基于SLAF-seq_的华山松球果数量性状全基因组关联分析

云南农业大学学报（自然科学），2023，38(3)：476−484

Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science)

E-mail: ********************

引文格式：李启少, 叶鹏, 赵文植, 等. 基于SLAF-seq的华山松球果数量性状全基因组关联分析[J]. 云南农业大学学报(自

然科学), 2023, 38(3): 476−484. DOI: 10.12101/.1004-390X(n).202208066

基于SLAF-seq的华山松球果数量性状

全基因组关联分析

*

李启少

1,2

， 叶　鹏

3

， 赵文植

1,2

， 马路遥

1,2

， 王正德

1,2

，

曹正英

1,2

， 王　飞

1,2

， 辛培尧

1,2 **

(1. 西南林业大学，国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650224；

2. 西南林业大学，西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650224；

3. 内蒙古浑善达克规模化林场，内蒙古 呼和浩特 010020)

摘要: 【目的】挖掘与华山松球果数量相关的基因。【方法】以华山松球果数量性状表型数据筛选华山松高、

低球果数量单株，利用前期已开发的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)标记结合表型数

据进行全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)，构建华山松样品的系统发育树，发掘与华

山松球果数量性状相关的SNP标记与候选基因，并进一步分析筛选出的基因在华山松针叶、木质部、韧皮

部、树皮、幼嫩球果和树根的qPCR基因组织特异性表达。【结果】系统发育树显示：同一种源的单株基本处

于相近的位置，而来自巍山的单株广泛分布于各个群体中，与主成分分析结果基本一致。全基因组关联分析

共检测到12个与球果数量显著关联的SNP位点，其中，Marker193307的序列与纤维素合成相关基因Kor-

rigan (KOR1，编码跨膜内切β-1,4-D葡聚糖酶)的序列相似度较高(74.74%)。qPCR基因组织特异性表达分析

结果显示：该基因在华山松枝条韧皮部的表达量最高，幼嫩球果中次之，在根系的表达量最少，初步判断该

基因与球果数量相关。【结论】华山松种源地相近的单株基本处于相近的位置。巍山种源的材料较其他种源

拥有较为广泛的遗传变异。GWAS分析仅检索到1个与植物纤维素合成相关的基因(KOR1)，该基因可能参与

球果数量性状的表达。

关键词: 华山松；SLAF-seq；单核苷酸多态性(SNP)；球果数量；全基因组关联分析(GWAS)

中图分类号: S791.241.01　　　 文献标志码: A　　　 文章编号: 1004–390X (2023) 03−0476−09

Genome-wide Association Study of the Cone Number Character in

Pinus armandii Based on SLAF-seq

LI Qishao

1,2

，YE Peng

3

，ZHAO Wenzhi

1,2

，MA Luyao

1,2

，WANG Zhengde

1,2

，

CAO Zhengying

1,2

，WANG Fei

1,2

，XIN Peiyao

1,2

(1. Southwest Forestry University, Southwest Research Center for Landscape Architecture Engineering of National

Forestry and Grassland Administration, Kunming 650224, China; 2. Key Laboratory of National Forestry and Grass-

land Administration on Biodiversity Conservation in Southwest China, Southwest Forestry University, Kunming

650224, China; 3. Hunshandake Large-scale Forest Farm, Inner Mongolia, Hohhot 010020, China)

收稿日期：2022-08-31　　　　修回日期：2023-05-10　　　　网络首发日期：2023-07-13

*基金项目：云南省基础研究计划农业联合专项重点项目(202101BD070001-009)。

作者简介：李启少(1999—)，男，云南文山人，在读硕士研究生，主要从事林木分子生物学与遗传改良研

究。E-mail：****************

**通信作者 Corresponding author：辛培尧(1975—)，男，甘肃临洮人，博士，教授，主要从事植物遗传育种

与快繁研究。E-mail：***************

网络首发地址：/kcms2/detail/

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第 3 期李启少，等：基于SLAF-seq的华山松球果数量性状全基因组关联分析

477

Abstract: ［Purpose］To excavate genes related to the number of cones in Pinus armandii.

［Methods］Based on the phenotypic data of cone number of P. armandii, the high and low cone

number individual plants were screened. Combined with phenotypic data, single-nucleotide poly-

morphism (SNP) markers developed previously were used to genome-wide association study

(GWAS), and the phylogenetic tree of P. armandii samples was constructed, the SNP markers and

candidate genes related to cone number of P. armandii were excavated, and the tissue-specific expres-

sion of qPCR gene was further analyzed in six parts of P. armandii, such as needles, xylem, phloem,

bark, young cones and roots. ［Results］The phylogenetic tree showed that the individual plants of

the same provenance were basically in a similar position, while the individual plants from Weishan

were widely distributed in each population, which was basically consistent with the results of princip-

al component analysis. A total of 12 SNP loci significantly associated with cone number were detec-

ted by GWAS. It was found that the sequence of Marker193307 was highly similar to the cellulose

synthesis related gene Korrigan (KOR1, encoding transmembrane endo-β-1,4-D glucanase) (74.74%).

