase-1的活化抑制。
图5显示了两个适用不同用途的孔板布局示例。
用户需自备的材料
（溶液成分参见第8部分。）
•
•
•
•
•
白色，壁不透光的（底部透光或不透光均可）细胞培养级多孔板，与发光检测仪兼容
细胞和培养基
多通道移液器或自动移液工作站
用于混匀多孔板的孔板振荡器（可选）
可读取多孔板的发光检测仪
8
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
A.
Caspase-Glo
®
1 ReagentCaspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent
1112
A
无细胞对照
B
处理细胞
C
溶媒对照
D
E
F
G
H
B.
Caspase-Glo
®
1
Caspase-Glo
®
1 Reagent
YVAD-CHO Reagent
1112
A
无细胞对照
B
处理细胞
C
溶媒对照
D
E
F
G
H
A
M
8
3
1
3
1
图5. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay孔板布局示例。试板A。用于测试诱导炎症小体的化合物的孔板布局。
试板B。用于测试炎症小体抑制剂的孔板布局。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
9
1. 在开始检测之前，制备Caspase-Glo
®
1 Reagent和Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent（如3所述）。将这两
种试剂平衡至室温。
2. 将含有细胞的96孔板从培养箱中取出，并将孔板在室温下平衡五分钟。
3. 96孔板中应包括含有100
μl
培养液的空白反应、阴性对照细胞或处理细胞，向其中一半的重复孔中加入100
μl
Caspase-Glo
®
1 Reagent
注：如果反复使用吸液头来分配试剂，避免吸液头接触含有样品的各孔，从而防止交叉污染。
4. 添加100
μl
Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent至另一半重复孔中。使用孔板封膜或盖子盖住孔板。
5. 使用孔板振荡器以300-500 rpm轻轻混匀30秒。
注：混匀步骤是可选操作。详情参见6.F。
6. 在室温下孵育至少一小时，以稳定发光信号。
7. 按照发光检测仪制造商提供的操作指南，使用发光检测仪测量发光信号。
注：为了确认MG-132抑制和Ac-YVAD-CHO抑制的完全性，建议在室温孵育后第60分钟、90分钟和120分钟
时测量发光信号。可将孔板置于发光检测仪中，并设置为动态检测模式每30分钟读取一次。一旦发光信号稳定，
在完成MG-132抑制和Ac-YVAD-CHO抑制之后，信号半衰期大于三小时（参见6.A中的图12）。建议在添加
Caspase-Glo
®
Reagent之后的三个小时内测量发光信号。对于批量处理实验，这种检测方法的信号稳定性可以满
足在1-3h内任意时间进行检测。
10
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
4.B. 在细胞培养基中测量释放的caspase-1活性的操作步骤
此操作步骤为使用96孔板的总反应体积为100
μl
的检测步骤。在Caspase-Glo
®
1 Reagent和样品的体积比保持为1：1
的情况下，该检测也可调整为其他的体积（如在384孔板中，样品和Caspase-Glo
®
1 Reagent的体积均为12.5
μl
）。
图6显示了示例数据。
请在细胞培养级别的多孔板中培养细胞。如果计划用同一份细胞样品进行多重发光检测，请确保细胞培养板与发光检
测仪兼容。准备以下反应，以检测细胞培养物中的caspase-1活性。“溶媒”（“Vehicle”）是指用于溶解试验化合
物或靶蛋白的溶剂。
• 空白反应：无细胞，添加溶媒和细胞培养基
• 阴性对照：细胞培养基中的溶媒处理细胞
• 实验反应：培养基中的实验因素处理细胞（用于测试炎症小体诱导），或带测试化合物或靶蛋白的已诱导炎症小体
产生的细胞（用于检测炎症小体诱导抑制）
空白反应用于测量与细胞培养基和Caspase-Glo
®
1 Reagent相关的本底发光信号。空白反应的发光值可从阴性对照
细胞和实验细胞的发光值中扣除。阴性对照反应对确定细胞培养体系的本底活性具有重要意义。实验反应用于监测
caspase-1的活化或caspase-1的活化抑制。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
11
用户需自备的材料
（溶液成分参见第8部分。）
•
•
•
•
•
白色，壁不透光的（底部透光或不透光均可）细胞培养级多孔板，与发光检测仪兼容
细胞和培养基
多通道移液器或自动移液工作站
用于混合多孔板的孔板振荡器（可选）
可读取多孔板的发光检测仪
1. 在开始检测之前，制备Caspase-Glo
®
1 Reagent和Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent（如3所述）。将这两
种试剂平衡至室温。
2. 将含有细胞的96孔板从培养箱中取出。
3. 将50
μl
的细胞培养基从实验板的各孔转移至新的白色96孔板的相应孔。
4. 立即添加50
μl
Caspase Glo
®
1 Reagent至含有转移培养基的一半的重复孔中。
注：如果反复使用吸液头来分配试剂，避免吸液头接触含有样品的各孔，从而防止交叉污染。
避免吸液头接触含有样品的各孔，
5. 添加50
μl
Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent至含有转移培养基的另一半孔。
以防止交叉污染。使用孔板封膜或盖子盖住孔板。
6. 使用孔板振荡器以300-500 rpm轻轻混匀30秒。
注：混匀步骤是可选操作。详情参见6.F。
7. 在室温下培养至少一小时，以稳定发光信号。
8. 按照发光检测仪制造商提供的操作指南，使用发光检测仪测量发光信号。
注：为了确认MG-132抑制和Ac-YVAD-CHO抑制的完全性，建议在室温孵育后第60分钟、90分钟和120分钟
时测量发光信号。可将孔板置于发光检测仪中，并设置为动态检测模式每30分钟读取一次。一旦发光信号稳定，
