sunbio AAV产品手册 最终版

上海生博AAV产品手册（2017版）

一、AAV背景知识

1.1AAV概况

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，是一类无包膜的细小病毒，属于

微小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependoparvovirus)，透射电镜

(transmission electron microscope，TEM)下，AAV病毒本身呈二十面体结构。AAV

基因组为约4.7kb的线性单链DNA(single strand DNA，ssDNA)，只含两个基因，

Rep(Replication)基因和Cap(Capsid)基因。AAV为目前发现的基因组最简单的复制

缺陷型病毒，也因此，AAV被作为病毒载体广泛应用。

FIG1 AAV的3D构象图 FIG2 AAV病毒颗粒的组分构成

FIG1和FIG2文献出处：Mingozzi, F. and K.A. , 2013. 122(1): p. 23-36.

FIG3 AAV TEM图

Zinn, E., et al.. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68.

1.2AAV的ITR区

AAV基因组的5’和3 ’端各有一个长度为145bp的倒转重复序列(inverted

terminal repeat，ITR)，是AAV复制和包装所必需的最少的自身序列。ITR区富含

GC(>80%)，可折叠为一个自我互补的T型发卡结构，其中的Rep蛋白结合位点(Rep

binding elements，RBE)、RBE’和末端解链位点(terminal resolution site，TRS)是AAV

基因组的复制起始的关键。另外ITR区还含有包装信号，是AAV整合、复制和包装

所必须的顺式作用元件，并具有转录启动子活性。

FIG4 AAV基因组结构图

Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.

FIG5 AAV ITR区的二级结构图(以AAV2序列为例)

Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.

1.3AAV的ORF

AAV含有两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Rep基因和Cap基因。

左侧的ORF含Rep基因，可编码4个非结构蛋白-Rep40、Rep52、Rep68和Rep78，

对AAV的复制、转录、基因组整合和包装必不可少。Rep使用p5启动子产生非

剪切和剪切后的转录产物，后翻译得到分子量较大的Rep78和Rep68蛋白；p19

启动子则可产生更短的非剪切和剪切后的转录产物，经翻译得到分子量较小的

Rep52和Rep40蛋白。

右侧的ORF含Cap基因，可编码3个结构蛋白-VP1、VP2和VP3，Cap使用

p40启动子，经剪切后产生两个转录本，较长的转录本翻译产生分子量为87KD

的VP1蛋白，较短的转录本可使用两个密码子，由非传统的ACG起始密码子起

始，得到72KD的VP2蛋白，下游传统的AUG起始密码子起始，得到62KD的VP3

蛋白。5个VP1、5个VP2和50个VP3蛋白共同构成AAV的病毒外壳

(VP1:VP2:VP3=1:1:10)，衣壳表面由VP3、 VP1的C端和VP2的C端构成，VP1

和VP2的N末端位于衣壳内部。

FIG6 AAV 蛋白的编码

Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.

1.4AAV的复制

AAV是复制缺陷型病毒，需要腺病毒(Adenovirus，Adv)或疱疹病毒(Herpesvirus)

等辅助病毒提供DNA聚合酶和解旋酶，参与复制。通常情况下，我们将用目的启

动子和基因取代AAV的基因组本身的rep和cap基因，得到重组AAV(recombinant

AAV，rAAV)的基因组质粒。在体外AAV包装系统中，除去rAAV质粒，还需要一个

含有rep和cap基因的外壳质粒、一个含E2a、E4和VAI RNA基因的辅助质粒(E2a表

达一个ssDNA结合蛋白质，以促进AAV DNA复制，E4编码增进mRNA装运到细胞质

的蛋白质，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译)，在

辅助质粒的帮助下，ITR将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。rep和cap

基因转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。

FIG7 rAAV的基因组及包装

Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.

1.5AAV的生活史

自然情况下，AAV感染细胞后，之后的过程可分为七个阶段，即：(1)AAV与

受体的结合，(2)病毒颗粒的内摄，(3)囊泡的运输，(4)内涵体的脱离，(5)核转运，

(6)病毒脱壳，(7)在辅助病毒存在，提供DNA聚合酶和解旋酶时，基因组DNA进

行复制。但是当没有辅助病毒的存在时，AAV定向整合至19号染色体(q13.4)，

被称为AAVS1，仍可进行复制，但不产生或包装子代感染性病毒颗粒。而体外包

装得到的rAAV感染细胞后，通常不会整合到基因组，而是串联形成附加体(类似

细菌的质粒)存在于细胞核中，从而保持长期稳定的基因表达，对于终末分化的

细胞，该优点特别明显。

FIG8 rAAV生活史

Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.

1.6AAV的血清型

AAV在动物体内表现为有多种血清型，这是由于AAV有多种不同的外壳蛋

白，不同血清型的AAV，感染过程中使用的受体也不尽相同（表格1），因此感

染的组织器官和效率也各有差异（FIG9）。

目前，在人体内发现12种AAV，AAV1-AAV12，而在非哺乳类动物体内则发

现100多种的AAV血清型。现有研究所用的AAV中，AAV2、AAV3、AAV5和AAV9

是从人体内分离得到的，其他血清型的AAV均为动物体内分离得到（表格1）。

自然情况下，80%的AAV感染都是AAV2感染，而AAV2也是最早被分离并应用

最广泛的血清型，但是AAV2感染范围较窄，而人们也在不断研发新的AAV血清

型，AAAV2已被其他血清型逐步替代。

表格1 AAV血清型及其受体

Miyake, K., et al. J Nippon Med Sch, 2012. 79(6): p. 394-402.

FIG9 AAV1-9感染小鼠效果图

Zincarelli, C., et al. Mol Ther, 2008. 16(6): p. 1073-80.