The tissue-specific expression of qPCR results showed that the expression level of the gene was the

highest in the phloem of branches, followed by the young cones, and the least in the roots. It was pre-

liminarily judged that the gene was related to the number of cones. ［Conclusion］P. armandii

provenance close to the individual basically in a similar position. The materials of Weishan proven-

ance have more extensive genetic variation than other provenances. GWAS only retrieves one gene

(KOR1) related to plant cellulose synthesis, which may be involved in the expression of cone number.

Keywords: Pinus armandii; SLAF-seq; single-nucleotide polymorphism (SNP); cone number; gen-

ome-wide association study (GWAS)

华山松(Pinus armandii Franch.)是松科(Pin-

aceae)松属(Pinus)大乔木，也是中国特有的五针

松树种，其耐寒能力强，喜好温和凉爽、湿润的

气候，适应性较广

[1]

。华山松是优良的建筑和家

具材料，同时也可以用于制浆造纸，种子可供食

用和榨油，利用价值较高。近年来，由于种质资

源退化、良种选育滞后，导致华山松人工林陆续

出现生长量下降、长势衰弱、病虫害严重、利用

水平低和产品附加值低等问题

[2-4]

。虽然国内相关

科研单位已开展了对华山松的遗传改良工作

[5-9]

，

但由于其育种周期长和主要性状的优劣难以在早

期进行选择，因此，找到准确、可靠且有效的早

期选择标记是解决良种问题的关键技术之一。

随着分子生物学的不断进步，林木育种的方

法与理论也在不断发展，尤其是分子标记辅助选

择技术的不断更新，涌现出多种分子标记方法，

如RAPD、AFLP、SRAP、SSR和SNP等标记，

为植物遗传改良提供了更多的选择，也提高了选

择的可靠性与准确度

[10]

。其中，单核苷酸多态性

(single-nucleotide polymorphism，SNP)标记是由

单碱基突变(缺失、插入、转换和颠倒)所引起的

基因组水平上的DNA序列多态性，具有稳定性

高、位点丰富、分布较广和检测迅速等特点，目

前已广泛应用于植物育种

[11]

。全基因组关联分析

(genome-wide association study，GWAS)由RISCH

等

[12]

首先提出。该技术能够在全基因水平上发掘

与复杂性状相关联的遗传变异，以连锁不平衡为

基础，通过识别和定位目标群体中的高密度分子

标记获得与复杂性状表现型变异有关联的SNP标

记

[13]

。GWAS最早应用于人类视网膜黄斑变性与

人类年龄的相关性分析上

[14]

。近年来，由于引入

混合线性模型和Bonferroni校正统计方法，能够

将自然群体特征性状和非家系群体作为研究对象

开展GWAS研究。因此，GWAS也被大量应用

于植物的关联分析与遗传育种工作。目前，不仅

在水稻

[15]

、小麦

[16]

和玉米

[17]

的产量、株高、穗长、

成花时间及抽穗期等性状关联出多个相关的基因

位点，还在植物抗病基因的筛选

[18]

和代谢物合

成

[19]

等方面得到了应用。GWAS相关研究结果为

阐明生物复杂性状的遗传结构提供了理论基础。

生产中可将检测到的关联位点运用于分子标记辅

助选择，对植物的遗传改良工作具有重要的理论

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478

云南农业大学学报第 38 卷

和实践意义。

本研究基于前期通过SLAF-seq测序获得的

高通量SNP

[6]

构建华山松样品的系统发育树与主

成分聚类图，继而进行全基因组关联分析，筛选

与华山松球果数量性状显著关联的SNP位点，并

对显著关联位点区域的基因进行分析，挖掘与球

果数量性状相关的候选基因，分析候选基因在华

山松6个部位的qPCR基因组织特异性表达。研

究结果可为华山松球果数量相关性状的早期选择

提供理论依据。

transformed linear mixed models，FaST-LMM)、一

般线性模型(general linear models，GLM)、混合

线性模型(mixed linear models，MLM)和压缩混

合线性模型(compressed linear mixed model，CM-

LM)，在充分考虑210份华山松单株的总体结构

与亲缘关系的情况下进行关联分析。利用admix-

ture软件

[25]

获得Q值(样本总体结构)；样品间亲

缘关系K值则是利用SPAGeDi软件

[26]