在完成MG-132抑制和Ac-YVAD-CHO抑制之后，信号半衰期大于三小时（参见6.A中的图12）。建议在添加
Caspase-Glo
®
1 Reagent之后的三个小时内测量发光信号。
12
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
4.C. 使用纯化的caspase测量caspase-1活性的操作步骤
此操作步骤为使用96孔板的总反应体积为100
μl
的检测步骤。在配制好的Z-WEHD Substrate和样品的体积比保持为
1：1的情况下，该检测也可调整为其他的体积（如在384孔板中，样品和配制好的Z-WEHD Substrate的体积均为25
μl
）。
在多孔板中准备以下反应，以检测纯化酶制剂中caspase-1的活性或活性抑制。“溶媒”（“Vehicle”）是指用于溶
解试验化合物的溶剂。
• 阴性对照：酶稀释缓冲液，和试验化合物或抑制剂的溶媒（如使用）
• 阳性对照：溶媒，酶稀释缓冲液，和纯化的半胱天冬酶-1酶
• 实验反应：测试化合物，酶稀释缓冲液，和纯化的半胱天冬酶-1酶
阴性对照用于在存在配制好的Z-WEHD Substrate的情况下测量与测试化合物溶媒相关的本底发光信号。阳性对照用
于确定使用纯化的半胱天冬酶-1酶可获得的最大发光信号。
注：
1. 使用者可能需要根据经验确定最佳的caspase-1浓度。
2. 使用相同的酶浓度进行实验和阳性对照反应。
3. 不同的制造商提供的caspase特异活性和活性单位定义可能会有很大差异。
4. 市场上有两种形式的重组caspase-1。一种形式来自于野生型caspase-1序列，另一种形式则含有一个突变，
以尽量减少自体酶解。野生型caspase-1具有不稳定性，在进行酶滴定时，其发光信号呈现出非线性。突变型
caspase-1在很宽的酶浓度范围内都能产生线性的发光信号，但其酶活性具有不稳定性，半衰期约为30分钟。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
13
需用户自备的材料
（溶液成分参见8。）
•
•
•
•
•
•
多孔板，与发光检测仪兼容
多通道移液器或自动移液工作站
用于混合多孔板的孔板振荡器（可选）
可读取多孔板的发光检测仪
纯化的caspase-1酶（如ENZO目录号：BML-SE168-5000或ALX-201-056）
一种适用于稀释纯化caspase-1酶的酶稀释缓冲液，如caspase-1稀释缓冲液（说明书第8部分，Caspase-1
enzyme dilution buffer）
1. 制备重悬Z-WEHD Substrate（如3所述）（纯化的酶活性检测无需MG-132 Inhibitor和YVAD-CHO Inhibitor）。
将该试剂平衡至室温。
2. 在96孔板中制备阴性对照、阳性对照和实验反应（如上所述）。确保各孔的最终体积均为50
μl
。
3. 添加50
μl
配制好的Z-WEHD Substrate至各个样品。
注：如果反复使用吸液头来分配试剂，避免吸液头接触含有样品的各孔，从而防止交叉污染。
4. 使用孔板振荡器以300-500 rpm轻轻混匀30秒。
注：混匀步骤是可选操作。详情参见6.F。
5. 室温下孵育10分钟。
6. 按照发光检测仪制造商提供的操作指南，使用发光检测仪测量发光信号。
注：建议在添加Caspase-Glo
®
1 Reagent之后的30分钟内测量发光信号。
14
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
5. 代表性数据
Caspase Glo
®
1 Assay可用于直接在细胞培养物中测量caspase-1活性，也可用于在培养基中测量释放的caspase-1
活性（参见图6）。对培养基中释放的caspase-1活性的监测不会破坏细胞，这使该生物样品仍可用于其他多重检测（参
见图7）。
ng of the biological sample with other assays (Figure 7).
24,000
no-cell control
22,000
vehicle control
20,000
treated THP-1 cells
18,000
treated THP-1 cells +
YVAD-CHO Inhibitor
e
16,000
c
n
e
14,000
c
)
s
U
e
L
n
R
12,000
i
(
m
u
10,000
L
8,000
6,000
4,000
2,000
0
Pam3CSK4
R848Pam3CSK4
R848
culture mediumcells
A
background
Signal:
M
5
ratio
12.40
3.764.632.88
2
1
3
1
e-Glo 1 Inflammasome Assay can monitor released caspase-1 in culture
图6. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay可检测培养基中释放的caspase-1。在含有5% CO
2
的37℃培养箱中，
用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养THP-1细胞。然后用20 nM佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯（丙二醇甲醚
醋酸酯，PMA）分化两天，之后用Pam3CSK4（2
μg/ml
）或雷西莫特（R848，20
μM
）处理两小时。转移一半培养基（50
μl
/孔）至第二个培养板，以50
μl
/孔添加Caspase Glo
®
1 Reagent或Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent，并
按照GloMax
®
Multi+ Detection System with Instinct
®
Software 的技术手册 #TM340的指示，使用GloMax
®
Multi+
Detection System记录发光信号。对于细胞，直接以100
μl
/孔添加试剂至100
μl
/孔的培养细胞。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
15
5.
