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2024年6月29日发(作者：apachetomcat服务启动不了)

山东农业科学２０１１，１１：５～８　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　

山东桑萎缩植原体ｓｅｃＹ基因序列分析　

公娇芬，陈　妮，陈小飞，景茂峰，竺晓平　

（山东农业大学植物保护学院植物病理系，山东泰安２７１０１８）　

摘要：对采自山东宁阳的表现萎缩症状的桑树植株总ＤＮＡ进行ｓｅｃＹ基因ＰＣＲ扩增，得到约１．４　ｋｂ的　

特异片段，将该片段克隆后进行序列测定，结果表明，该片段长１　３６１　ｂｐ，包含ｓｅｃＹ基因１　２４２　ｂｐ，编码４１４个　

氨基酸。通过：陶建系统进化树、同源性比对及利用９种限制性内切酶进行模拟ＲＦＬＰ分析，初步确定该分离　

物属于ｓｅｃＹＩ—Ｂ亚组，在亚组水平上进一步明确了桑萎缩植原体的分类地位。　

关键词：桑萎缩植原体；ｓｅｃＹ基因；序列分析　

中图分类号：Ｑ７８６　文献标识号：Ａ　文章编号：１００１－４９４２（２０１１）１１－０００５－０４　

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｃ　Ｙ　Ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｍｕｌｂｅｒｒｙ　Ｄｗａｒｆ　Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ　

ｉｎ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　

ＧＯＮＧ　Ｊｉａｏ—ｆｅｎ，ＣＨＥＮ　Ｎｉ，ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏ—ｆｅｉ，ＪＩＮＧ　Ｍａｏ—ｆｅｎｇ，ＺＨＵ　Ｘｉａｏ—ｐｉｎｇ　

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉａｎ　２７１０１８，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ａ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｂｏｕｔ　１．４　ｋｂ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｍｕｌｂｅｒｒｙ　ｐｌａｎｔ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｄｗａｒｆ　

ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ　ｆｒｏｍ　Ｎｉｎｇｙａｎｇ　ｉｎ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　１　３６１　ｂｐ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１　２４２　ｂｐ　ｏｆ　ｓｅｃＹ　

ｇｅｎｅ　ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｄ　４１４　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ＭＤ—ＮＹ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　

ａｎｄ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｓｉｍｕｌａｔｅｄ　ＲＦＬＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｎｉｎｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＭＤ—ＮＹ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｓｅｃＹ　Ｉ—Ｂ　ｓｕｂ—　

ｇｒｏｕｐ・　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｍｕｌｂｅｒｒｙ　ｄｗａｒｆ　ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ；ｓｅｃＹ　ｇｅｎｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　

