中国恒河猴Macaca mulatta外周血Th17细胞及其在SHIV感染后的变化

ISSN1007-8738

细胞与分子免疫学杂志

(

ChinJCellMolImmunol

)

2008,24

(

3

)

217

论著文章编号:1007-8738

(

2008

)

03-0217-04

中国恒河猴

(

Macacamulatta

)

外周血

Th17

细胞及其在

SHIV

感染后的变化

邱趁丽,赵　辉,杨贵波

3

(

中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室

,

北京

100050)

Th17lymphocytesintheperipheralblood

ofChineserhesusmacaques(

Macaca

mulatta

)withorwithoutSHIVinfection

QIUChen

2

li,ZHAOHui,YANGGui

2

bo

3

NationalCenterforAIDS/STDControlandPrevention,StateKey

LaboratoryforInfectionDiseasePreventionandControl,Beijing

100050,China

[Abstract]　

AIM:ToobserveCD4

+

IL

2

17

+

cellsinthe

S:

Peripheralbloodsampleswerecollectedfromnormaland

eCD3,CD4,CD8

andintracellularIL

2

17Aexpressionofperipheralblood

(

with

orwithoutPMA+Ionomycinstimulation)weredetectedby

mimunostainingwithfluorochromelabeledmonoclonalanti

2

pleswereacquiredwithFACScaliburand

S:IL

2

17A

+

cellswereobservedinallthe6normalrhesusmacaquesbut

therewereveryfewbeforeculturedwithPMA+Ionomycin.

About1.4%oflymphocyteswereIL

2

17A

+

cellsafterstimula

2

tionandshort

2

termcultivation,andabout2.7%ofCD3

+

CD4

+

lymphocyteswereLI

2

17A

+

cells,4

+

Th17

17cellsinthe4SHIVinfectedrhesusmonkeys

beroftheTh17cellsdetected

afterstimulationandshort

2

termcultivationwasnotsignifi

2

S

ION:Similartohumanrace,Chineserhesusmacaques

possessasubsetofCD4

+

LI

2

17A

+

cells,suggestingthese

rhesusmonkeycanbeusedtostudytherelationshipbe

2

wteenTh17cellsandHIV/AIDS.

[Keywords]Chineserhesusmacaque;PBMC;LI

2

17A

+

cell;CD4

+

Th17cell;SHIVinfection

[

摘要

]

　目的

:

对正常中国恒河猴

(

Macacamulatta

)

及嵌合

猿猴

/

人免疫缺陷病毒

(

SHIV

)

感染过的中国恒河猴外周血中

收稿日期

:2007-11-05;

　接受日期

:2007-12-17

基金项目

:

国家自然科学基金资助项目

(

30571750

)

;

盖茨基金资助项目

(

38608

)

作者简介

:

邱趁丽

(

1980-

)

,

女

,

河南许昌人

,

在读硕士

Tel:010

2

83158751;E

2

mail:qiuchenli@

3

Correspondingauthor,E

2

mail:guibyang@

CD4

+

LI

2

17A

+

和

CD4

-

IL

2

17A

+

T

淋巴细胞的分布频率进行初

步观察。方法

:

用荧光染料标记的单克隆抗体

(mAb)

对

10

只

中国恒河猴的外周血或

PMA+Ionomycin

刺激后的

PBMC

细

胞表面的

CD3

、

CD4

、

CD8

及细胞内

IL

2

17A

进行免疫荧光染

色。用

FACScalibaur

获取染色后的样品

,

所得数据用

CellQuest

进行分析。结果

:

在

6

只正常中国恒河猴个体中均

能检测到

IL

2

17A

+

淋巴细胞

,

未经刺激培养的样品中

IL

2

17A

+

细胞频率很低

,

但在短期刺激培养后淋巴细胞中具有约

1

1

4%

的淋巴细胞为

IL

2

17A

+

细胞

,

明显多于刺激前的

IL

2

17A

+

淋巴细胞

;

在短期刺激培养后

CD3

+

CD4

+

淋巴细胞中大约有

2

1

7%

的

IL

2

17A

+

细胞或

CD4

+

Th17

细胞。对

4

只

SHIV

感染

个体中

Th17

细胞的初步分析未发现它们与正常个体间的统

计学差异。结论

:

与人类相似

,

中国恒河猴的外周血中也存

在一定比例的

Th17

细胞

,

为进一步利用恒河猴

AIDS

动物模

型分析

HIV/AIDS

与

Th17

细胞的关系提供了基础。

[

关键词

]

中国恒河猴

;

