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红色法拉利
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2006-06-01 21:50
原核表达手册
(
中文版
)
可以说是原核表达宝典级读物,MERCK公司产品,让你对原核表达有个更深的认识,不错的东东，推荐大家读读
红色法拉利
2006-06-01 21:57
之所以首先介绍
Novagen
公司的产品是因为用过它的系列载
体，感觉很好用。
Novagen
的母公司是德国默克（
Merck
）公司，它是
国际著名的化学及制药公司总部位于德国
的
Darmstadt
，已有
300
多年
的历史。已在全世界
55
个主要国家设立了分公司，其中在
28
个国家建
有
62
个生产
基地。
Novagen公司出品的系列载体是目前应用最为广泛的原核表达 系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的
异源蛋白。系列
载体是利用大肠杆菌
T7
噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理
见下图。
T7
噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的
元件为基础构建的表达系统称为
T7
表达系统。
T7
噬菌体基因编码的
T7RNA
聚合酶选择性的激活
T7
噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的
RNA
聚合酶，其合
成
mRNA
的速度比大肠杆菌
RNA
聚合酶快
5
倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌
RNA
聚合酶有效转录的序列。
在细胞中存在
T7 RNA
聚合酶和
T7
噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的
转录竞争不过
T7
噬菌体转录
体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因 的转录能达到很高的水平。
T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚 合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调
控方式。噬菌体
DE3
是
λ
噬
菌体的衍生株，一段含有
lac
Ⅰ
，
lacUV5
启动子和
T7 RNA
聚合酶基因的
DNA
片段倍插
入其
int
基因中，用噬菌体
DE3
的溶源菌，如
BL21(DE3)
、
HMS174(DE3)
等作为表达载体的宿主菌，调控方式为
化学信号诱导型，
类似于
Lac
表达系统。
从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子
进行选择，
Novagen
公司仅提供三个载体：
-
21(+)，-24(+)和
-23(+)
。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。
根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在
大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵
体形式表达。为了让
外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：
1.
与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽
S
转移酶
（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白
（
thioredoxin, Trx
）和
N
利用质
A
（
N utilization substance
A, NusA
）。
2.
转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，
DsbA
，
DsbC
。
3.
插入一个定位到周质空间的信号序列。
不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果你
不希望在蛋白的
N
末端加入任何的多肽，你也可
以选择用Nde
Ⅰ
直接从 起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸 的酶切位点把多余的
多肽切除。在重组技术上，
Novagen
除了传统的酶切、连
接方式外，还有不需要连接的克隆方式：
Ligation-
Independent cloning
，简称
LIC
。采用
LIC
方法的载体是线性化的，在末端有
12-15
个突出的碱基以在退火时和
目的片断互补。在设计
PCR
扩增引物时
加入与
LIC
载体互补的序列，
PCR
产物用
3’
→
5’
的内切酶消化出单链与载体
互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入
LIC
载体上。
一般的载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再 把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）
中，通过
IPTG
诱导进
行表达。而
coco
载体它引入了低拷贝控制元件，
F
附加体上的
oriS
和
repE
元件与
parABC
共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可 以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害
作用。
当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导
trfA
基因表达，质粒在细胞内
的拷贝数就可以增加到
25-50
。
coco
载体同时兼容了
DE3
调控模型，
在加入
IPTG
后诱导表达量达升高
2500
倍。
在保证质粒稳定性这一点上除了
coco
的方法还有另一种方法就是
将重组质粒转化进入含有
T7 RNA
聚合酶抑制剂
的
T7
溶菌酶表达基因的
菌株中，在含有
pLysS
的
pLysE
宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步
抑制，质粒可以
更稳定地存在。
Novagen
提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改
造，它们大致分为以下几个种类：
1.
蛋白酶缺陷型
所有
B
菌株的衍生株都是
lon
蛋白酶和
ompT
蛋白酶缺陷型的，这包
括有
B834, BL21, BLR,
Origami™ B, Rosetta™
和
Tuner™
。因此在
纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。
BL21(DE3)
是应用最多的
表达的表达菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大 肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它
的缺失，可以保证质
粒的稳定。
2. 保证所有细胞以同样量进行表达
Tuner™
株及它的衍生株（
Origami™ B
和
Rosetta™
）是
BL21
菌株
的
lacY1
缺失突变型，在这些菌株中可以使
蛋白以同样水平在所有
细胞中表达。
Lac
渗透酶的突变使进入每个细胞的
IPTG
量都是一
致的，这样使蛋白表达
浓度可以随着
IPTG
浓度而改变。通过对
IPTG
浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。一般说来，
低浓度
表达有利于蛋白的可溶性和活性。
3.二硫键形成与溶解性增强 二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也 专门设计了一些
菌株是谷胱甘肽还原酶（
gor
）和
/
或硫氧还蛋白还
原酶（
trxB
）缺陷型的，包括
AD494
，
BL21trxB
，
Origami，
Origami B
和
Rosetta-gami™
。在这些菌株中表达蛋白，可以更大程
度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形
式和有活性形式出现的
可能增加。
4.
稀有密码子的补给
不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆
菌的稀有密码子，特别当
这些稀有密码子呈连续分布的时候，就
会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。
Rosetta™
是为了表
达真核
蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA， 包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以
氯霉素抗
性的质粒形式存在。
Rosetta
系列是来自
BL21lacY1
，所以它具有
BL21lacY1
的所有特性。
5. 硒蛋氨酸标记 B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度 特异活性35S-met标记和晶
体成像蛋氨酸标记中非常有用。
我们常用的培养基有
LB
、
TB
、
M9
、
M9ZB
，
LB
因为其成本低廉所
以应用最为广泛，而
Novagen
有提供特殊的培
养基
Overnight Express™ Autoinduction System
。使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一
段时间再
加IPTG进行诱导，它可以直接进行过夜培养。在这种培养基 中含有痕量金属，可以满足合成蛋白时对金属的需
求。同时提供除了
各种氨基酸，这其中蛋氨酸是另外加入的。这样培养基可以满足细菌
生长的各种需求，使细菌
密度更高；可以自动诱导无需自己加IPTG； 使蛋白更加容易溶于培养基中；并且如果需要的话，可以对蛋氨酸进
行硒标记。
同时
Novagen
还有表达双外源蛋白的载体
pCDFDuet-1 DNA
、
Duet™-1 DNA
、
pRSFDuet-1 DNA
。这些载
体含有两个不同多克隆
位点，可以插入两个外源蛋白基因，利用单独的
T7
启动子
,
乳糖操纵子和核糖体结合位
点进行表达。载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达
8
个外源蛋白。
红色法拉利
2006-06-01 21:57
人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。
在
1960
年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质
——
胰岛素。随着内切酶的发现和基
因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠
杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等
优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白
的首选。
在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，
觉得十分有意思。但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在
天。有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。原因当然可以分析，
实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。”在实验遇
到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的时候需要考虑的
因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。
所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。
首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的
诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的
来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。
表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合
Tag
（如果有的话），复制子，
筛选标记
/
报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个
实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？
MCS
是否还是原来那个
MCS
？是我们要特别注意
的。
复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，
pMBI(pUC)
类的复制子的拷贝数高达
500
以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的
正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要
考虑复制元是否相容的问题。
筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的
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