桑树萎缩病主要发生于中国、１３本、韩国等亚　

等　４７］。２００６年，Ｌｅｅ等　在翠菊黄化植原体组　

洲地区的蚕桑生产国，在中国和日本蚕区的危害　

（ＡＹ　ｇｒｏｕｐ）内划分出ｌ０个独立的进化枝。　

最为严重，特别是在中国的江苏、浙江、山东等主　我国对桑萎缩植原体的研究，主要是基于　

要蚕区，该病的暴发常对蚕桑生产造成毁灭性的　

１６Ｓ　ｒＲＮＡ序列的分析，如夏志松等（２００４）　对　

危害，并且病害的防控极为困难　ｌ２　Ｊ。　

江苏省桑黄化型萎缩病植原体１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序　

植原体（ｐｈ）ｒｔｏｐｌａｓｍａ）是一种无细胞壁的原　

列与日本的序列进行了分析比较；刘清神等　

核生物，一直无法进行人工培养，可通过嫁接和取　

（２００６）　对广州桑萎缩病植原体进行检测时确　

食韧皮部的昆虫传播，感染植原体植株表现黄化、　

定所检测的桑树植原体属于１６Ｓｒ　Ｉ组；刘永光等　

变叶和丛枝等症状。１６Ｓ　ｒＲＮＡ是用于植原体分　

（２００９）　对山东蚕区桑萎缩植原体进行分子鉴　

类的首选标记，但其高度保守，不利于亲缘关系较　

定，属于１６Ｓｒ　Ｉ—Ｂ、ｔｕｆ　Ｉ—Ｂ和　Ｉ—Ｂ亚组。　

近的亚组的划分，因此一些变异较大的保守基因　

本研究采用ＰＣＲ技术扩增了山东桑萎缩植原体　

也被用于植原体的分类研究中，如核糖体蛋白基　

的ｓｅｃＹ基因，试图在亚组水平上确定该种植原体　

因（　）、延伸因子基因（　）、１６Ｓ～２３Ｓ间隔区　的分类地位。　

收稿日期：２０１１—０４—１１　

基金项目：国家／Ａ　益性行业科研专项子课题（２０１００３０６５—６）；中国博士后科学基金（２００７０４１１１０３）；山东省博士后创新项目专项基　

金（２００７０２０１５）　

作者简介：公娇芬（１９８２一），女，硕士研究生，主要从事植物病理学研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｉｎ１１８１ｚｙ＠１６３．ｃｏｍ　

