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2024年12月29日发(作者：dreamweaver网页制作视频)

Western Blot

Western blot (immunoblotting)

1. What is Western blot?

A technique for detecting specific proteins separated by electrophoresis by use of labeled

antibodies. So called since it has some similarity to a Southern blot.

2. Why we have to use it?

We can use this technique to identify a target protein in a complex mixture, and we can also

use it to measure it’s expression level.

3. How to do it?

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一

种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂

交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern

印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分

子的印迹分析称为Eastern印迹法。

优点

：1 高分辨率的电泳技术2 特异敏感的抗原-抗体反应3. 1-5 ng中等大小的靶蛋白

4具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性

• Protocol：Separate proteins by gel electrophoresis

• Transfer proteins onto a membrane

– Wet tank transfer system

– Semi-dry transfer system

• Identify proteins--Immunodetection

Protein extract

Total protein – standard lysis buffer（lipa）

Nuclear cytoplasmic extraction (NER-PER, extraction kit, Pierce)

To prevent degradation

always centrifuge samples at 4℃and include a protease inhibitor

• Protein Qantification :

Standard BCA assay (Pierce)

Bradford reagent

SDS-PAGE Electrophoresis

Poly Acrylamide Gel Electrophoresis（PAGE）is the best method in protein separate。

Use PAGE to separate proteins by MW。

1. Samples are loaded into wells ical current is applied les are 瑟

parated by size

阴离子去污剂 变性剂

氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。

蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原

有的电荷差异。

与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。

蛋白质-SDS胶束的特点：1）具有相同的形状，形状像 一个长椭圆棒（2）平均1 g 蛋白质结

合1.4 g SDS3）短轴对不同的蛋白质亚基- SDS胶束基本上是相同的。（4）长轴的长度则与亚基

分子量的大小成正比

PAGE

：聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂

(crosslinker),N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’ methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂

作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是

良好的电泳介质。

聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式

：

• 单体：丙烯酰胺（Acr）；

• 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；

• 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；

• 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；

• 产物：三维网状结构凝胶

聚丙烯酰胺凝胶聚合机理

是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用

(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核

黄素——TMTED）体系。

准备 ;1灌制分离胶 2 隔绝空气 ( ddH2 0.1SDS:<8 异丁醇：>8% ) 3灌制积层

胶 4 插入梳子

影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素

1试剂的纯度2温度3氧气4〔AP〕〔TEMED〕原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。

凝胶浓度的选择

不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。

不连续电泳：

作用 缓冲液PH 凝胶浓度

PH6.8Tris-Cl

压缩胶 使蛋白样品浓缩 低，2-5%

PH8.8Tris-Cl

分离胶 使蛋白样品分离 高，根据蛋白大小

浓缩效应：

三种离子：Cl- 前导离子 Gly-尾随离子PI=5.97 pro

积层胶 : 分离胶 大孔 小孔 阻力

 凝胶浓度的不连续性 浓缩胶，其胶浓度较小（常用4 % 左右），孔径相对较大。

较稀的样品在浓缩胶中泳动时受到的阻力小，泳动较快，因而被浓缩成一个狭窄的区带。

 分离胶 (seperating gel) ，其浓度依所分离的样品情况而定。分离胶的浓度必定大于浓

缩胶，当被浓缩的样品进入小孔径的分离胶时，受到的阻力增大，泳动速度减慢，使其

在分离胶中能得到高分辨率的分离。

 离子成分及pH的不连续性 浓缩胶和分离胶的缓冲液均为Tris(三羟甲基氨基甲烷)-

HCl 。

 Tris 的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl 在任何pH条件下

均易解离出Cl-，后者在电场中迁移率快，走在最前面，称为先导离子（leading ion）

或快离子。

 电极缓冲液为Tris-glycine （甘氨酸），后者在pH6.7（浓缩胶缓冲液的pH常为6.7左

右）的溶液中解离度小，在电场中迁移率慢，称为尾随离子（trailing ion）。

 大多数蛋白质分子的迁移率介于快、慢离子之间，就会在快、慢离子形成的界面处被浓

缩成极窄的区带。当甘氨酸进入pH8.9左右的分离胶时，其解离度增大，迁移率超过

蛋白质，因而Cl-和甘氨酸根离子沿着离子界面继续前进，蛋白质则被留在后面，不受

离子界面的影响而逐渐分离

电泳后染色 电泳时前沿指示剂有微笑和皱眉现象

蛋白质的电转移（

electrotransfer blot) 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，硝酸纤维素

膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。

半干式转膜

注意：

1转移单元无气泡2注意方向3戴手套，防止引入污染蛋白4胶、膜大小一致，半干转注意

短路。5膜、滤纸要先平衡6.20%甲醇改善电转移效果。7.转移效果： Ponceau-S Red

固相支持物的选择：

硝酸纤维素膜（nitrocellulose, NC)

NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底

显色浅； 价格低廉，使用方便。

结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。

Polyvinylidene fluoride (PVDF)与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正电基

团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

封闭

： 为避免NC与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景

提高，需对NC上的潜在结合位点进行封闭处理。

(1)-5% BSA或non-fat-dry-milk (RT or 4℃)(2)-incubation time : 60 min - O/N(3)Tween-20的作

用;减少非特异性吸附不影响抗体与抗原的结合

靶蛋白的免疫学检测

1. Chromogenic Detection:

HRP: Diaminobenzidine (DAB)- brown precipitate

AP: BCIP/NTP- purple/blue precipitate

2. Chemiluminescent detection

HRP: Luminol- oxidised luminol emits blue light

Poor Transfer

Adjust composition of the transfer buffer

Methanol

SDS

Equilibrate gel and the membrane in the transfer buffer - Equilibrate for 5 - 30 mins

Transfer of a range of proteins with different molecular weights

Transfer of a broad MW range of proteins may require a multi-step transfer.

Start at low current/voltage to give good binding of low molecular weight proteins

After 30 minutes increase current/voltage to promote elution of high molecular weight proteins


本文标签： 蛋白质 凝胶 分子 结合 分离

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