Elatoside C在制备用于治疗和预防缺血性心脏病药物中的应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.5

(22)申请日 2014.09.26

(71)申请人 中国医学科学院药用植物研究所

地址 100193 北京市海淀区马连洼北路151号

(72)发明人 孙晓波 孙桂波 许旭东 王敏 张小坡

(74)专利代理机构 北京三聚阳光知识产权代理有限公司

代理人 李红团

(51)

A61K31/704

A61P9/10

A61P9/00

(10)申请公布号 CN 104306387 A

(43)申请公布日 2015.01.28

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

Elatoside C在制备用于治疗和预防

缺血性心脏病药物中的应用

(57)摘要

本发明公开了Elatoside C在制备用

于治疗和预防缺血性心脏病药物中的应

用。本发明所述的Elatoside C可以是

Elatoside C的药物组合物，包括口服及肠

胃外给药形式的各种剂型。用于口服时，

可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖

浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释

胶囊、控释片、控释胶囊；用于肠胃外给

药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌

粉针、输液。本发明药物组合物优选片剂

和水针剂型。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

ide C在制备心肌细胞保护作用的药物中的应用。

ide C在制备用于缺血性心脏病保护作用药物中的应用。

ide C在制备用于缺血再灌诱导心肌组织损伤的保护作用药物中的应

ide C在制备用于缺氧复氧诱导心肌细胞损伤的保护作用药物中的应

5.权利要求1～4任一所述的应用，其中Elatoside C为Elatoside C的药物组

6.根据权利要求5所述的应用,其中所述药物组合物最小单元所含活性成分

Elatoside C的量为2.5-100mg。

合物，是由Elatoside C与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂组成。

用。

用。

7.根据权利要求5所述的应用,其中所述的Elatoside C药物组合物为临床上任

8.根据权利要求7所述的应用,其中所述的剂型形式包括口服及肠胃外给药形式

的各种剂型；用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖

滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊；

时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、

何可接受的剂型形式.

浆、颗粒、

用于肠胃外给药途径

输液。

9.根据权要求5所述的应用,其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂可选自适

用于口服制剂的药用赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、

表面活性剂、吸附载体等；也可选自适用于注射剂的药

氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、

助溶剂、

用赋形剂，包括溶剂、抗

PH调节剂。

说 明 书

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种药用活性成分在制备药物中

的应用，尤其涉及在Elatoside C制备药物中的应用。

背景技术

心肌缺血再灌注损伤是临床上常见的病理过程，是制约急性心肌梗死患者从成功的

再灌注疗法中获得最佳疗效的主要因素之一。降低缺血再灌注对心肌损伤的程度一

直是心脏病学临床和基础研究的热点课题。

龙牙楤木系五加科楤木属植物，具有补气安神、活血化瘀的功效。我们从80年代

即开始了对龙牙楤木的系统研究，通过研究发现了龙牙楤木总皂苷治疗冠心病、心

绞痛的新用途，目前以龙牙楤木总皂苷为成分研制的楤木心脉通胶囊已获得药物临

床研究批件(批件2003L01111)，现已完成临床观察。尽管龙牙楤木总皂苷对心血

管系统具有明显的保护作用，化学成分研究较深入，但目前对其单体皂苷心血管活

性方面的基础研究薄弱，缺乏三萜皂苷结构与功效相关性研究，并且分子机制尚不

清楚，严重影响了龙牙楤木三萜皂苷的开发与临床应用。

我们通过对所分离得到的单体皂苷进行活性筛选，发现其中单体皂苷

Elatoside C(SM-3)对过氧化氢及缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤均具有显著的保护作