外周血单个核细胞

;IL

2

17A

+

细胞

;

CD4

+

Th17;

猿猴

/

人免疫缺陷病毒感染

[

中图分类号

]R392.12

[

文献标识码

]A

　　在对鼠类实验动物的研究中发现,鼠类动物未

接触抗原的CD4

+

T淋巴细胞在抗原激活后能够分化

产生不同表型和功能的辅助性T淋巴细胞。CD4

+

辅

助性T淋巴细胞

(

T2helper,Th

)

因表达不同种类的

细胞因子而被人为地分成了多个不同的细胞亚

群

[1,2]

,其中研究最多的是Th1和Th2这2个细胞亚

群,前者表达IFN

γ

2和TNF

α

2等细胞因子,主要与清

除细胞内病原体的细胞免疫应答密切相关;而后者

主要表达IL24、IL25和IL213等细胞因子,是清除细

胞外病原体的体液免疫应答所必需的辅助性T淋巴

细胞。近年来一系列的研究表明CD4

+

T淋巴细胞中

还存在另外一个亚群的辅助性T淋巴细胞,它们表

达白细胞介素17(IL217),称为Th17,是与Th1和

Th2都明显不同的淋巴细胞亚群,主要在诱导自身免

疫性组织损伤中发挥作用

[1-3]

。这些功能正好与

CD4

+

CD25

+

调节性T淋巴细胞的功能相反,后者主

要具有抑制自身免疫反应及组织损伤的作用

[4]

。虽

然大多数研究表明Th17主要与自身免疫性疾病和炎

性疾病,如类风湿性关节炎、哮喘和实验性自身免疫

脑脊髓炎等的病理发生密切相关,但已有研究表明

218

ISSN1007-8738

细胞与分子免疫学杂志

(

ChinJCellMolImmunol

)

2008,24

(

3

)

Th17细胞也在感染免疫中具有一定的作用

[5]

。人体

免疫系统具有与小鼠类似的辅助性T淋巴细胞亚群,

包括Th1、Th2和Th17细胞

[6]

。Maek等

[7]

在对40

名未经治疗无症状的HIV21感染者外周血Th17细胞

的研究中发现HIV21感染者具有较多的Th17细胞,

表明这些细胞可能与艾滋病的病理过程相关,但具

体作用尚不清楚,需深入研究。恒河猴(

Macacamu

2

latta

)

是艾滋病研究的首选实验动物之一,已经在艾

滋病病理、药物和疫苗研究中广泛使用,可能会在

HIV21感染与Th17细胞相互关系的实验研究中发挥

作用。虽然已有关于恒河猴血液中细胞因子IL217

的报道

[8]

,但尚未见关于恒河猴Th17细胞的研究报

道。虽然中国恒河猴越来越多地被用于生物医学研

究,且与印度来源的恒河猴对感染和疫苗免疫的免

疫应答存在明显差异

[9]

,然而对其免疫学背景的研

究却远远落后于对印度恒河猴的研究

[10]

。我们利用

流式细胞术(FCM)对正常中国恒河猴的外周血中的

Th17细胞及其他IL217分泌细胞进行了分析,并对4

只SHIV感染过的恒河猴中Th17细胞进行了初步观

察,为利用中国恒河猴探讨Th17细胞在HIV/AIDS

病理过程中的作用提供基础。

1　材料和方法

1.1

　材料　静脉血样品分别来自

6

只正常中国恒河猴和

4

只

SHIV

感染过的中国恒河猴

(

其中

2

只

(Mm#419,Mm#424)

在

SHIV

2

KB9

感染后被

SHIV

2

KB9

再次感染

,

另

2

只

(

Mm#

427,Mm#428)

在

SHIV

2

CN97001

感染后被

SHIV

2

KB9

再次感

染

)

。每只动物采集约

5mL

外周血液于

EDTA

抗凝管中并在

4h

内运至实验室。利用自动血球计数仪

MEK

2

5216K(Nihon

Kohden,Japan

)

对每份样品进行血细胞分类计数。除留下部

分全血供表面标志和刺激前胞内

IL

2

17FCM

分析外

,

其余全

血用于

PBMC

的分离。荧光标记单克隆抗体

(

mAb

)

包括

CD3

2

PerCP(cloneSP34

2

2)

、

CD4

2

APC(cloneL200)

、

CD8

2

FITC

(

cloneRPA

2

T8

)