通讯作者．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｘｐ＠ｓｄａｕ．ｅｄｕ．ｃ／１　

６　山东农业科学　２０１１生　

１材料与方法　

１．１　材料　

取质粒，重组质粒经酶切鉴定后送北京博尚生物　

技术有限公司测序。　

ｌ＿４序列分析　

桑萎缩病植株叶片采自山东省宁阳县桑田，　

发病桑树植株叶片表现明显黄化、节间缩短、萎缩　

症状；克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ、ＰＣＲ产物回收试剂盒　

及其它酶类等分子生物学试剂产品均购自ＴａＫａ．　

Ｒａ公司。　

１．２总ＤＮＡ的提取和基因ＰＣＲ扩增　

将所得基因片段ＤＮＡ序列输入ＧｅｎＢａｎｋ进　

行Ｂｌａｓｔ检索，采用ＭＥＧＡ３．１软件与ＧｅｎＢａｎｋ中　

收录的植原体的相应基因的核苷酸序列进行比对　

分析，并构建系统进化树；模拟ＲＥＬＰ分析用　

ｐＤＲＡＷ３２软件进行。　

参照刘小勇等（１９９７）　１２］的ＳＤＳ—ＣＴＡＢ法　

提取发病桑树植株的总ＤＮＡ作为基因扩增的模　

２结果与分析　

２．１　ＰＣＲ扩增及序列分析结果　

板。植原体ｓｅｃＹ基因扩增采用Ｌｅｅ等（２００６）［８　３　

报道的通用引物ＡＹｓｅｃＹＦＩ／ＡＹｓｅｃＹＲ１（５　一　

ＣＡＧＣＣＡＴＩＴＩＴｒＡＧＣＡＧ　ｒｒＧＧＴＧＧ　一３　／５　一　ＣＡ．　

从表现萎缩症状的桑树样品总ＤＮＡ中扩增　

得到约１．４　ｋｂ的特异片段，与预期大小一致，而　

健康桑树植株和双蒸水对照均未出现特异条带。　

测序结果表明，该片段长１　３６１　ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登录　

号：ＪＦ７０６２１６），Ｇ＋Ｃ含量为３１．３％，包含ｓｅｃＹ基　

ＧＡＡＧＣＴＦＧＡＧＴＧＣＣｒ兀ＴｒＡＣＣ一３　）。反应条件：　

９４℃预处理３　ｍｉｎ：９４℃４５　ｓ，５０ｏＣ　３０　ｓ，７２　ｏＣ　

９０　ｓ，共３５个循环；最后于７２ｑＣ延伸１０　ｍｉｎ。　

１．３产物的克隆　

因１　２４２　ｂｐ，编码４１４个氨基酸，将该植原体暂时　

命名为ＭＤ—ＮＹ。　

ＰＣＲ产物经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测后再　

用ＰＣＲ产物回收试剂盒进行纯化回收，并与　

２．２系统进化及模拟ＲＦＬＰ分析　

利用桑萎缩植原体ｓｅｃＹ基因与翠菊黄化组　

ｐＭＤ１８一Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ｅｔ感受　

态细胞，培养后经蓝白斑筛选阳性克隆并少量提　

植原体的ｓｅｃＹ基因序列共同构建系统进化树（图　

１），结果显示，ＭＤ—ＮＹ与ｓｅｃＹＩ—Ｂ、ｓｅｃＹＩ—Ｄ、　

注：分支上的数据表示在１００次重复抽样中该分支获得５０％以上的自展支持率；分支后为亚组地位，种类及ＧｅｎＢａｎｋ登录号。　

图１　基于ｓｅｃＹ基因序列分析用ＭＥＧＡ３．１建立的系统发育树　

８　山东农业科学　２０１１丘　

因的同源性（９８．５％～９９．５％），根据ｓｅｃＹ基因序　

列，这些株系明显地形成１０个亚进化支，该结果　

与核糖体蛋白基因（ｒｐ）的分析结果一致，进一步　

说明变异大的一些保守基因更适合亲缘关系较近　

株系的分类研究　。　

本研究通过同源性比对，构建系统发育树及　

模拟ＲＦＬＰ分析，发现山东桑萎缩植原体与ｓｅｃＹ　

Ｉ—Ｂ和ｓｅｃＹ　Ｉ—Ｌ亲缘关系比较近，初步确定　

该植原体属于ｓｅｃＹ　Ｉ—Ｂ亚组，在亚组水平上明　

确了其分类地位，为研究桑树萎缩病植原体的来　

源、进化关系及其遗传变异提供了一定的线索。　

参考文献：　

蒯元璋．桑树萎缩病的三种病型的初步研究［Ｊ］．蚕业科　

学，１９６５，３（４）：２０７—２１６．　

［２］　夏志松．桑黄化型萎缩病的识别与防治［Ｊ］．中国蚕业，　

１９９５，２５（１）：２５—２７．　

［３］　

ＬｅｅＩＭ，Ｇｕｎｄｅｍｅｎ—ＲｉｎｄａｌＤ　Ｅ，Ｄａｖｉｓ　Ｒ　Ｅ，ｅｔａ１．Ｒｅｖｉｓｅｄ　

ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｓｃｈｅｍｅ　ｏｆ　ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＲＦＬＰ　ａｎａｌｙｓｅｓ　

ｏｆ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ａｎｄ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ．　

Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，１９９８，４８（４）：１１５３一ｌ１６９．　

［４］　

Ｍａｒｔｉｎｉ　Ｍ，Ｌｅｅ　Ｉ　Ｍ，Ｂｏｔｔｎｅｒ　Ｋ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

ｇｅｎｅ—－ｂａｓｅｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｆｏｒ　ｆｉｎｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｓａｓｉｉｆｃａ－・　

ｄｏｎ　ｏｆ　ｐｈｙｔｏｐｌｓａｍａｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，　

２００７，５７：２０３７—２０５１．　

［５］　

Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｂ，Ｇｉｂｂ　Ｋ　Ｓ，Ｓｅｅｍｔｉｌｌｅｒ　Ｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ＲＦＬＰ　ａ—　

ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｔｕ　ｇｅｎｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　

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１４３：３３８１—３３８９．　

［６］　

Ｍａｒｃｏｎｅ　Ｃ，ＬｅｅＩＭ，Ｄａｖｉｓ　Ｒ　Ｅ，ｅｔａ１．Ｃｌｓａｓｉｉｆｃａｔｉｏｎｏｆａｓｔｅｒ　

ｙｅｌｌｏｗｓ—ｇｒｏｕｐ　ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　

ｒＲＮＡ　ａｎｄ　ｔ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏ１．Ｍｉｃｒｏ—　

ｂｉｏ１．，２ｏｏｏ，５Ｏ（５）：１７０３—１７１３．　

［７］　

Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ　Ｂ　Ｃ，Ｓｍａｒｔ　Ｃ，Ｇａｒｄｎｅｒ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅ—　

ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｐｌｎａｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ＭＬＯｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　１６／２３Ｓ　

ｒＤＮＡ　ｓｐａｃｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．ＩＯＭ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３：２２８—　

２２９．　

［８］　

Ｌｅｅ　Ｉ　Ｍ，Ｚｈａｏ　Ｙ，Ｂｏｔｔｎｅｒ　Ｋ　Ｄ．ＳｅｃＹ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　

ｆｏｒ　ｆｉｎｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｓｔｅｒ　ｙｅｌｌｏｗｓ　

ｐｈｙｔｏｐｌｓａｍａ　ｇｒｏｕｐ［Ｊ］．Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅ．，２００６，２ｏ（２）：８７—　

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Ｌｅｅ　Ｉ　Ｍ，Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ—Ｒｉｎｄａｌ　Ｄ　Ｅ，Ｄａｖｉｓ　Ｒ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．‘Ｃａｎｄｉ—　

ｄａｔｕｓ　Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ　ｓａｔｅｆｉｓ’，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ　ｔａｘｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔ－　

ｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓａｔｅｒ　ｙｅｌｌｏｗｓ　ｎａｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．　

Ｅｖｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，２００４，５４（４）：１０３７—１０４８．　


本文标签： 萎缩 原体 基因 山东

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