用。但是SM-3是否对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用尚需进一步的验证，并且

其具体保护机制尚不明确。

通过Elatoside C对心肌缺血的保护作用进行体内和体外的实验探究。同时进一步

探究Elatoside C发挥上述保护作用的作用机制，以期为开发 Elatoside C治疗心血

管疾病提供实验资料和理论依据。

发明内容

本发明公开了Elatoside C在制备用于心肌保护作用的药物中的应用；

更具体地，本发明公开了Elatoside C在制备用于缺血性心脏病保护作用药物中的

应用；

本发明公开了Elatoside C对缺血再灌诱导的离体心脏的保护作用的药物中的应

用；

本发明公开了Elatoside C对缺氧复氧诱导的心肌细胞H9c2损伤的保护作用的药物

中的应用。

本发明所述的上述应用,所述的Elatoside C为药物组合物，由Elatoside C与一种或

多种药学上可接受的载体或赋形剂制成药物组合物。

本发明所述Elatoside C用于抗缺血性心脏病保护作用药物为红车轴草总黄酮的药

物组合物，所述药物组合物最小单元所含活性成分Elatoside C的量为2.5-100mg。

本发明所述的Elatoside C药物组合物为临床上任何可接受的剂型形式，包括口服

及肠胃外给药形式的各种剂型。用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、

糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊；用于肠胃外

给药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。本发明药物组合物优选片

剂和水针剂型。

上述药物组合物，所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制剂的药用

赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体

等。

上述药物组合物，所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于注射剂的药用赋

形剂，包括溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、PH调节剂。

药物组合物最小单元是指一片，一颗胶囊，一袋颗粒或一支注射剂等。

本发明剂型可使用药物制剂工艺学本领域熟练技术人员所公知的惯常使用的任何方

法产生并且对此没有特别限制。

例如，本发明片剂可通过使用本领域公知的合适的方法粒化、干燥和筛分主要药剂

和赋形剂、粘合剂等等，向所得混合物中加入润滑剂等等然后混合并形成片剂。造

粒可通过本领域公知的任何合适的方法进行，例如湿法造粒、干法造粒或加热造粒。

合适的非限制性实例包括使用高速搅拌造粒机、流动造粒干燥机、挤压造粒机或滚

筒压紧器进行这些造粒方法。此外，例如干燥和筛分的方法可以根据进行造粒的需

要进行。主要药剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂等等的混合物还可直接形成片剂。

如果需要薄膜包衣，可以使用本领域已知的任何薄膜包衣装置，并且作为薄膜包衣

基质，合适的实例包括糖衣基、亲水膜包衣基、肠溶薄膜包衣基和缓释薄膜包衣

基。

附图说明

图1 Elatoside C对大鼠离体心脏再灌注后心脏收缩功能的影响。如图所示，与I/R

组相比，Elatoside C各剂量组能不同程度地改善再灌注后的心脏收缩功能相关指标

(LVSP,HR,±dp/dtmax)。

图2 Elatoside C对大鼠离体心脏LDH含量的影响。如图所示，与对照组相比，缺

血再灌组心肌冠脉流出液中LDH的含量明显增加。与I/R组相比，Elatoside C 50、

10、2nmol/L预处理组LDH的漏出明显减少，具有剂量依赖关系。

图3 Elatoside C对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用。如图所示，

Elatoside C对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的保护作用的量效关系。Elatoside C对

H2O2诱导的H9c2细胞损伤的保护作用的量效关系结果显示，与对照组相比，模

型组差异具有显著性；与模型组相比，Elatoside C预孵育12h时，Elatoside C组及

槲皮素20ug/ml组差异具有显著性。

图4 Elatoside C对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用的量效关系。如图所

示，与对照组相比，缺氧复氧损伤组可显著降低细胞存活率，具有显著性差异；与

模型组相比，Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)孵育4-24h均可抑制缺氧复氧导致的

细胞存活率的降低，差异具有显著性。

图5 流式检测Elatoside C对缺氧复氧损伤诱导的细胞线粒体膜电位的影响。如图

所示，缺氧复氧损伤组引起线粒体膜电位的下降，表现为荧光信号由右上向左下的

偏移。而Elatoside C显著减轻缺氧复氧诱导的线粒体膜电位的下降。

图6 Elatoside C对缺氧复氧损伤诱导的细胞线粒体ROS的影响。如图所示，与正

常对照组相比，Elatoside C处理可以降低缺氧复氧诱导的ROS释放，而缺氧复氧

组可以提高ROS水平。

图7 Elatoside C对心肌细胞内凋亡相关蛋白表达的影响。如图所示，与空白对照组

相比，模型组显著上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，

降低Bcl-2/Bax的比例，促进凋亡；而给予Elatoside C孵育后，可显著抑制缺氧复

氧引起的Bax表达的上调及Bcl-2表达的下调，从而抑制凋亡。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明，不构成对本发明的进一步限