获得；X表

示基因型，y表示表现型。所有SNP位点均可得

到1个关联结果。其中，TASSEL软件的混合线

性模型公式为：y=Xα＋Qβ＋Kμ＋e。式中：α为

固定效应向量；β为SNP替代效应；μ为服从分

布N (0，Gσ

2

)的随机加性遗传效应的向量，G为

从SNP标记导出的亲属关系矩阵，σ

2

为加性方

差；e为残差。GWAS结果基于R v4.2.0中的

CMplot程序包绘制，Q-Q 图(quantile-quantile plot)

用于评估关联分析结果的准确性。

(2) 候选基因筛选：关联分析得到与球果数

量性状相关的SNP位点，并在SLAF标签上找出

对应的位置以及碱基序列，利用SNP序列在NCBI

数据库进行BLAST比对，筛选与球果数量性状

相关的基因。

1.3.3 荧光定量PCR反应

1 材料与方法

1.1 采样地概况

采样地位于云南省楚雄市紫溪山华山松无性

系种子园(N24°58′58″~25°4′，E101°22′29″~101°

26′7″，海拔2 200~2 400 m)，于1990年建成，园

区内80%的林地坡度小于10°。种子园地处北亚

热带温凉湿润气候，年降水量约1 000 mm，相对

湿度80%~85%，年平均气温12 ℃，平均最低气

温−6 ℃，平均最高气温20 ℃。

1.2 供试材料

试验材料选自种子园内6个种源地的1 453

株华山松单株，以连续多年的年份内球果数量为

基础数据，共筛选出210株华山松作为试验材

料，其中高、低球果产量的华山松单株各30

株，球果数量及生长量均处中上水平的华山松单

株150株。另选3株不同华山松优良单株的幼嫩

且无病害的球果、树皮、韧皮部、木质部、根和

针叶，用于提取华山松RNA以进行q-PCR验证。

(1) 华山松总RNA提取

使用植物RNA提取试剂盒(OMEGA R6827)

提取华山松针叶、树皮、韧皮部、木质部、球果

和根的总RNA。

(2) mRNA反转录为cDNA

参照周延清等

[27]

的方法得到第1链cDNA并

储存于−20 ℃冰箱中，备用。

(3) 引物设计

从NCBI中检索相关的基因序列，用Primer 3

设计荧光定量PCR引物(表1)。引物条件为：引

物长度在18~24 bp之间；GC含量在40%~60%

之间；5′端或中间区域为G或C；扩增片段的长

度在100~300 bp之间，退火温度在55~60 ℃之

间。从设计的7对引物中筛选1对能让候选基因

在各个组织中稳定表达的引物，对检测到的目标

基因进行q-PCR分析。

(4) 荧光定量PCR反应

使用EvaGreen 2×qPCR MasterMix试剂盒

(上海爱必梦生物科技有限公司)进行荧光定量

PCR反应，反应体系为20 μL，包括EvaGreen

1.3 试验方法

1.3.1 系统发育树与主成分分析

利用前期已开发的SNP标记，采用MGEA X

软件

[20]

，基于邻接法的Kimura2-parameter模型构

建华山松样本的系统发育树，bootstrap重复1 000

次。利用EIGENSOFT软件

[21]

将SNP标记用于主

成分分析，获得华山松的主成分聚类图，每1种

颜色代表1个种源地，每1个点代表1个样品，

样品间存在广泛的差异，样品距离越近，则代表

亲缘关系越近，主成分分析的结果可以辅助进化

分析，充分体现群体中个体亲缘关系的离散程度。

1.3.2 球果数量的GWAS分析

(1) GWAS分析：将球果数量作为鉴定指标，

利用TASSEL

[22]

、FaST-LMM

[23]

和EMMAX

[24]

软

件的光谱变换线性混合模型(factored spectrally

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第 3 期李启少，等：基于SLAF-seq的华山松球果数量性状全基因组关联分析

表 1 qPCR引物序列

Tab. 1 qPCR primer sequence

479

基因名称

gene name

Kor1

上游引物

forward primer

TTTCCCTGCTGCATTCGCTA

CATTGCGTGACTTTGCACGA

AGCATGTACATCACCGTGGG

CAATGCTGGGTTAGTTGCGG

TTGCGTGACTTTGCACGAAC

ATGGAAGGCCCCAACCTCTA

AGGTTCTCTTGAGCAGGCTGAGG

下游引物

reverse primer

GGACTAGAAGCTCCCCCTGA

ATCACGCTTATCAGGCCCAG

TTGGGTCTTGGACTGTCACG

GAGTTGGGAACATGGGTGGA

ACATGCTTGGGGTAATGGCT

GAGTTCGTGCAAAGTCACGC

GACAGGAAGGTACGAGCACATCAC

2×qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，

模板DNA 1 μL，无酶水7 μL。q-PCR扩增程序

为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃ PCR反应15 s，

60 ℃ 1 min，共40个循环；95 ℃溶解曲线15 s，

60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。选择和松树相关的

AT5G42190作为内参基因，其引物序列为：F：

ATGCTGGACAGGCTTTGAAC，R：GAGTTGCT-

CCGAGATCTTTACA。

1.3.4 数据统计与分析

试验结束后，统计Ct值于Excel表中，利用

公式∆∆Ct=(Ct

处理组

−Ct

内参

)−(Ct

对照组

−Ct

内参

)]计算

各组织的Ct值

[28]