A.
Representative Data (continued)
25,000
20,000
B.
No-cell control
Vehicle control
Treated cells
50,000
45,000
40,000
No-cell control
Vehicle control
Treated cells
C.
6,000,000
5,000,000
No-cell control
Vehicle control
Treated cells
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
35,000
30,000
25,000
20,000
15,000
10,000
5,000
0
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
(
R
F
U
)
4,000,000
3,000,000
2,000,000
1,000,000
0
15,000
10,000
5,000
0
YVAD-
CHO
Flagellin
YVAD-
CHO
Nigericin
Flagellin
Nigericin
FlagellinNigericinFlagellinNigericin
1
3
1
4
0
M
A
CellTox
™
Green
Cytotoxicity Assay
Caspase-Glo
®
1
Inflammasome Assay
CellTiter-Glo
®
Cell Viability
Assay
RealTime-Glo
™
MT Cell
Viability Assay
Figure 7. Caspase-Glo 1 Inflammasome Assay multiplexed with cell viability and cell death assays. THP-1
图7. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay与细胞活性和细胞死亡检测进行多重叠加检测。在含有5% CO
2
的37℃
培养箱中，用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养THP-1细胞。以5×10
5
细胞/ml添加细胞至100
μl
的培养基，
在96孔板中用丙二醇甲醚醋酸酯分化（PMA，20nM，三天），然后用鞭毛蛋白（flagellin ，1
μg/ml
，一小时）或尼
日利亚霉素（nigericin ，20
μM
，两小时）进行处理。A.转移一半的培养基（50
μl
）至一个单独的孔板，添加50
μl
Caspase Glo
®
1 Reagent或Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent至各孔。于30分钟之后记录发光信号。然后按照制
造商的指示，使用CellTox™ Green Cytotoxicity Assay、CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay或RealTime-
Glo™ MT Cell Viability Assay对含有细胞和剩余一半培养基的原始孔板进行检测。B.添加CellTox™ Green Reagent
至细胞，并于90分钟之后记录发光信号。C.使用CellTiter-Glo
®
或RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay监测细胞
活性。分别于10分钟（前者）和90分钟（后者）之后记录发光信号。按照GloMax
®
Multi+ Detection System with
Instinct
®
Software 的技术手册#TM340的指示，使用GloMax
®
Multi+ Detection System记录所有的发光信号和荧光读
数。
我们使用该检测系统，以96孔或384孔板模型，展示了经过尼日利亚霉素、尿酸单钠（MSU）、α-溶血素、脂多糖
（LPS）、雷西莫特（R848）、Pam3CSK4和鞭毛蛋白诱导的THP-1细胞中，caspase-1活性（参见图6-8）。该系
统还测量了小鼠骨髓来源的巨噬细胞（参见图9）、人原代单核细胞（参见图10）和J774A.1小鼠巨噬细胞（参见图
11）中的caspase-1活性。
注：以下是对本章节所列举实验结果中用到的各个炎症小体诱导剂的简短描述。
16
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
葡萄球菌α-溶血素（Staphylococcal α-hemolysin）：一种细菌毒素，可激活炎症小体的活性，并且诱导程序性坏
死（炎症坏死；7，8）。
脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）：一种toll样受体4（TLR4）激动剂，常见于革兰氏阴性菌的外膜，充当内毒素，
可引起强烈的免疫反应（9-11）。
雷西莫特（resiquimod，R848）：一种TLR7/8激动剂，可激活炎症小体（12）。
PAM3CSK4：一种合成三酰脂肽，模拟了细菌脂多糖的酰化氨基末端，同时也是一种TLR2激动剂，可诱导
caspase-1的活化（11）。
鞭毛蛋白（Flagellin）：一种TLR5激动剂，可在细胞内激活NLRC4/NAIP5炎症小体（13，14）。
尼日利亚霉素（Nigericin）：一种微生物毒素，充当钾离子载体。细胞内K+的减少可引起caspase-1的活化（15）。
尿酸单钠结晶（Monosodium urate crystals，MSU）：一种可引起急性炎症的试剂。该晶体可导致溶酶体破裂和
caspase-1的活化（16，17）。
ation of caspase-1 (16, 17).