AAV血清型：AAV1-9

小鼠模型：雄性Balb/C小鼠(8-10周龄)

接种剂量：每只小鼠1×10

11

vg(in 312ul PBS)

接种方式：尾静脉

检测时间：接种后29天-9个月

检测操作：活体成像

目前大家广泛认同的不同组织推荐使用的AAV血清型如下表所示：

表格2 AAV1-9组织亲和性表格

1.7rAAV的体外包装

通常情况下，野生型AAV指的是AAV2，现有的rAAV质粒，其ITR区也多来

自于AAV2，在包装rAAV时，我们通常选择使用带有目的血清型cap基因的外壳

质粒，从而得到目的血清型的rAAV，我们一般书写为rAAV2/1-9。

FIG10 体外rAAV包装系统

Beltran, W.A. Vet Ophthalmol, 2009. 12(3): p. 192-204.

1.8rAAV特点及优点

AAV具有广泛宿主范围、高滴度病毒生产能力和长期基因转染潜力等的特征，

因此被人们认为是基因传递和表达的一个重要工具。AAV与其他常用的工具病毒

(如慢病毒和腺病毒)的区别如下图所示：

FIG11 AAV与腺病毒慢病毒的区别

rAAV作为工具载体，具有以下优点：

FIG12 AAV作为载体的优点

二、AAV在神经系统研究中的应用

2.1rAAV应用与神经系统概况

rAAV(如AAV9和AAV-PHP.B)可以穿透血脑屏障，因此，与腺病毒及慢病毒等

工具病毒相比，AAV更适于中枢神经系统方面的研究，是最理想的神经元和胶质

细胞感染工具。对神经系统的各项研究中，功能研究对于精神疾病的发病机制、

预防、诊断和治疗都至关重要，是现阶段神经科学领域的热点，而AAV可高效

地应用于中枢神经系统功能研究的各个方向。

FIG13 中枢神经系统研究

2.2生博rAAV载体可选元件

现阶段，我们可应用于rAAV载体的启动子如下所示：

神经特异性启动子：

1

2

3

启动子名称

hSyn

GFAP

mCaMKIIa

启动效率及特异性

高，神经元细胞特异启动子

星形胶质细胞特异启动子

高，兴奋性神经特异启动子

4

5

6

7

8

9

rNSE

rNESTIN

VGAT

GABRB1

TH

ChAT

神经元细胞特异启动子

神经干细胞特异启动子

GABA能神经元细胞特异启动子

γ-氨基丁酸受体特异启动子

多巴胺能神经元细胞特异启动子

胆碱能神经元的特异性启动子

常规广泛启动子：

1

2

3

4

5

启动子名称

EF1a

nEF

CAG

CMV

U6

启动效率及特异性

高，广泛启动子

广泛启动子

高，广泛启动子

高，广泛启动子

弱，广泛启动子

可应用于rAAV载体的荧光蛋白如下所示：

分类

红色系列

橙色系列

黄色系列

绿色系列

蓝色系列

荧光名称

mCherry

mRuby2

tdTomato

(Tandem)

TagRFP

EYFP

GFP(wt)

EGFP

Superfolder GFP

CDG

BFP

激发峰(nm)

587

580

554

555

514

395/475

484

485

503

380

发射峰(nm)

610

609

581

584

527

509

507

510

518

440

亮度(EGFP%)

43

117

283

143

150

48

100

160

240

27

2.3光遗传系统

2.3.1光遗传系统概况

光遗传学(optogenetics)技术，一种新型的用于研究神经的技术，简单理解即

为光学(optics)与遗传学(genetics)的结合，是将光敏感的分子或离子通道转移到神

经细胞里面，然后用光照射，使神经细胞被激活或抑制。

光遗传学应用范围广泛，神经生物学方面，可用于解释某种生物现象或对哺

乳动物行为进行调控；分子生物学方面，可靶向不同种类细胞的生命活动和功能；

医学方面，可改善或治愈某些因神经系统功能障碍引起的疾病，如阿兹海默症

(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、脊髓损伤(Spinal cord

injury，SCI)和精神分裂症(Schizophrenia)等。

FIG14 光遗传学流程图

Cho, W.H., E. Barcelon, and S.J. Lee. Exp Neurobiol, 2016. 25(5): p. 197-204.

FIG15 光与神经网络图 FIG16 光遗传学应用图

Boyden, E.S. Cerebrum, 2011. 2011: p. 16.

Park, S.I., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(50): p. E8169-e8177.

光遗传相关通道蛋白

分类

光遗传激活

光遗传抑制

2.3.2rAAV在光遗传系统中的实际应用

光遗传应用举例1

神经蛋白名称

hChR2(H134R)

ChETA

C1V1

NPHR

eNpHR3.0

Arch

rArch3.0

原理

Na+通道

Na+通道

Na+通道

Cl-通道

Cl-通道

H+通道

H+通道

作用效果

神经元激活

神经元激活

神经元激活

神经元抑制

神经元抑制

神经元抑制

神经元抑制

FIG17 分别携带光遗传相关通道蛋白ChR2和eNpHR3.0的AAV5-eYFP定位

注射至初级躯体感觉皮层，3周后，检测光遗传相关通道蛋白ChR2和eNpHR3.0

的表达

Brill, J., et al. 2016. 3(4). doi: 10.1523/ENEURO.0142-15.2016.

AAV血清型：AAV5

小鼠模型：Parv::Cre转基因小鼠(第40代，25-30日龄)

接种剂量：每只鼠接种1×10

12

vg(in 1ul PBS)

接种部位：两侧的初级躯体感觉皮层

检测时间：接种后3周

检测方式：取脑组织，固定，免疫组化检测

光遗传应用举例2

FIG18 在VTA部位定位注射AAV-Arch-GFP，AAV可携带Arch至神经元，使

用光遗传技术，抑制含PV和SOM的神经元的功能

Zhu, Y., et al. Nat Commun, 2015. 6: p. 6802.