和四色流式细胞仪

FACScalibur

均购自

BD

公司。

LI

2

17

细胞内染色用

mAb

为

IL

2

17A

2

PE

购自

eBiocience

公司。

RPMI1640

完全培养基购自

Hyclone

公司。

1.2

　方法

1.2.1

PBMC

分离与培养　将外周血稀释

2

倍置于

Ficoll

2

PaquePlus

淋巴细胞分层液

(

AmershamBiosciences,Sweden

)

上

,

离心

30min,

收集淋巴细胞

,

用

PBS

洗

2

次后悬浮于

RPMI1640

完全培养液中。对细胞进行计数后将悬浮在含

100mL/LFCS

的

RPMI1640

完全培养液中的细胞密度调节为

1

×

10

10

/L

。在无菌

U

形底

96

孔板中加入适量的

PI

(

PMA+

Ionomycin)

刺激剂

,

然后加入

50

μ

L

上述准备好的

PBMC(5

×

10

5

/

孔

)

,

于培养箱中

37

℃、

50mL/LCO

2

培养

1h

后加入

BFA

继续培养约

10h

。

1.2.2

　流式染色　染色由表面标志染色和细胞内

IL

2

17A

染

色两部分组成。表面标志染色参照作者以前的方法进行

[10]

,

主要步骤为

:

将

100

μ

L

全血加入流式染色管

,

然后加入荧光

标记抗体

CD3

、

CD4

和

CD8

室温避光孵育

30min;

用红细胞

裂解液裂解红细胞后用

A

液

(

10g/L

多聚甲醛

)

处理

10min,

再用

B

液

(

10g/L

皂苷

)

处理

10min;

加

IL

2

17A

抗体避光染

色

30min,

洗去多余抗体后上机获取细胞。对经刺激后的

PBMC

的染色在

96

孔板上进行

,

在

CD3

、

CD4

和

CD8

染色后

直接进行细胞内染色

,

随后的步骤与全血中对应步骤相似。

1.2.3

FCM

检测　样品染色结束后

1h

内用四色流式细胞

仪

FACScalibur

获取细胞

,

每个样品收集

10

万个淋巴细胞

,

所得数据用

CellQuest

进行各种细胞亚群大小的分析。

1.2.4

　统计学分析　对淋巴细胞、

CD3

+

T

淋巴细胞及

CD3

+

CD4

+

T

淋巴细胞中

IL

2

17A

+

细胞所占比例的平均数进行计

算

,

对感染个体与正常个体间的差异进行方差分析。

2　结果

使用荧光标记

mAb

细胞内染色和多色

FCM

对

6

只正常

和

4

只

SHIV

感染中国恒河猴个体外周血中

IL

2

17

分泌细胞及

其表面

CD3

、

CD4

和

CD8

表达进行比较分析

,

发现

IL

2

17

+

细

胞不仅分布于

CD4

+

T

淋巴细胞亚群中

,

也存在于

CD4

-

T

淋

巴细胞亚群中

;

部分

IL

2

17

+

细胞为

CD3

-

淋巴细胞

,

有可能是

B

淋巴细胞或

NK

细胞

(

图

1

)

。

图

1

　中国恒河猴外周血中

CD3

+

CD4

+

IL

2

17A

+

淋巴细胞的分布

Fig1

DistributionofCD3

+

CD4

+

IL

2

17A

+

cellsintheperipheral

bloodofChineserhesusmacaques

FCMdotplots(fromthelefttotheright)showingCD3

+

andCD3

-

LI

2

17A

+

lymphocytes,CD4

+

andCD4

-

IL

2

17

+

lymphocytesandCD4

+

and

CD4

-

Tlymphocytes;firstrow,cellswereunstimualated,secondrow,

cellswerestimulatedwithPMAandIonomycin.

2.1

　正常中国恒河猴外周血中

IL

2

17A

+

细胞在各淋巴细胞

亚群中的分布频率　在

6

只正常恒河猴的外周血单个核细胞

(PBMC)

中

IL

2

17A

+

淋巴细胞的数量很少

(

表

1)

。但在用淋巴

细胞增殖刺激剂进行短时间刺激培养后

,

在每个个体中都能

够检测到明显的一个

IL

2

17A

+

细胞亚群

(

图

1

下排

)

。由于刺

激前检测出的阳性细胞太少

,

很难对个体间的差异进行可信

的比较分析。

ISSN1007-8738

细胞与分子免疫学杂志

(

ChinJCellMolImmunol

)

2008,24

(

3

)

219

表

1

　正常中国恒河猴个体中

IL

2

17A

分泌细胞的百分比

Tab1

PercentageofIL

2

17AsecretingcellsinlymphocytesofChineserhesusmacaques

Animal

No.