10,000
9,000
Vehicle control
8,000
Treated cells
e
c
7,000
n
e
c
)
U
6,000
s
e
L
n
R
5,000
i
(
m
4,000
u
L
3,000
2,000
1,000
0
YVAD-
CHO
YVAD-
CHO
YVAD-
CHO
YVAD-
CHO
YVAD-
CHO
YVAD-
CHO
A
No
M
7
2
Cells
Monosodium
α
-Hemolysin
NigericinLPSR848Pam3CSK4
1
Urate
3
1
图8. 384孔板中的Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay。在含有5% CO
2
的37℃培养箱中，用含10% FBS的
RPMI 1640培养基培养THP-1细胞。。将20
μ
l 1.25×10
5
细胞/ml的细胞悬液添加至384孔板中，用丙二醇甲醚醋酸
酯分化（PMA，20 nM，两天），然后用MSU（200
μg/ml
，四小时）、α-溶血素（2
μg/ml
，两个半小时）、尼日利
亚霉素（20
μM
，两小时）、脂多糖（超纯、1
μg/ml
、两个半小时）、R848（20
μM
，两个半小时）或对应的溶媒进
行处理。添加Caspase Glo
®
1 Reagent或Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent（20
μl
/孔），并于90分钟之后使用
GloMax
®
Discover System测量发光信号。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
17
ative Data (continued)
500,000
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
400,000
300,000
200,000
100,000
No Ac-YVAD-CHO Inhibitor
Ac-YVAD-CHO
图9. 使用Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay监测小鼠骨髓巨噬细胞培养基中的caspase-1活性。在含有20%
L929上清液的DMEM中培养骨髓细胞八天，以产生巨噬细胞。先用100 ng/ml脂多糖（LPS）处理细胞3-8小时，
然后用Poly（dA:dT）（双链DNA；1
μg/ml
）刺激细胞七小时，或用ATP（5 mM）或尼日利亚霉素（nigericin，10
μ
M）刺激细胞一小时。转移细胞上清液，添加Caspase Glo
®
1 Reagent或Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent（50
μl/
孔）至各孔，并在BioTek Synergy™ 多孔板读数仪上测量发光信号。（图片由康涅狄格大学的Sivapriya Kailasan
Vanaja和Vijay Rathinam博士提供。）
18,000
16,000
No caspase-1 inhibitor
Ac-YVAD-CHO
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
0
n
g
g
P
o
N
i
g
e
r
i
c
i
n
l
y
(
d
A
:
d
T
)
+
A
T
P
S
,
1
0
S
,
1
µ
d
i
u
A
T
P
,
+
0
n
g
L
P
m
e
L
P
m
m
e
1
0
S
,
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
d
i
u
L
P
18
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
spase-Glo
®
1 Inflammasome Assay monitors caspase-1 activity in peripheral bl
1
µ
g
,
+
A
T
P
m
1
3
1
3
1
M
A
0
d
i
u
m
M
e
A
T
P
marrow-derived mouse macrophages. Macrophages were generated by culturing bone marrow cells in DMEM
with 20% L929 supernatant for 8 days. Cells were primed with 100ng/ml LPS for 3–8 hours and then stimulated with
poly(dA:dT) (double-stranded DNA; 1µg/ml) for 7 hours or with ATP (5mM) or nigericin (10uM) for 1 hour. Cell
supernatant was transferred and Caspase-Glo
®
1 Reagent or Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent (50µl/well) was
added to the wells, and luminescence was measured on a BioTek Synergy™ microplate reader. (Figure courtesy of Drs.
Sivapriya Kailasan Vanaja and Vijay Rathinam, University of Connecticut.)
18,000
No caspase-1 inhibitor
16,000
Ac-YVAD-CHO
)
14,000
U
L
R
12,000
(
e
c
n
10,000
e
c
s
8,000
e
n
i
m
6,000
u
L
4,000
2,000
0
m
g
g
u
n
µ
P
P
P
T
T
T
i
d
0
1
A
A
A
0
,
e
m
1
S
+
+
+
A
,
P
S
L
m
,
,
g
g
M
P
u
n
µ
2
i
L
d
0
1
3
e
0
,
m
1
S
1
3
,
P
S
L
1
P
L
图10. 使用Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay监测外周血单核细胞（PBMC）上清液中的caspase-1活性。将
全血置于离心管中Lympholyte Human Cell Separation Media（Cedarlane）的上层，并以800×g离心20分钟。用
巴斯德吸管小心地去除白细胞层，并转移至一个全新的试管中，管中有包含10 mM EDTA和2%胎牛血清（FBS）的
PBS。用PBS+EDTA+FBS清洗细胞两次，然后用含有10% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞至终浓度1×10