AAV血清型：AAV(文献里没有说明)

小鼠模型：雄性Cre转基因小鼠(3周龄)

接种剂量：每只鼠接种1×10

9

vg(in 0.5ul PBS，0.05ul/min)

接种部位：腹侧被盖区(VTA)

检测时间：接种后10-14天

检测方式：取脑组织，固定，免疫组化检测

2.4Ca2+通道

2.4.1Ca2+通道概况

Ca2+与神经元细胞密切相关，当神经元活动的时候，胞内Ca2+浓度能上升

10-100倍，增加的Ca2+对于含有神经递质的突触囊泡的胞吐释放过程必不可少。

因此，可通过观察神经元内Ca2+浓度，来监测神经元的活动。

目前，广泛使用的钙离子指示剂GCaMPs，是一种基因编码的钙离子指示剂，

主要由以下三个片段组成：

cpEGFP(circularly permuted enhanced GFP，环状序列改变的增强型绿色荧光

蛋白)+CaM(calmodulin，钙调蛋白)+M13(CaM-binding peptide，平滑肌细胞肌球蛋

白轻链激酶片段)。

FIG19 GCaMP序列及其3D构型图

Akerboom, J., et al. J Biol Chem, 2009. 284(10): p. 6455-64.

GCaMPs可通过特异的启动子和定位序列实现在特定类型细胞或亚细胞结构

表达，从而检测目标细胞或亚细胞结构内的Ca2+信号的变化，记录生理条件下

或外源刺激下不同细胞的反应方式、信号的起源和传递。

为了得到更灵敏，荧光强度更好的GCaMPs，经过不同位点的突变，可得到

优化后的GCaMPs，目前使用较为广泛的为GCaMP5G和GCaMP6(GCaMP6s、

GCaMP6m和GCaMP6f)。总体而言，GCaMP6在信噪比和荧光强度方面优于

GCaMP5，但其钙信号上升至峰值所需时间和衰减时间均较GCaMP5长。

FIG20 GCaMP5和GCaMP6差异对比

Chen, T.W., et al. Nature, 2013. 499(7458): p. 295-300.

e和f图说明：

AAV血清型：AAV2/1

小鼠模型：C57BL/6J小鼠(6-8周龄)

接种剂量：每只鼠10

5-6

genomes(in 30nl PBS)

接种速度：6 nl /分钟

接种部位：初级视觉皮层

检测时间：接种后3周

GCaMPs特点及应用说明：

分类

钙信号

Gcamps

Gcamp5G

原理

监测Ca2+浓度改变，以指示

神经元活化情况

监测Ca2+浓度改变，以指示

神经元活化情况

监测Ca2+浓度改变，以指示

神经元活化情况

监测Ca2+浓度改变，以指示

神经元活化情况

应用

适合检测清醒自由小

鼠对外界信息的快速

反应性

GaMP6S动力学较慢，

适合检测缓慢持续的

钙信号

GCaMP6F动力学快，

适合检测快速变化的

钙信号

GaMP6M动力学中等，

常规钙信号检测

Gcamp6S

Gcamp6F

Gcamp6M

2.4.2rAAV在Ca2+通道中的实际应用

Ca2+通道AAV应用举例

FIG21 AAV-DIO-GCamp6m定位注射至Cre小鼠10天后，在LHb部位检测

GCamp6m的表达

Wang, D., et al. 2017. 6. doi: 10.7554/eLife.23045.

AAV血清型：AAV2/9

小鼠模型：Cre小鼠(雌雄均可，8-16周龄)

接种剂量：每只鼠3-15X10

8

viral particles（共300nl, 40nl /分钟）

接种部位：脑部的外侧缰核(LHb)

检测时间：最少接种后10天

2.5化学遗传学

2.5.1化学遗传学概况

通过将不同的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)进行突变

改造，成为DREADDS(Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs)后，

其只接受外源性的配体的信号，并激活相应的GPCR信号通路，从而引发细胞不

同的兴奋性变化。因此，应用于神经细胞内，则会进一步引起后续的钠离子通道、

钙离子通道的打开或关闭，从而诱发神经细胞膜电位的变化。DREADDS技术已

被证实，可在体内作用于β-细胞、星形胶质细胞和大量神经元细胞的GPCR信号，

并在药物开发、基因治疗和组织工程学方面具有巨大潜力。

与光遗传学相比，DREADDS作为化学遗传学的产物应用于神经生物学的优

点如下：

1.非侵入性：药物激活特异性受体只需要腹腔注射即可，无需进行开颅手

术埋置光纤，不会因为无关变量而影响实验动物情绪，或因为额外负重影响小鼠

行为，可实现在小鼠完全自由活动的情况下调控特定脑区和特定神经元的活动。

2.药物作用时程长：由于药物在实验动物体内代谢需要一定的时间(小时量

级)才能完成，因此药物遗传学工具可以在较长时程上影响动物行为。例如，在

研究摄食行为时，长时间给予光刺激可能带来显著的热效应，而此时DREADDS

的优势即可凸显出来。

目前，广泛使用的GPCR为hM3Dq和hM4Di：

hM3Dq(human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)是将人毒蕈碱

型乙酰胆碱受体(the human muscarinic acetylcholine receptor，mAchRs)亚型M3(即

hM3)的Y3.33C和A5.46两个位点突变，就能使hM3不与乙酰胆碱耦合，但会和

纳摩尔浓度级别的氯氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide，CNO)结合，从而激活神经

元。

hM4Di(human M4 muscarinic DREADD receptor coupled to Gi)则是将mAchRs

亚型4上的Y3.33C和A5.46两个位点突变，可以激活Gi调节的K+信号通路，从

而抑制神经元。

FIG22 hM3Dq和hM4Di信号通路图 FIG23 DREADDS技术及其应用

Pollock, J.D., D.Y. Wu, and J.S. Satterlee. Trends Neurosci, 2014. 37(2): p. 106-23.

Farrell, M.S. and B.L. Roth. Brain Res, 2013. 1511: p. 6-20.