制。

实施例1 Elatoside C对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

实施例1.1 Elatoside C对大鼠离体心脏收缩功能检测

使用大鼠心脏，将心脏主动脉与心脏灌流装置(Langendorff)相连接，进行逆向灌流。

同时记录心率,左室收缩压(LVSP)以及左室内压力的变化率最大值(±dp/dtmax)。采

用Global缺血30min再灌注60min的I/R模型。实验分组：60只大鼠随机分为5

组，正常对照组(Control)、缺血/再灌注损伤组(I/R)、Elatoside C 50、10、2nmol/L

预处理15min组。

结果如图1所示，Elatoside C能改善再灌注后的心脏收缩功能。

实施例1.2 Elatoside C对大鼠离体心脏LDH含量的影响

实验结束后,接取灌流液按试剂盒说明书检测各组LDH含量。

结果如图2所示，与对照组相比，缺血再灌组心肌冠脉流出液中LDH的含量明显

增加。与I/R组相比，Elatoside C 50、10、2nmol/L预处理组LDH的漏出明显减少，

具有剂量依赖关系。

实施例2：Elatoside C对H9c2心肌细胞的保护作用

实施例2.1 Elatoside C对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用

实验随机分为5组：正常对照组、H₂O₂损伤组、

Elatoside C预处理组 (0.75-12.5、ug/ml)，MTT法检测细胞存活率。正常对照组

(control)每孔给予100ul无血清DMEM培养液；H₂O₂损伤

组(model)每孔给予100ul终浓度为150uM的H₂O₂，作用

6h；Elatoside C处理组(12.5、25、50ug/ml)预孵育4-12h后，吸弃含药培养液，加

入100ul无血清培养液配制的终浓度为150uM的H₂O₂作

用6h。MTT法检测各组细胞存活率。

如图3所示，Elatoside C对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的保护作用的量效关系。

Elatoside C对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的保护作用的量效关系结果显示，与对

照组相比，模型组差异具有显著性；与模型组相比，Elatoside C预孵育12h时，

Elatoside C组及槲皮素20ug/ml组差异具有显著性。

实施例2.2 Elatoside C对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用的时效关系研

究

实验分为空白对照组，缺氧复氧损伤组，Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)五组分别

在复氧时孵育2-24h，MTT法检测细胞存活率。

如图4所示，与对照组相比，缺氧复氧损伤组可显著降低细胞存活率，具有显著性

差异；与模型组相比，Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)孵育4-24h均可抑制缺氧复

氧导致的细胞存活率的降低，差异具有显著性。

实施例2.3 Elatoside C对缺氧复氧损伤诱导的细胞线粒体膜电位的影响(JC-1染色)

将H9c2细胞以1×105个/ml的密度置于6孔板中，每孔加2ml，待生长至单层融合

后，分为5组：正常对照组、缺氧复氧损伤组、Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)孵

育4-12h组。实验终止，胰酶消化收集细胞。1000rpm离心5min。 加1ml DMEM

培养液洗细胞一次。重新加入1ml DMEM培养液，细胞计数。按所需量加入JC-1

染料(终浓度2μM)。37℃避光染色30min。离心(1000rpm×5min)去除多余染料。加

入2ml PBS清洗细胞一次。加入500μl PBS，过滤后上机检测。

如图5所示，缺氧复氧损伤组引起线粒体膜电位的下降，表现为荧光信号由右上向

左下的偏移。而Elatoside C显著减轻缺氧复氧诱导的线粒体膜电位的下降。

实施例2.4 Elatoside C对缺氧复氧损伤诱导的细胞线粒体ROS的影响

细胞传代铺于6孔板中(1×10⁵个/ml)，每孔2ml，待生长至单层融合后，

分为5组，各组处理同实施例2.3。按ROS检测试剂盒操作说明书进行检测。收集

各组细胞用MitoSOX Red(2.5μM)在黑暗中37℃孵育20 min。染色后用Hanks清洗

一次。荧光通过酶标仪在激发波长485nm和发射波长530nm下进行测定。

如图6所示，与正常对照组相比，Elatoside C处理可以降低缺氧复氧诱导的ROS

释放，而缺氧复氧组可以提高ROS水平。

实施例2.5 Western blot检测Elatoside C对心肌细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

实验处理终止,收集细胞,PBS清洗细胞2次后裂解细胞。裂解终止后,将细胞裂解液

在4℃、12 000×g离心15min,收集上清液用于蛋白表达分析。采用BCA蛋白定量

法确定蛋白浓度,然后10％SDA-PAGE电泳分离。电泳完毕后,将蛋白转移至NC膜

上,用丽春红染色观测蛋白转移是否完全,TBST脱色后用脱 脂牛奶室温封闭2h。分

别加入相应的一抗抗体(Bcl-2、Bax、β-actin),4℃孵育过夜。TBST洗涤后,加入

HRP标记的二抗,室温孵育1h,TBST洗涤后采用化学发光法检测蛋白的变化。

如图7所示，与空白对照组相比，模型组显著上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时

抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低Bcl-2/Bax的比例，促进凋亡；而给予

Elatoside C孵育后，可显著抑制缺氧复氧引起的Bax表达的上调及Bcl-2表达的下

调，从而抑制凋亡。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本

发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上

还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷

举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保

护范围之中。