6
细胞
/ml。将细胞铺板于96孔板，用或者不用E. coli 0111:B4脂多糖（100 ng/ml或1
μg/ml
；Sigma-Aldrich）刺激三小时，
然后用ATP（5 mM；Bioshop）刺激30分钟。离心孔板以沉淀细胞，并转移每孔50
μl
上清液至白色96孔板。添加
Caspase-Glo
®
1 Reagent或Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent至白色检测板每个样品孔（50
μl
/孔）。于60分钟
之后记录发光信号。（图片由安大略省金斯顿市皇后大学的Carlene Petes和Katrina Gee博士提供。）
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
19
6. 一般注意事项
6.A.炎症小体活化的动力学和Caspase Glo
®
1 Inflammasome Assay
目前，常用的监测活化的caspase-1的方法（如蛋白印迹分析和ELISA）测量的是经加工的caspase-1（蛋白印迹分
析）和释放的caspase-1（ELISA），但不一定检测到的就是有活性的caspase-1。Caspase-Glo
®
1 Inflammasome
Assay仅检测有活性的caspase-1；因此，该技术能够让使用者很好地监测在炎症小体活化之后caspase-1的活性。一
旦caspase-1被激活并从细胞中释放，其活性相当短暂，并且半衰期相对较短（18；参见图11）。我们已在多种经炎
症小体诱导剂处理的THP-1和J774A.1细胞模型中观察到了这个现象。为了能监测到活化的caspase-1，使用者可能
需要优化检测时间。但是，一旦添加能裂解细胞的Caspase-Glo
®
1 Reagent至培养细胞或待测培养基，由炎症小体介
导的活化的caspase-1就会稳定（与重组caspase-1相比），从而在MG-132完成对蛋白酶体活性抑制之后产生连续
稳定的发光信号（参见图12）。来自细胞的caspase-1在Caspase Glo
®
1 Reagent中能保持活性，并且半衰期大于三
小时，这为发光检测仪的数据读取提供了灵活性。
hours in the Caspase-Glo
1 Reagent, providing flexibility when timing luminom
16,000
14,000
No-cell control
Vehicle control
Nigericin-treated cells
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0
0.511.522.533.544.7524
1
3
1
2
8
M
A
YVAD-CHO
Nigericin treatment (hours)
图11. caspase-1活化的时程。在含有5% CO
2
的37℃培养箱中，用含10% FBS的DMEM培养基培养J774A.1细胞
（50000细胞/孔）。将100
μ
l浓度为4×10
5
细胞/ml的细胞悬液添加至96孔板中，并进行过夜培养。于次日用LPS（500
ng/ml）处理细胞约四小时，然后用尼日利亚霉素（nigericin，20
μ
M）或溶媒按照规定的不同时间处理细胞。添加
Caspase-Glo
®
1 Reagent或Caspase-Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent至细胞（100
μl
/孔）。于两小时之后使用GloMax
®
Multi+ Detection System测量发光信号。
20
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
Inflammasome Activation and the Caspase-Glo 1 Inflammasome Assay
120,000
No-cell control
100,000
Vehicle control
Nigericin-treated cells
Nigericin-treated cells + YVAD-CHO
)
U
L
R
80,000
(
e
c
n
e
60,000
c
s
e
n
i
m
40,000
u
L
20,000
A
M
9
2
1
0
3
1
0180
Time (minutes)
图12. Caspase-Glo
®
1 Assay发光信号的动力学。在含有5% CO
2
的37℃培养箱中，用含10% FBS的RPMI 1640
培养基培养THP-1细胞。将100
μ
l 浓度为5×10
5
细胞/ml的细胞悬液添加至96孔板中并用尼日利亚霉素（nigericin，
20
μ
M，2小时）进行处理。添加Caspase Glo
®
1 Reagent或Caspase Glo
®
1 YVAD-CHO Reagent至各孔，并按
照规定的时间点用GloMax
®
-Multi+ Detection System记录发光信号。红线表示蛋白酶体抑制的动力学，灰线表示
caspase-1抑制的动力学，绿线则表示一旦蛋白酶体抑制完成，Caspase-Glo
®
1信号将稳定。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
21
6.B. caspase-1的特异性
Caspase四肽底物在不同的Caspase中表现出显著的交叉反应（19）。在细胞中，由于其丰度和强烈的催化活性，
凋亡相关的Caspase特别容易发生交叉反应（20）。在等摩尔浓度下，用十种重组Caspase测试Z-WEHD-氨基萤
光素底物特异性。结果显示，该底物与caspase-5、3和6可发生交叉反应，但未与caspase-2、4、7、8、9或11
发生交叉反应（参见图4）。为了检测交叉反应，Caspase-Glo
®
1 Assay中包括了caspase-1的选择性抑制剂，即
Ac-YVAD-CHO。在1
μM
的最终浓度下，该抑制剂可抑制99%的caspase-1活性，但不能显著抑制交叉反应的其他
caspase（参见图4）。caspase-1的特异性通过在平行孔中进行的两组检测得以证实：一组使用了Ac-YVAD-CHO
Inhibitor，另一组则未使用。这要求制备两种Caspase-Glo
®
1 Reagent：一种含有2
μM
浓度（1
μM
的最终浓度）的
Ac-YVAD-CHO，另一种则不含（如3所述）。Ac-YVAD-CHO对发光信号的抑制证实了该信号由caspase-1产生；相
反，缺乏抑制则表明发光不由caspase-1活性产生（参见图4和13）。caspase-1抑制在添加Caspase Glo
®
1 YVAD-
CHO Reagent之后的约60分钟完成。
22
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
A.B.