Mm#1

Sample

date

d00

d05

d15

Mm#2d00

d05

d15

d08

d27

Mm#4

Mm#5

Mm#6

d15

d08

d27

L

2

I17A

Notstimulated

0.06

0.07

0.01

0.04

0.03

0.01

0.04

0.06

0.03

0.02

0.19

+

(

%

)

Th17cells

Notstimulated

0.01

0.00

0.00

0.01

0.00

0.00

0.00

0.01

0.00

0.00

0.02

Stimulated

3.43

2.40

1.95

4.13

3.84

1.06

4.49

2.50

2.17

2.30

1.80

lymphocyte

Stimulated

1.87

1.49

0.72

2.19

2.18

0.51

1.76

1.01

1.07

1.18

1.08

L

2

I17A

+

Tlymphocyte

Notstimulated

0.01

0.00

3

0.00

0.01

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.02

Stimulated

2.85

2.31

1.54

3.86

3.67

0.75

2.57

1.44

1.61

1.69

1.30

Mm#3

3

Indicatethepercentageis<0.00%.

　　经过短期刺激培养后

,

在大部分来自正常个体的淋巴细

胞中均可检测到约

1

1

4%

的细胞为

IL

2

17A

细胞

;CD3

淋巴

细胞中可检测到约212%的细胞为IL217A细胞;CD3CD4

+++

++

细胞中的多数为

CD3

+

细胞

,

而

IL

2

17A

+

的

CD3

+

细胞中多数

为

CD4

细胞。

2.2　外周血IL217分泌细胞在SHIV感染个体中的分布　在

+

淋巴细胞中可检测到约

2

1

7%

的细胞为

IL

2

17A

+

细胞

,

即与人

类和小鼠中对应的

Th17

细胞。这些细胞所占比例在不同个

体间及同一个体不同样品间均存在差异。通常

IL

2

17A

淋巴

表

2

SHIV

感染个体中

IL

2

17A

分泌细胞的百分比

+

所有

SHIV

感染个体的外周血单个核细胞中都能检测到

IL

2

17A

+

细胞

(

表

2)

。与正常个体相似

,

未经过刺激的

PBMC

中具有

很少的

IL

2

17A

细胞

,

难于在个体间进行可信的比较分析。

(%)

Th17cells

Notstimulated

0.008

0.008

0.008

0.008

0.003

±

0.000

Stimulated

3.945

1.955

2.395

3.933

3.057

±

1.034

+

Tab2

PercentageofIL

2

17AsecretingcellsinlymphocytesofSHIVinfectedChineserhesusmacaques

Animal

No.

Mm#419

Mm#424

Mm#427

Mm#428

MeanS.D.

IL

2

17A

Notstimulated

0.045

0.038

0.055

0.080

0.054

±

0.019

+

lymphocyte

Stimulated

1.640

0.628

1.600

2.015

1.471

±

0.592

L

2

I17A

Notstimulated

0.003

0.013

0.008

0.008

0.008

±

0.004

+

Tlymphocyte

Stimulated

2.490

1.265

1.963

2.565

2.071

±

0.600

　　经过短期刺激培养后

,

在大部分来自

SHIV

感染个体的淋

巴细胞中均可检测到约

1

1

5%

的细胞为

IL

2

17A

+

细胞

;CD3

+

淋巴细胞中可检测到约

2%

的细胞为

IL

2

17A

细胞

;CD3

++

++

巴细胞的比例与未感染的正常个体的无统计学意义

(

P>0

1

05,

图

2)

。然而

2

只

SHIV

2

CN97001

感染个体

(Mm#427,Mm#428)

在

SHIV

2

KB9

再次感染后

,

其

PBMC

中

IL

2

17A

+

淋巴细胞的比

例略微高于正常个体

PBMC

中

IL

2

17A

淋巴细胞的比例。与

之相反

,

另

2

只

SHIV

2

KB9

感染个体

(

Mm#419,Mm#424

)

在

SHIV

2

KB9

再次感染后

,

其

PBMC

中

IL

2

17A

+

淋巴细胞的比例

+

CD4

细胞中可检测到约

3%

的细胞为

IL

2

17A

细胞。与正常

个体相似

,

这些细胞所占比例在不同个体间及同一个体不同

样品间均存在差异。

2.3

SHIV

感染对

IL

2

17

分泌细胞亚群大小的影响　由于未略微低于正常个体

PBMC

中

IL

2

17A

淋巴细胞的比例。在经

SHIV

2

KB9

再次感染的

SHIV

2

CN97001

感染个体与再次感染的

SHIV

2

KB9

感染个体之间

,

在

IL

2

17A

+

淋巴细胞所占比例上

+

经刺激的

PBMC

中可检测出的

IL

2

17A

细胞数很少

,

难以进

行可信的定量比较

,

因此仅对经短期刺激培养后的

IL

2

17A

+

细胞进行了比较。对短时间刺激后

IL

2

17A

+

细胞比例的比较

分析发现

SHIV

感染个体

PBMC

中

IL

2

17A

淋巴细胞占所有淋

+

+

具有统计学意义

(P<0

1

05)