2.5.2rAAV在化学遗传学中的实际应用

FIG24 使用DREADDS技术调控GABA能神经元，AAV-DIO-hM3Dq和

AAV-DIO-hM4Di分别定位注射至Cre小鼠的BNST部位3周后，检测hM3Dq和

hM4Di的表达及神经元的功能变化

Mazzone, C.M., et al. Mol Psychiatry, 2016. doi: 10.1038/mp.2016.218

AAV血清型：AAV8

小鼠模型：Cre小鼠(8周龄以上)

接种剂量：每只鼠4-5×10

8

genome copies(0.4-0.5ul,100nl/min)

接种部位：定位注射，终纹床核(BNST)

检测时间：接种后3周

2.6 Cre-Loxp重组系统

2.6.1 Cre-Loxp重组系统概况

Cre(causesre combination)蛋白是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中被发

现，属于λInt酶超基因家族。LoxP(locus of X-overP1)位点，是位于P1噬菌体中

的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，

间隔序列决定loxP的方向。Cre重组酶识别loxp位点后，对两个loxp位点之间

的序列进行剪切和拼接，从而完成翻转、删除和异位。在神经系统中，我们通常

使用Cre-loxp系统来实现基因序列的删除和翻转。

FIG25 LoxP位点的序列

FIG26 Cre-Loxp重组系统的功能

FIG27 Cre-Loxp重组系统的应用

目前，大家更多地开始使用增加lox2272的Cre重组系统，lox2272位点也可

以被Cre重组酶识别并剪切。这种新的重组系统中，同时含有一对loxp和一对

lox2272位点，Cre重组系统分两步完成功能，第一步，先将一对loxp或一对lox2272

位点之间的基因序列进行颠倒，第二步，将一对loxp或一对lox2272位点之间的

基因序列进行删除剪切，只剩余一个loxp和一个lox2272位点。这种新的Cre重

组系统效率更高，效果更好。

FIG28 更高效的Cre重组系统

Wall, N.R., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(50): p. 21848-53.

2.6.2 rAAV在Cre重组系统中的实际应用

FIG29使用Cre-loxp-lox2272重组系统检测目的蛋白在脑组织的表达，

AAV-DIO-SnRFP定位注射至Cre小鼠的海马区和皮质区30天后，检测SnRFP的

表达及定位

Luo, W., et al. Sci Rep, 2016. 6: p. 35747.

AAV血清型：AAV-DJ/8

小鼠模型：转基因小鼠(P10-13)

接种剂量：每只鼠4.6×10

5

vg(in 1ul PBS)

接种部位：海马区和皮质区

检测时间：接种30天后

检测操作：免疫组化

三、AAV在其他组织器官中的应用

AAV应用范围广泛，从体外到体内，从细胞到组织，如脑组织、视网膜、心

脏、骨骼肌、肝脏、肾脏、肺脏、肠道、血管。此外近期文献显示，研究者研发

出一种可在中枢神经系统内逆向示踪的新型AAV，及一种感染效率更高的新血清

型AAV-PHP.B。

3.1逆向示踪Retro-AAV

AAV逆向追踪，是利用AAV在轴突末端进入神经元，标记出整个神经元，被

标记的神经元投射到注射位点，从而得出注射位点区域的input。

Retro-AAV应用举例1

FIG30 使用Retro-AAV-tdTomato定位注射至小鼠的脑桥核21天后，检测

tdTomato的表达及定位，从而检测Retro-AAV的逆向示踪能力和效率

Tervo, D.G., et al. Neuron, 2016. 92(2): p. 372-382.

AAV血清型：AAV1/2

小鼠模型：C57/Bl6J小鼠(6-8周龄)

接种剂量：每只鼠1.3X10

8

GC(in 50-100nl)

接种方式：定位注射

接种位置：脑桥基底部的脑桥核(BPN)

检测时间：接种后21天

检测操作：共聚焦荧光显微镜拍照

Retro-AAV应用举例2

FIG31 使用Retro-AAV-tdTomato定位注射至小鼠的纹状体21天后，检测

tdTomato在皮质、杏仁核和丘脑等部位的表达，从而检测Retro-AAV的逆向示

踪能力和效率

Tervo, D.G., et al. Neuron, 2016. 92(2): p. 372-382.

AAV血清型：AAV1/2

小鼠模型：C57/Bl6J小鼠(6-8周龄)

接种剂量：每只鼠1.3X10

8

GC(in 50-100nl)

接种方式：定位注射

接种位置：背内侧纹状体(DMS)

检测时间：接种后21天

检测操作：共聚焦荧光显微镜拍照

3.2新血清型AAV-PHP.B

来自美国加州理工学院的 Benjamin Deverman 及其同事们开发出一种被称

作基于 Cre 重组的 AAV 靶向进化(Cre recombination–based AAV targeted

evolution, CREATE)的病毒衣壳选择方法，从而开发出更加高效地转导体内表达

Cre 的细胞群体的 AAV 病毒衣壳。利用 CREATE 方法，他们开发出经静脉注射

后能够高效地和广泛地转导成年小鼠中枢神经系统的 AAV 变异体，一类是在神

经元和神经胶质细胞中都能发挥较高转导效率的 AAV-PHP.B、AAV-PHP.B2 和

AAV-PHP.B3，另一类是在星形胶质细胞转导中表现出更高效率且选择性更强的病

毒载体 AAV-PHP.A。

FIG32 小鼠静脉注射AAV-PHP.B 3周后，检测AAV-PHP.B在脑、肝脏、心脏、肌

肉、胰腺和肺脏等组织部位的表达，从而显示了AAV-PHP.B可穿过血脑屏障，在

CNS区很好地表达，且比AAV9具有更高的感染效率和组织亲和性

Deverman, B.E., et al. 2016. 34(2): p. 204-9.