70,000
No-cell control
)
40,000
No-cell control
U
60,000
Vehicle control
F
35,000
Vehicle control
R
Treated cells
(
30,000
Treated cells
e
)
Treated cells + YVAD-CHO Inhibitor
c
U
n
25,000
L
50,000
Treated cells + VEID-CHO Inhibitor
e
R
c
(
s
20,000
e
e
c
40,000
r
15,000
n
o
e
u
l
c
10,000
s
e
30,000
F
5,000
n
i
m
20,000
0
n
n
n
u
i
i
i
c
s
c
i
L
r
y
y
l
e
g
o
m
i
o
10,000
N
m
e
n
H
o
I
-
α
0
n
n
l
e
n
n
n
n
A
i
i
i
i
i
i
c
l
o
x
c
c
s
c
i
y
M
b
c
a
y
i
y
t
r
l
u
i
i
d
o
m
0
l
e
r
3
i
o
c
m
h
o
g
a
i
o
r
m
1
x
o
p
P
u
N
e
n
D
A
P
H
o
3
I
-
1
α
图13. Caspase-Glo
®
1 Inflammasome Assay区分炎性小体活化、凋亡和坏死。 A.在含有5% CO
2
的37℃培养
箱中，用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养THP-1细胞。然后用凋亡诱导剂阿霉素（doxorubicin）、阿非迪霉
素（aphidicolin）、紫杉醇（paclitaxel ）和嘌呤霉素（puromycin）处理18小时。另外一块板上的THP-1细胞用
炎症小体诱导剂尼日利亚霉素（nigericin，20
μ
M）和α- 溶血素（α-hemolysin，2
μ
g/ml）处理两小时，或用离子
霉素（ionomycin，100
μ
M）处理两小时，以诱导坏死。添加YVAD-CHO或VEID-CHO抑制剂到Caspase-Glo
®
1
Reagent至浓度为2
μM
，以获得1
μM
的最终反应浓度。于60分钟之后使用GloMax
®
Multi+ Detection System测量
发光信号。YVAD-CHO的抑制表明，酶活性可归因于caspase-1，而VEID-CHO的抑制则表明，凋亡的caspase酶活
性不是由caspase-1产生。B. 同时添加CellTox™ Green Cytotoxicity Reagent和尼日利亚霉素、α-溶血素和离子霉素，
并在添加Caspase Glo
®
1 Reagent之前监测荧光信号。处理后荧光信号的增强证实了膜通透性增加和细胞死亡。
Caspase Glo
®
1 Assay特异性已在炎症小体活化、凋亡和坏死的细胞培养模型中得以验证。培养细胞中炎性小体活化
产生的检测发光信号被Ac-YVAD-CHO完全抑制。培养细胞中凋亡产生的发光信号不受Ac-YVAD-CHO的抑制。坏死
则不会产生发光信号（参见图13）。
在细胞培养系统中，凋亡细胞会由于caspase-3和6的活性而产生发光信号。虽然Z-WEHD-氨基萤光素是凋亡
caspase的相对较差的底物（19，21），但由于其足够的丰度和活性，caspase-3和6均可被该分析系统检测到（20；
参见图4和13）。由于活性太低，其他半胱天冬酶则无法在细胞培养物中被检测到。在建议的最终浓度（1
μM
）下，
Ac-YVAD-CHO可抑制caspase-1的活性，但不影响caspase-3或6的活性（6；参见图13）。因此，如果1
μM Ac-
YVAD-CHO不抑制发光信号，则该发光信号不能被归因于caspase-1。
caspase-1选择性抑制剂，即Ac-YVAD-CHO，其浓度已经仔细校准，以区分caspase-1的炎症小体活性和Caspase
Glo
®
1 Reagent中的其他交叉反应的凋亡caspase。不要使用更高浓度的抑制剂或直接添加抑制剂至细胞去抑制炎症
小体的活化。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
23
6.C 检测灵敏度
发光底物通常比类似的荧光底物更加灵敏（22-24），这也适用于caspase-1底物（参见图14）。WEHD是
caspase-1最理想且最灵敏的四肽底物（21，25）。为了确定细胞中的检测灵敏度，我们在96孔板中滴定了用α-溶
血素处理的THP-1细胞，并用10000-80000细胞/孔获得了清晰发光信号（参见图2）。我们通常用50000 THP-1细
胞/孔来获取稳定的发光信号。我们还用每孔50000个J774.1细胞获得了稳定的发光信号（参见图11）。此方法具有
高灵敏度，可在384孔板上25
μl
的培养基中，以12500细胞/孔，在用多种炎症小体诱导剂处理的THP-1细胞中，
清晰地检测到caspase-1活性（参见图8）。通过比较使用Caspase- Glo
®
3/7 Assay监测的caspase-3/7活性和使用
Caspase-Glo
®
1 Assay监测的caspase-1活性，我们发现caspase-1活性低一个数量级，并且明显更加短暂。因此，
Caspase-Glo
®
1发光（相对光单位，RLU）低于其他Caspase-Glo
®
Assay的发光，但这种差异是由于炎症小体生物
学特性和caspase-1活化的短暂性而非检测试剂性能所导致的。
细胞是否健康会影响检测灵敏度。在具有高凋亡活性的细胞培养模型中，总发光信号中可以被Ac-YVAD-CHO抑制的
部分将减少（参见6.B）。重要的是，在测试炎症小体活性之前，要尽可能地确保细胞健康。可以通过转移细胞培养上
清到一个新的孔板，检测释放到上清中的caspase-1，而不是直接监测培养细胞中的caspase-1，通过降低背景来改善
信号，从而提高灵敏度（参见图6）。当监测培养基中释放的caspase-1时，未处理的对照的本底信号通常较低。
ring released caspase-1 from culture medium.