。

图

2

SHIV

感染与正常中国恒河猴外周血中

IL

2

17A

+

细胞的比较

Fig2

ComparisonofIL

2

17A

+

cellsbetweennormalandSHIVinfectedChineserhesusmonkeys

220

ISSN1007-8738

细胞与分子免疫学杂志

(

ChinJCellMolImmunol

)

2008,24

(

3

)

3　讨论

IL217最初命名为CTLA28,1993年首次从鼠cDNA

库中克隆出来。许多研究报道中IL217通常指IL217A

(

我们亦如此采用

)

,属于由IL217A、B、C、D、E、F

组成的IL217家族的一员。已知有多种细胞都能产

生IL217,包括单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细

胞、T

γδ

细胞、CD8+记忆T细胞和CD4+记忆T细

胞。目前普遍认为IL217的主要功能是作为一个前炎

性介质在局部诱导IL26,NO和前列腺素E

2

(

PGE

2

)

等放大局部炎症,在类风湿性关节炎、移植排斥和系

统性红斑狼疮等病理过程中起作用

[11]

。虽然对鼠和

人的IL217及其与疾病的关系有着丰富的研究,但对

广泛用于人类疾病研究的恒河猴中LI217的研究较

少

[8]

,未见关于中国恒河猴PBMC中IL217分泌细胞

的报道。利用细胞内细胞因子染色和

FCMS

分析

,

我

们发现中国恒河猴的外周血淋巴细胞中存在约114%

的IL217A

+

细胞,其中多数为CD4

+

T淋巴细胞,即

Th17细胞。已知在未经刺激的人PBMC中Th17细

胞约占CD3

+

细胞的0112%,在刺激后的PBMC中约

占CD4

+

细胞的0165%。在中国恒河猴中,未刺激前

能检测到的IL217A

+

细胞较少,在短期刺激培养后能

检测到的IL217A

+

细胞明显增多,且较人体中观察到

的阳性率高,可能与各自实验中刺激培养时间不相

同等因素有关。

作为与Th1、Th2等辅助性T淋巴细胞相对独立

的细胞亚群,Th17细胞除在自身免疫性和炎性疾病

中起作用外也可能与肿瘤和感染免疫相关

[5]

。在

Helicobacterpylori

和

Bacteroidesfragilis

感染中IL217

水平明显升高。迄今对Th17细胞在HIV21感染中的

作用的研究虽然仅有很少的报道,但已发现在HIV21

感染者中IL217A

+

细胞存在上升的趋势

[7]

,与其他感

染中观察到的现象有相似之处。SIV和SHIV感染恒

河猴是艾滋病病理、药物和疫苗等多种研究的首

选动物模型,我们对4只SHIV感染动物PBMC中

IL217A

+

细胞的FCM分析发现与正常个体相比,感

染个体中的Th17细胞亚群大小并无明显变化。但无

论在正常个体还是在感染个体之间都观察到了较大

的个体差异。由于本次实验中动物较少,尚需扩大

动物数量进行更细致的比较研究。

与Th17细胞的功能,如介导炎性反应和自身免

疫疾病相反,调节性T淋巴细胞

(

Treg

)

具有抗炎性

反应和维持自身免疫耐受的功能

[4]

。因此,二者的

动态平衡可能与适当的免疫应答密切相关。中国恒

河猴的外周血中具有与人类外周血中相似比例的

CD4

+

CD25

+

调节性T淋巴细胞

[10]

,我们又进一步确

定中国恒河猴中具有一定比例的Th17细胞,为研究

这2个细胞亚群在免疫应答过程中的动态平衡及其

与人类疾病的关系提供了基础。越来越多的研究表

明Treg与Th17都在感染免疫中起作用

[12,13]

,尽管

本研究尚不能确定SHIV感染对Th17细胞亚群的影

响,但观察到经SHIV2KB9再次感染的SHIV2CN97001

感染个体比再次感染的SHIV2KB9感染个体具有明

显较多的IL217A

+

淋巴细胞,为进一步的探讨提供了

基础。

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赵　辉

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+

CD25

+

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