AAV血清型：AAV-PHP.B

小鼠模型：成年GFAP-Cre小鼠

接种剂量：每只鼠1X10

11-12

vg(in 50-100nl)

接种方式：静脉注射

检测时间：接种后3周

检测操作：共聚焦荧光显微镜拍照

3.3 rAAV在脑组织中的应用

大部分血清型的rAAV对神经细胞都有较强的感染能力， 如rAAV2在体外可

以很好地感染神经元和胶质细胞， rAAV8和rAAV9在体内可以有效地感染大部

分中枢神经系统神经元。更多血清型的AAV感染神经细胞的应用比较见下表。

在大鼠和小鼠上进行神经系统的AAV定位注射时，因为病毒注射体积限制

（一般<2ul），rAAV滴度要求较高（一般>2x10

12

v.g./ml ），注射后一般10天之后

再进行相关检测，一般4~6周出现表达高峰并持续到6个月以上（甚至可长期持

续至18个月）。

血清型 体外应用 体内应用

(定位注射)

CNS及外周

说明

AAV2/2

感染原代细胞、常

规细胞系

AAV2/5

感染效率低，使用

较少

AAV2/6

感染效率低，使用

较少

AAV2/8

感染效率低，使用

较少

AAV2/9

感染效率低，使用

较少

AAV DJ

感染常规细胞系

在神经系统中扩散能力一

般

可逆行扩散 CNS及DRG

CNS及外周 可逆行扩散

CNS及脊髓灰质 在神经系统中扩散能力最

强

在神经系统中扩散能力最

强

体内应用时，毒性较强

CNS及脊髓灰质

CNS

rAAV脑组织应用举例1

FIG33 不同血清型的AAV分别定位注射至小鼠的纹状体、海马区和听觉皮层21

天后，检测AAV的表达与分布，从而显示了不同血清型的AAV对不同脑组织部

位的感染效率

Aschauer, D.F., S. Kreuz, and S. Rumpel. PLoS One, 2013. 8(9): p. e76310.

AAV血清型：AAV1/2/5/6/8/9

小鼠模型：CB57BL/6J 小鼠(8-12周龄)

接种剂量：每只小鼠9.6X10

11

vg(in 80nl，20 nl/min)

接种方式：定位注射

接种位置：A:纹状体，B:海马区，C:听觉皮层

检测时间：接种21天后

检测操作：共聚焦显微镜拍照

rAAV脑组织应用举例2

FIG34 AAV-NEP心内接种于脑啡肽酶缺陷小鼠14天后，检测NEP在脑组织的表

达与分布，从而显示了AAV高效率地介导脑啡肽酶在脑组织部位广泛表达

Iwata, N., et al. Sci Rep, 2013. 3: p. 1472.

AAV血清型：AAV9

小鼠模型：脑啡肽酶缺陷小鼠(7-9周龄)

接种剂量：每只小鼠4X10

11

genomes(in 100ul)

接种方式：心内接种

检测时间：接种后14天

检测操作：免疫组化

3.4 rAAV在视网膜中的应用

使用AAV等病毒载体，将治疗基因有效导入视网膜色素上皮、视皮层神经

元和光感受器等区域，已成为某些遗传性眼疾等眼科疾病的治疗手段。根据研究

结果，AAV对眼部细胞的转染较稳定，可转染分裂细胞和非分裂细胞，且在眼部

的免疫反应较弱，更重要的是，AAV可介导外源基因在视网膜细胞内长期表达（超

过18个月），具有较强的优势。目前有报道显示，光遗传学技术与AAV结合，

或可应用于视力恢复，AAV或可成为眼部疾病最有效的基因载体工具之一。

目前AAV注射一般为视网膜下或者玻璃体腔注射，病毒可通过扩散，感染

视网膜不同层次的细胞。文献显示，AAV8和AAV9可以侵染视网膜各个层次的

细胞；AAV2相对特异，可以感染神经节细胞层。具体血清型的 AAV感染视网膜

各层细胞比较见下表。

FIG35 AAV与光遗传学技术结合，应用于视力恢复的研究

Francis, P.J., B. Mansfield, and S. Rose. Transl Vis Sci Technol, 2013. 2(7): p. 4.

感染方法

玻璃体注射

法

AAV1

Muller细

胞、RPE

AAV2

Muller细

胞、RGC

AAV5

Muller细

胞、RGC、

PR

RPE、PR

AAV8

RPE、RGC、

PR

AAV9

RPE、RGC、

PR

视网膜下注

射法

RPE

RPE、PR RPE、RGC、

PR

RPE、RGC、

PR

RGC表面感

染法

PR表面感

染法

Muller细

胞、RGC

Muller细

胞、PR

Muller细

胞、RGC、

PR

Muller细

胞、RGC、

PR

Muller细

胞、RGC、

PR

Muller细

胞、RGC、

PR

RPE、RGC、

PR

RPE、RGC、

PR

RPE、RGC、

PR

RPE、RGC、

PR

rAAV眼组织应用举例

FIG36 AAV-hPEDF玻璃体接种至小鼠眼内6、12和18个月后，分别检测hPEDF

的表达与分布，显示了单次AAV接种即可介导目的蛋白的长期表达

Haurigot, V., et al. PLoS One, 2012. 7(7): p. e41511.

AAV血清型：AAV2

小鼠模型：TgIGF-I小鼠(过表达IGF-I的CD1杂合小鼠，6周龄)

接种剂量：每只眼6.4X10

8

vg(in 2ul)

接种方式：玻璃体接种

检测时间：B&D:接种后6个月

E-左图:接种后12个月

E-右图:接种后18个月

检测操作：免疫组化

3.5 rAAV在心脏中的应用

AAV可用于心血管疾病如心衰和心肌肥大等慢性心脏病的研究，通常可通过

多种接种在体注射AAV感染心脏，如静脉注射(包括尾静脉注射、颈静脉注射和

面部静脉注射)、颈静脉注射、心肌原点注射、心包内注射(介于心肌与心包膜之

间)和心腔内注射等方式，病毒接种量为10

10

-10

11

v.g 。

临床上靶向心肌的AAV一般为AAV1、AAV6和AAV9型，其中AAV1和AAV6

均可有效靶向心肌和骨骼肌细胞，而AAV9则更加倾向于对心肌的感染。

rAAV心脏应用举例

FIG37 不同血清型的颈静脉接种至小鼠28天后，活体成像及取心脏组织检测

AAV在小鼠心脏部位的表达与分布，显示了对心脏的感染效率和亲和性而言，

AAV9>AAV8>AAV6>AAV1>AAV2

Prasad, K.M., et al. Gene Ther, 2011. 18(1): p. 43-52.