1,000,000
100,000
10,000
1,000
100
10
1
0.01
1
3
1
3
3
M
A
Z-WEHD-aminoluciferin
Z-YVAD-aminoluciferin
Ac-WEHD-AMC
Ac-YVAD-AMC
S
i
g
n
a
l
:
N
o
i
s
e
R
a
t
i
o
0.1110100
Caspase Concentration (U/ml)
nescent and fluorescent assay comparison. Caspase-1 was serially diluted in
图14. 发光检测和荧光检测的比较。用含有1% Prionex
®
和2 mM DTT的10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）在白
色96孔板中连续稀释caspase-1至规定的浓度。对于发光检测，用Caspase Glo
®
1 Buffer重悬Luciferin Detection
Reagent，并将Z-WEHD-氨基萤光素或Z-YVAD-氨基萤光素添加至终浓度为40
μM
。以1：1的体积比（v/v）添加
该底物试剂，并于15分钟之后用GloMax
®
-Multi+ Detection System记录发光信号。对于荧光检测，在0.1% Prionex
®
的100 mM HEPES（pH 7.4）中，稀释Ac WEHD-AMC和Ac YVAD-AMC底物至40
μM
，并以1：1的体积比（v/v）
添加底物试剂。用LabSystems Ascent荧光计在5个小时内进行读数。所示数据代表了2.5小时的荧光计读数，这产
生了最高的信噪比。（信噪比=信号-本底/本底标准偏差）。
24
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
6.D. 温度
Caspase-Glo
®
1 Assay的发光信号衰减强度和速率取决于caspase活性的降低速率和萤光素酶反应的速率。影响萤光
素酶反应速率的环境因素，如温度，也会影响光输出强度和发光信号的稳定性。为了获取一致结果，务必每次实验平
衡检测孔板至一个恒定温度。在大多数情况下，在发光测量之前，通过不少于一小时的室温孵育，孔板可以平衡至室温。
但是，与单层板相比，从37℃培养箱中取出并在室温下高高堆叠放置的孔板需要更长的平衡时间。在批量处理多个检
测孔板时，在各孔板上添加阳性和阴性对照，以说明由于温度等环境因素引起的任何变化。
6.E. 化学品
萤光素酶反应的化学环境可影响酶活性，并由此影响发光强度。 我们已观察到了由不同类型的培养基和血清导致的发
光强度差异。用于各种化合物的溶剂可能会影响萤光素酶反应，从而影响检测的光输出。
6.F. 混匀
无需在添加Caspase-Glo
®
1 Reagent之后进行混匀。但是，如果观察到了细胞裂解不完全或重复孔检测信号强度的显
著变化，那么建议混匀检测试剂，以有助于细胞裂解并提高各孔之间的再现性。
6.G.发光检测仪
不同制造商的发光检测仪在灵敏度和动态范围上各不相同。参阅发光检测仪的操作手册，以确定最佳设置。如有必要，
进行预实验，以确保Caspase-Glo
®
1 Assay信号在仪器的线性范围内。个别发光检测仪可能需要不同的增益或灵敏度
设置。建议优化仪器的增益或灵敏度设置。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
25
7. 参考文献
1. O’Brien , M. et al.(2017) A bioluminescent caspase-1 activity assay rapidly monitors inflammasome activation in
cells.
J. Immunol. Methods
447, 1–13.
2. Lamkanfi, M. and Dixit, V.M. (2017) The inflammasome turns 15.
Nature
548, 534–35.
3. Nowarski, R. et al. (2013) Innate immune cells in inflammation and cancer.
Cancer Immunol. Res.
1, 77–84.
4. Strowig, T. et al. (2012) Inflammasomes in health and disease.
Nature
481, 278–86.
5. Netea, M.G. et al. (2010) IL-1β processing in host defense: Beyond the inflammasomes.
PLoS Pathog.
6,
e1000661.
6. Garcia-Calvo, M. et al. (1998) Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors.
J.
Biol. Chem.
273, 32608–13.
7. Muñoz-Planillo, R. et al. (2009) A critical role for hemolysins and bacterial lipoproteins in Staphylococcus aureus-
induced activation of the Nlrp3 inflammasome.
J. Immunol.
183, 3942–8.
8. Craven, R.R. et al. (2009) Staphylococcus aureus α-hemolysin activates the NLRP3-inflammasome in human
and mouse monocytic cells.
PLoS ONE
4, e7446.
9. Kahlenberg, J.M. and G.R. Dubyak (2004) Differing caspase-1 activation states in monocyte versus macrophage
models of IL-1β processing and release.
J. Leukoc.
76, 676–84.
10. Kahlenberg, J.M. et al. (2005) Potentiation of caspase-1 activation by the P2X7 receptor is dependent on TLR
signals and requires NF- κB-driven protein synthesis.
J. Immunol.
175, 7611–22.
11. He, Y., Franchi, L. and Núñez, G. (2013) TLR agonists stimulate nlrp3-dependent IL-1β production independently
of the purinergic P2X7 receptor in dendritic cells and in vivo.
J. Immunol.
190, 334–9.
12. Kanneganti, T.D. et al. (2006) Bacterial RNA and small antiviral compounds activate caspase-1 through cryopyrin/
Nalp3.
Nature
440, 233–6.
13. Hayashi, F. et al. (2001) The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5.
Nature
410, 1099–103.
14. Zhao, Y. et al. (2011) The NLRC4 inflammasome receptors for bacterial flagellin and type III secretion apparatus.
Nature
477, 596–600.
15. Muñoz-Planillo, R. et al. (2013) K+ efflux is the common trigger of NLRP3 inflammasome activation by bacterial
toxins and particulate matter.
Immunity
38, 1142–53.
16. Martinon, F. et al. (2006) Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome.
Nature
440,
237–41.
17. Riteau, N. et al. (2012) ATP release and purinergic signaling: A common pathway for particle-mediated
inflammasome activation.
Cell Death Dis.
3, e403.
18. Walsh, J.G. et al. (2011) Caspase-1 promiscuity is counterbalanced by rapid inactivation of processed enzyme. J
.
Biol. Chem.
286, 32513–24.
26
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
19. Pop, C. and Salvesen, G.S. (2009) Human caspases: Activation, specificity, and regulation.
J. Biol. Chem.
284,
21777–81.
20. McStay, G.P., Salvesen, G.S. and Green, D.R. (2008) Overlapping cleavage motif selectivity of caspases:
Implications for analysis of apoptotic pathways.
Cell Death Differ.
15, 322–31.
