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2024年12月29日发(作者：提供基于服务架构)
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）
上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE
电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操
作步骤详解（上） 》。下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
四、转膜
我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90 kd 以下的蛋
白，转膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037%
的 SDS。
1. 在电泳结束前 20 min 开始准备转膜所需的东西。转一张膜需
准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测
量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。切滤纸
和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用
前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。目的是为了活化 PVDF 膜上面的
正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移
时多加甲醇也是这个目的。
2. 将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻
轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定
要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇
的好）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取 10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使
液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。之后有
两种方法供选择，一是按照 marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白
的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作
稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇
的 PVDF 膜和滤纸，平衡 10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜
中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3. 带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放 3 张浸
泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在 PVDF 右上角减去一个角，
以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外 3
张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去
气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气
泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。
用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，
宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致
电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，
有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。最后将转移槽的上盖扣上，
接通电源开始转膜。
由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设
备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属
上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做 western
的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。
4. 依据分子量大小电泳 15~60 min。如果初次转膜，可以根据一
般经验，即多少 kD 的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。之后
断开电源，取出转移膜进行后继实验。
5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，
最好使用预染。传统方法是将膜用 1×丽春红染液染 5 min（于脱色摇
床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际
上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入 20% 的甲醇，待完全
浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合 PVDF 膜）。
将膜晾干备用。使用预染 marker 话可以看见 marker 的颜色转印到了
膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。
五、免疫杂交反应
1. 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h
即可。如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。实
际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜。
2. 将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高
用 TBST 稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的
复方稀释液）至适当浓度（可以在 1.5 mlEP 管中配置工作液，常用稀
释倍数为 1:200，1:500，1:1 000，具体需要预实验进行摸索，用后
可回收重复用 2~3 次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，
分装的抗体不推荐回收。稀释后应在 2-3 天内使用，4 度保存，避免
反复冻融。）
撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以
使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，
用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角
以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的
折叠部分，用封口器（40~80 元一个）封上，不漏液即可）。37° 孵
育 1 h 之后转移到室温下再孵育 1 h（或者 4°孵育过夜），用 TBST 在
室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。
也可以多洗几次，比如 4 次，每次 5 min。
3. 在培养皿内加入二抗稀释液（10 ml 足够了，一般 1:1 000 甚
至 1:10 000 用 TBST 稀释），放在摇床上，室温下孵育 1~2 h 后，用
TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，
10 min,进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变，另
外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可
能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵
育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。
六、化学发光（ECL），显影，定影
1. 现在工作台上铺一张保鲜膜，将 PVDF 膜放在保鲜膜上。将
ECL 的 A 和 B 两种试剂在 EP 管内等体积混合（注意吸完 A 试剂后吸
B 试剂前要患枪头），然后均匀滴在 PVDF 膜的蛋白面，反应 1~2
min 后，将 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干，之后转移到在 X 片夹
中预先铺好的保鲜膜上一侧，把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把
保鲜膜固定在片夹上。
2. 在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下
取出 X-光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1 cm）；
打开 X-光片夹，把 X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上
X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1
min 到 2 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果（也有人
重叠压好几张片，固定曝光 5~10 分钟，从这好几张片中选出最合适
的底片）；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影
液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为 1~2 min（20~25℃），温度过低时（低于 16℃）
需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定
影时间一般为 5~10 min,以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影
液后，室温下晾干（注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一
角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）。
X 光片一般选用柯达原装的生物实验专用柯达 X-OMATBT 胶片 .
显影液和定影液最好每周配置一次，避光室温保存，显影和定影液是
最便宜的试剂了，千万不要因为它而影响了整个结果。
七、凝胶图象分析
文章来源：丁香园站友 @dlzhangyu
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