AAV血清型：AAV1/2/6/8/9

小鼠模型：C57BL/6小鼠(1周龄)

接种剂量：每只鼠1×10

11

viral genomes

接种方式：颈静脉接种

检测时间：接种后28天

小鼠检测操作：活体成像

组织检测操作：心脏冰冻切片后，共聚焦显微镜拍照

3.6 rAAV在骨骼肌中的应用

在通常情况下，我们多采用在目的骨骼肌组织部位，直接原点注射或多点注

射（AAV滴度要求为10

12

vg/ml以上，注射体积为10ul/点），这样能有效提升AAV

的感染效率和特异性。一般感染2周后进行后续检测。

AAV骨骼肌应用举例1

FIG38 不同血清型的AAV-Laz接种至小鼠腓肠肌4周后，取骨骼肌和脊髓组织检

测AAV，显示了对于骨骼肌，感染效率和亲和性排序为AAV1>AAV7>

AAV5>AAV2>AAV8；对于脊髓，AAV1和AAV2较为适合

Pirozzi, M., et al. J Clin Invest, 2006. 116(1): p. 202-8.

AAV血清型：AAV1/2/5/7/8

小鼠模型：C57BL/6小鼠(4周龄)

接种剂量：每只鼠接种总量为 10

11

GC的AAV(in 90ul)

接种方式：腓肠肌的3个位点，每个位点30ul

检测时间：接种后4周

检测操作： LacZ染色

AAV骨骼肌应用举例2

FIG39不同血清型的AAV肌肉接种至新生小狗4周后，取骨骼肌和心脏组织检测

AAV，显示了对于骨骼肌，AAV1突变体、AAV8、AAV9和AAV9突变体均可很好

地感染骨骼肌；对于心脏，AAV1突变体和AAV8较为适合

Duan, D. Hum Gene Ther Clin Dev, 2015. 26(1): p. 57-69.

AAV血清型：AAV1/6/8/9

小鼠模型：新生小狗 (2日龄, 金毛猎犬/小猎犬狗)

接种剂量：每狗1.6 × 10

11

vg particles(in 100ul)

接种方式：肌肉接种

检测时间：接种后4周

检测操作：组化染色

3.7 rAAV在肝脏中的应用

根据文献显示，AAV8和AAV9对肝脏的感染能力是最强的，AAV8优于AAV9，

AAV-DJ型则是感染肝脏的特异性更佳。肝脏血供丰富，因此通过最常用的尾静

脉注射的方式，即可使AAV有效感染肝脏组织细胞。通常的AAV单次接种体积

为50-100ul，滴度要求为10

12

v.g/ml，注射2周后进行后续检测。

rAAV肝脏应用举例

FIG40不同血清型的AAV-EGFP静脉接种至小鼠90天后，取肝脏组织检测AAV

的感染效率

Wang, L., et al. Mol Ther, 2010. 18(1): p. 118-25.

AAV血清型：AAV6/7/8等

小鼠模型：CB6F1 male小鼠(6–8周龄)

接种剂量：每只鼠1×10

11

GC

接种方式：静脉内注射

检测时间：接种后90天

检测操作：肝脏切片，荧光显微镜拍照

3.8 rAAV在肾脏中的应用

根据文献显示，AAV2和AAV9对肾脏的感染能力较好（AAV2优于AAV9），

由于肾脏组织血供不丰富，无法采用最简便的尾静脉注射来感染肾脏组织，需要

采取开腹腔的方式直接将AAV注射肾动脉、深静脉、肾实质或者肾盂中，以进

行肾脏组织的感染。AAV感染2周后即可进行后续检测。

rAAV肾脏应用举例1

FIG41 AAV2-GFP肾内接种至大鼠6周后，取肾脏组织检测AAV，显示了AAV2在

肾脏的肾小管上皮细胞（B，80倍放大；D，600倍放大）和髓质集合管的闰细

胞（C，80倍放大）中的分布情况

Chen, S., et al. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(4): p. 947-58.

AAV血清型：AAV2

小鼠模型：雄性Lewis大鼠(80-100g)

接种剂量：125 ul/100 g(滴度为1X10

10

IU/ml)

接种方式：肾内(左肾动脉)接种

检测时间：接种后6周

检测操作：免疫荧光

rAAV肾脏应用举例2

FIG42 AAV-GFP肾盂内接种至小鼠7-28天后，取肾脏组织检测AAV，显示了AAV

在肾脏的髓质（C，接种后7天；D，接种后14天）和皮髓质交界区（E，接种

后28天）中的分布情况

Ito, K., et al. BJU Int, 2008. 101(3): p. 376-81.

AAV血清型：AAV2?(文献里没写)

小鼠模型：雌性小鼠(20–25 g)

接种剂量：每只鼠 5X10

6

个感染性病毒颗粒 (in 100ul)

接种方式：肾盂内接种

检测时间：C:接种后7天，

D:接种后14天

E:接种后28天

检测操作：荧光显微镜拍照

3.9 rAAV在肺脏中的应用

rAAV肺脏应用举例1

FIG43 不同血清型的AAV-nLacZ鼻内或气管内接种至小鼠28天后，取肺脏组织

检测AAV，显示了AAV6、AAV1、rh.10、hu.48R3和rh.64R1均可较好地介导目

的蛋白在肺组织中的表达，AAV2 and hu.29R的效率则较差

Limberis, M.P., et al. Mol Ther, 2009. 17(2): p. 294-301.

AAV血清型：AAV1/2/5/6/7/8/9

小鼠模型： C57BL/6 小鼠 (6–8周龄)

接种剂量：每只鼠10

11

genome copies (in 50ul PBS)

接种方式：鼻内或气管内接种

检测时间：接种后28天

检测操作：组化检测

rAAV肺脏应用举例2

FIG44 不同血清型的AAV-GFP以高MOI感染HAE细胞7天后，检测AAV感染效

率，显示了感染效率高的AAV为：AAV6、hu.13、hu.37、rh.2R、rh.10、rh.64R1

和rh.8；感染效率中等的为AAV1、hu.48R3、hu.51、hu.29R、rh.39、rh.20、rh.46、

rh.64R2、rh.43和rh.32.33；感染效率低的为hu.11、cy.5R4、pi.2和AAV9；感染

效率极低的为AAV2、7、 8、hu.32和AAV5

Limberis, M.P., et al. Mol Ther, 2009. 17(2): p. 294-301.