21. Thornberry, N.A. et al. (1997) A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family
and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.
J. Biol. Chem.
272, 17907–
11.
22. Moravec, R.A. et al. (2009) Cell-based bioluminescent assays for all three proteasome activities in a
homogeneous format.
Anal. Biochem.
387, 294–302.
23. O’Brien, M.A. et al. (2005) Homogeneous bioluminescent protease assays: Caspase-3 as a model.
J. Biomol.
Screen.
10, 137–48.
24. O’Brien, M.A. (2006) A comparison of homogeneous bioluminescent and fluorescent methods for protease
assays. In:
Handbook of Assay Development in Drug Discovery,
Lisa Minor ed., CRC Press.
25. Garcia-Calvo, M. et al. (1999) Purification and catalytic properties of human caspase family members.
Cell Death
Differ.
6, 362–9.
8. 缓冲液和溶液的成分
caspase-1酶稀释缓冲液
10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）
0.1% Prionex
®
2mM DTT
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
27
9. 相关产品
细胞活力检测
产品
RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay
CellTiter-Glo
®
2.0 Assay
CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay
CellTiter-Glo
®
3D Cell Viability Assay
CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay
CellTiter-Blue
®
Cell Viability Assay
其他规格可供选择。
规格
100 assays
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
20 ml
目录号
G9711
G9241
G7570
G9681
G6080
G8080
细胞毒性检测
产品
CellTox™ Green Cytotoxicity Assay
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay
CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay
LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay
其他规格可供选择。
规格
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
目录号
G8741
G9290
G9260
J2380
基于机制的活力和细胞毒性检测
产品
ApoTox-Glo™ Triplex Assay
ApoLive-Glo™ Multiplex Assay
其他规格可供选择。
规格
10 ml
10 ml
目录号
G6320
G6410
凋亡检测
产品
Caspase-Glo
®
3/7 Assay
Caspase-Glo
®
8 Assay
Caspase-Glo
®
9 Assay
Apo-ONE
®
Homogeneous Caspase-3/7 Assay
RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay
其他规格可供选择。
规格
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
100 assays
目录号
G8091
G8201
G8211
G7790
JA1011
28
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
新陈代谢检测
产品规格目录号
NAD(P)H-Glo™ Detection System10 mlG9061
NAD/NADH-Glo™ Assay10 mlG9071
NADP/NADPH-Glo™ Assay10 mlG9081
Lactacte-Glo™ Assay5 mlJ5021
Glucose-Glo™ Assay5 mlJ6021
Glucose Uptake-Glo™ Assay5 mlJ1341
Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay5 mlJ8021
其他规格可供选择。
线粒体毒性
产品规格目录号
Mitochondrial ToxGlo™ Assay
10 mlG8000
100 mlG8001
氧化应激检测
产品规格目录号
ROS-Glo™ H
2
O
2
Assay10 mlG8820
GSH-Glo™ Glutathione Assay10 mlV6911
GSH/GSSG-Glo™ Assay10 mlV6611
其他规格可供选择。
细胞色素P450基于细胞的检测
产品规格目录号
P450-Glo™ CYP1A2 Induction/Inhibition Assay10 mlV8421
P450-Glo™ CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA10 mlV9001
P450-Glo™ CYP2C9 Assay10 mlV8791
P450-Glo™ CYP2B6 Assay10 mlV8321
其他规格可供选择。
检测仪器
产品规格目录号
GloMax
®
Discover System一套GM3000
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
电话：************网址：技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
29
10. 内容变更总结
以下是对此文件5/19修订版的更改：
1. 添加了100 ml的试剂盒（目录号：G9953）。
2. 备注了4.A中的批量处理和发光信号稳定性。
3. 管理变更。
(a)
U.S. Pat. Nos. 7,148,030, 7,384,758, 7,666,987 and 8,071,328, Japanese Pat. No. 4451663 and other patents
pending.
(b)
European Pat. No. 1131441 and Japanese Pat. No. 4520084.
© 2015–2019 Promega Corporation. All Rights Reserved.
Apo-ONE, Caspase-Glo, CellTiter-Blue, CellTiter-Glo, GloMax and Instinct are registered trademarks of Promega
Corporation. ApoLive-Glo, ApoTox-Glo, CellTiter-Fluor, CellTox, CytoTox-Fluor, CytoTox-Glo, GSH-Glo, GSH/GSSG-
Glo, Glucose-Glo, Glucose Uptake-Glo, Glutamine/Glutamate-Glo, Lactate-Glo, LDH-Glo, Mitochondrial ToxGlo,
NAD/NADH-Glo, NADP/NADPH-Glo, NAD(P)H-Glo, P450-Glo, RealTime-Glo, ROS-Glo and Ultra-Glo are trademarks
of Promega Corporation.
Prionex is a registered trademark of Pentapharm Ltd. Synergy is a trademark of BioTek Instruments, Inc.
Products may be covered by pending or issued patents or may have certain limitations. Please visit our Web site for
more information.
All prices and specifications are subject to change without prior notice.
Product claims are subject to change. Please contact Promega Technical Services or access the Promega online
catalog for the most up-to-date information on Promega products.
30
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd
地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
电话：************网址：
技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)
技术支持邮箱：*************************
TM456
2020制作
版权声明：本文标题：caspase-glo 1 炎症小体检测试剂盒说明书 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://roclinux.cn/p/1735509886a1673764.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
发表评论