AAV血清型：AAV1/2/5/6/7/8/9等

细胞模型：人气道纤毛上皮细胞 (HAE)

感染剂量： 10

11

genome copies,MOI=200,000(in 100ul PBS)

检测时间：感染后7天

检测操作： 共聚焦荧光显微镜拍照

3.10 rAAV在肠道中的应用

报道显示，AAV8，AAV9和AAV10型对肠道组织的感染能力比较好。由于肠

道组织血供偏弱、肠道壁太薄等特点，肠道组织的感染不能采用常用的尾静脉注

射或者原点注射等方式。肠道组织主要通过直接灌肠或肠系膜上动脉内注射等方

式。肠道组织可接受的注射体积较大一些，因此AAV滴度不必太高，AAV感染2

周后即可进行后续检测。

rAAV肠道应用举例

FIG45不同血清型的AAV-GFP肠内接种至小鼠8周后，取肠组织检测AAV，显示

了AAV8、9和10均可较好地感染肠道组织

Polyak, S., et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012. 302(3): p. G296-308.

AAV血清型：AAV8/9/10

小鼠模型：雄性BALB/cJ 小鼠(6-8周龄 )

接种剂量：每只鼠5X10

10

physical particles(in 1ml PBS)

接种方式：接种于近肠端

检测时间：接种后8周

检测操作：免疫荧光

3.11 rAAV在血管中的应用

在文献显示， AAV1和AAV5型对血管组织的感染能力比较好。血管环组织

体外培养后可直接进行AAV感染。体内血管感染，则需要将在体动脉/静脉血管

暴露出来并结扎血管后，再将AAV注射进入血管组织感染，具体感染时间视感

染部位而定，在保证小鼠存活的情况下感染时间越长越好。血管组织对AAV滴

度要求比较高，至少10

12

v.g/ml以上，且AAV感染2周后可进行后续检测。

rAAV血管应用举例

FIG46不同血清型的AAV-β-gal和AAV-GFP感染HAEC细胞72小时后，检测结果

显示了AAV5比AAV2感染效率更高

Chen, S., et al. Hum Gene Ther, 2005. 16(2): p. 235-47.

AAV血清型：AAV2/5

A-C,H:AAV5

D-F,G:AAV2

细胞模型：人主动脉内皮细胞(HAEC)

感染剂量：MOI=10-100000

检测时间：感染后72小时

检测操作：免疫荧光

3.12 rAAV在干扰中的应用

AAV干扰载体应用举例1

FIG47 AAV8-GFP-shRNA定位注射至小鼠的PFC2周后，可在PFC区域检测到GFP

荧光蛋白，且也能高效率地达到干扰目的

Cao, X., et al. Nat Med, 2013. 19(6): p. 773-7.

AAV血清型：AAV8

小鼠模型：雄性C57BL/6J 小鼠(10-12周龄 )

接种剂量：每只鼠2-3X10

9

infectious unit(in 1ul PBS,0.1ul/min)

接种方式：定位注射，接种于前额皮质(PFC)

检测时间：接种后2周

检测操作：免疫荧光

AAV干扰载体应用举例2

FIG48 AAV2-GFP-shRNA定位注射至大鼠的纹状体2周后，可在纹状体的冠状面

检测到GFP荧光蛋白，且也能高效率地干扰多巴胺受体

Yang, C., et al. PLoS One, 2013. 8(6): p. e64637.

AAV血清型：AAV2

小鼠模型：雄性SD大鼠(270-310g )

接种剂量：每只鼠2-4X10

10

vector genomes(in 4ul PBS,0.1ul/min)

接种方式：定位注射，接种于两侧的纹状体

检测时间：接种后2周

检测操作：免疫荧光

附：上海生博AAV现货表格

AAV

类型

对外编号

SV01

基因

pAAV-hSyn-Cre-GFP

备注

SV02

SV03

SV04

SV05

pAAV-hSyn-Cre-T2A-mCherry

hSyn

神经元细胞特异性

表达启动子

GFAP(S)

星形胶质细胞

特异性表达启动子

GFAP(L)

星形胶质细胞

特异性表达，特异性更好

mCaMKIIa

兴奋性神经

元细胞特异性表达启动

子

Cre现

货

pAAV-GFAP(S)-EGFP-T2A-Cre

pAAV-GFAP(L)-Cre

pAAV-GFAP(L)-Cre

SV06 pAAV-mCaMKIIa-GFP-Cre

SV07

SV08

SV09

SV10

SV11

SV12

SV13

SV14

SV15

SV16

SV17

SV18

pAAV-CAG-ChR2-GFP

CAG

广泛表达强启动子

pAAV-CAG-hCHR2-H134R-tdtomato

pAAV-CAG-DIO-ChR2-mCherry

pAAV-CAG-DIO-ChR2-EGFP

CAG

广泛表达的启动

子，含

DIO

序列

pAAV-CAG-DIO-ChETA-mCherry

光遗

传激

活病

毒

pAAV-EF1α-hChR2

(

H134R)-EGFP

pAAV-EF1

α

-DIO

-

hChR2

（

H134R

）

-EYFP

pAAV-EF1α-DIO-ChR2-GFP

EF1α

广泛表达强启动子

nEF

启动子

,Cre

或者

Flp

开启表达

pAAV-EF1α(L)-DIO-hChR2

（

H134R

）

-mCherry

pAAV-nEF-Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP

pAAV-CaMKIIa-Loxp-ChR2-mCherry-Lox

pAAV-mCaMKIIa-hChR2(H134R)-mCherry

CRE依

赖的

病毒

SV19

SV20

SV21

SV22

SV23

SV24

SV25

SV26

SV27

SV28

SV29

SV30

SV31

SV32

SV33

SV34

SV35

SV36

SV37

SV38

pAAV-mCaMKIIa-hChR2(H134R)-EGFP

pAAV- CaMKIIa-NPHR-EGFP

mCaMKIIa

兴奋性神经

元细胞特异性表达启动

子

pAAV-CaMKIIa-hChR2

(

H134R)-EYFP

CMV

广泛表达的强启动

pAAV-CMV-DIO-hChR2( H134R)-EYFP

子（不适合神经元细胞）

pAAV-CAG-DIO-CDG-rev-RFP

CAG

广泛表达强启动子

pAAV-CAG-DIO-DTR-mCherry

pAAV-EF1α-DIO-GFP

EF1α

广泛表达强启动子

pAAV-EF1α-DIO-mCherry

pAAV-EF1α-DIO-EYFP

pAAV-EF1α(L)-DIO-mCherry

pAAV-Ef1α-doubleDIO-EYFP

pAAV-CMV-fDIO-EGFP

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

pAAV-EF1α-gene-T2A-EGFP

pAAV-EF1α-IRES-tdtomato

EF1α

广泛表达强启动子

pAAV-EF1α-bGlobin-IRES-tdtomato

pAAV-EF1α (L)-IRES

-

tdtomato

pAAV-CMV-bGlobin-GFP

荧光

示踪

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

pAAV-CMV-bGlobin-IRES-tdtomato

pAAV-CAG-tdtomato

pAAV-CAG-tdtomato

CAG

广泛表达强启动子

光遗

传抑

制病

毒

SV39

SV40

SV41

SV42

SV43

SV44

SV45

SV46

SV47

SV48

SV49

SV50

SV51

SV52

SV53

SV54

SV55

SV56

SV57

SV58

pAAV-CAG-EGFP

rNESTIN

神经干细胞特

异启动子

rNSE

神经元特异性启动

子

pAAV-rNESTIN-T2A-GFP

pAAV-rNSE-T2A-RFP

pAAV-rNSE-T2A-GFP

pAAV-CaMKII-EYFP

mCaMKIIa

兴奋性神经

元细胞特异性表达启动

子

pAAV-CaMKIIa-mCherry

pAAV-mCaMKIIa-GFP

pAAV-mCaMKIIa-T2A-GFP

pAAV-mCaMKIIa-T2A-RFP

pAAV-rSyn-T2A-RFP

pAAV-GFAP-GFP

rSyn

神经元细胞特异性

表达启动子

GFAP

星形胶质细胞特

异性表达启动子

pAAV-EF1α-DIO-eArch3.0

-

EYFP

pAAV-EF1α(L)-DIO-eArch3.0-mCherry

pAAV-EF1α-DIO-eArch3.0-GFP

EF1α

广泛表达强启动子

mCaMKIIa

兴奋性神经

元细胞特异性表达启动

子

hSyn

神经元细胞特异性

表达启动子

pAAV-CaMKIIa-eNpHR3.0-EYFP

pAAV-mCaMKIIa-Arch-EGFP

pAAV-hSyn-Arch-EGFP

pAAV-CMV-DIO-eArch3.0-mCherry

pAAV-CAG-DIO-Arch-EGFP

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

CAG

广泛表达强启动子

hSyn

神经元细胞特异性

表达启动子

药理

学

pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry

干扰

SV59

SV60

SV61

SV62

SV63

SV64

SV65

SV66

SV67

SV68

pAAV-hSyn-DIO-hM4Di-mCherry

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

pAAV -CMV-DIO-hM4Di-mcherry

pAAV-CMV-DIO-hM3Dq-EYFP

pAAV-CMV-DIO-hM3Dq-mcherry

pAAV-GFAP-hM4DI-EGFP

pAAV-GFAP-hM3Dq-EGFP

GFAP

星形胶质细胞特

异性表达启动子

EF1α

广泛表达强启动子

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

pAAV-EF1α-DIO-hM4Di-mcherry

pAAV-CMV-EGFP-mir30arm-shRNA

pAAV-CAG-DIO-mCherry-mir30arm-shRN

CAG

广泛表达强启动子

A

pAAV-CMV-Gcamp5G-3Flag

SV69

SV70

SV71

pAAV-CMV-Gcamp6F

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

pAAV-CMV-Gcamp6F-3Flag

pAAV-CMV-Gcamp6M-3Flag

钙信

号

SV72

SV73

SV74

pAAV-CMV-Gcamp6S-3Flag

pAAV-EF1α-DIO-Gcamp5G

EF1α

广泛表达强启动子

pAAV-EF1α-DIO-Gcamp6F-P2A-NLS-tdTo

mato

SV75

SV76

pAAV-hSyn-Gcamp6F

pAAV-hSyn-Gcamp6S

hSyn

神经元细胞特异性

表达启动子

rescue

SV77 pAAV-hSyn-Gcamp6G

CAG

广泛表达强启动子

CaMKIIa

兴奋性神经元

细胞特异性表达启动子

SV78

SV79

SV80

SV81

SV82

SV83

SV84

SV85

SV86

4733

4736

5453

4736

033-01

033-01

033-01

032-04

pAAV-CAG-Flex-Gcamp6S

pAAV-CaMKIIa-Gcamp5G

pAAV-U6-shRNA-CMV-gene-T2A-EGFP

pAAV-U6-shRNA-EF1α-gene-T2A-EGFP

U6

广泛表达启动子

,

目的

基因为广泛表达强启动

子

pAAV-U6-shRNA-EF1α-gene-T2A-mCherry

pAAV-U6-shRNA-EF1α-gene-mCherry

pAAV-CAG-fDIO-GFP-Cre

CAG

广泛表达强启动

子，

Flp

依赖性

其他

pAAV-CMV-Loxp-mCherry-Loxp

pAAV-CMV-Loxp-ChR2-mCherry-Loxp

PAAV-CMV-mCherry-wpres

PAAV-CMV-mRuby2-wpres

PAAV-CMV-dtumto-wpres

PAAV-CMV-tagRFP-wpres

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）。

CMV

广泛表达强启动子

（不适合神经元细胞）

生博自

研

PLVX-camk2-CIVI-TS-mCherry-EF1

α

PLVX-camk2-CIVI-TS-mCherry-VPRES

PLVX-camk2-DIO-CIVI-TS-mCherry-

PAAV-CAG-DIO-Dcf1(Tmem59)-Linker-