，之后利用Excel软件作图；采

用Excel 2010和SPASS 20.0软件进行相关数据

的描述统计与相关性分析。

2 结果与分析

2.1 系统发育树与主成分分析

系统发育树(图1)显示：华山松各材料之间

存在着较为丰富的遗传变异，来自相近地理位置

的材料都基本在相近的位置，但是来源于楚雄和

楚雄 Chuxiong

会泽 Huize

南华 Nanhua

腾冲 Tengchong

巍山 Weishan

宜良 Yiliang

图 1 华山松系统发育树

Fig. 1 Phylogenetic tree of Pinus armandii

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480

云南农业大学学报第 38 卷

0.3

楚雄 Chuxiong

会泽 Huize

南华 Nanhua

腾冲 Tengchong

巍山 Weishan

宜良 Yiliang

巍山的材料分布相当广泛，在各群体中均有分布。

将SNP标记用于主成分分析(图2)发现：同一种

源地的样品基本聚在一起，说明它们的亲缘关系

较近，其中来自巍山的样品分布范围较广泛，表

明巍山各材料间遗传差异较大，与系统发育树的

分析结果基本一致。

2.2 华山松球果数量性状的GWAS结果

2.2.1 华山松全基因组关联分析

GWAS结果表明：球果数量性状能够在FaST-

LMM、GLM和MLM模型中被定位。由图3可

知：FaST-LMM和MLM模型的观测值与期望值

仅在最右侧发生了偏离现象，说明球果数量性状

的差异并非因群体分层所造成，所选的模型为本

试验适合的模型；而GLM模型中SNP位点出现

在预测线上方，且不与对角线重合，说明观测值

大大超过了预测值，表明该模型不合理。

共检测到12个与球果数量性状显著相关的

SNP位点，获得12个SNP所在SLAF标签上的

位置和P值(表2)。12个SNP位点分别为Mark-

er170924、Marker193307、Marker357784、Mark-

er6337143、Marker17681543、Marker201128、Mar-

ker215196、Marker250033、Marker251795、Marker-

0.2

P

C

2

(

2

.

4

1

%

)

0.1

0

−0.1

0

0.1

PC1 (3.08%)

0.2

0.3

图 2 华山松PCA聚类图

Fig. 2 PCA cluster graph of P. armandii

6508087、Marker292650、Marker18895864。

2.2.2 候选基因的筛选

将12个SNP所在的序列片段在NCBI中进

行基因检索(表3)，在Marker193307附近检测到

1个紧密关联的基因Korrigan (KOR1，编码跨膜

内切β-1,4-D葡聚糖酶)，其序列相似度较高(为

74.74%)，NCBI基因登录号为AC241332.1，该

基因对植物纤维素合成具有重要作用。

10

8

6

4

2

0

GLM 模型

GLM model

10

8

观

测

值

o

b

s

e

r

v

e

d

v

a

l

u

e

6

4

2

0

FaST-LMM 模型

FaST-LMM model

10

8

6

4

2

0

MLM 模型

MLM model

01234501

注：灰色区域为图上散点95%的置信区间，红色线为45°中心线。

23

期望值

expected value

45012345

Note: Grey areas represent 95% confidence intervals for scatter points on the map, red line represents the 45° center line.

图 3 华山松球果数量Q-Q图

Fig. 3 Quantile-quantile (Q-Q) plot of cones of P. armandii

2.3 基因组织特异性分析

由图4可知：KOR1在韧皮部的表达量最

谢。因此，推测球果数量性状与该基因相关。

高，在幼嫩球果中的表达量次之，在根中的表达

量最低。已知KOR1基因是与纤维素合成相关的

基因，该基因在韧皮部和幼嫩球果中的表达量较

高，说明其参与了韧皮部与幼嫩球果的生长代

3 讨论

3.1 华山松不同分子标记方法比较

近年来，分子标记辅助选择技术不断更新，

越来越多的分子标记方法应用于华山松育种。赵

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第 3 期李启少，等：基于SLAF-seq的华山松球果数量性状全基因组关联分析

481

表 2 与华山松球果数量显著相关的SNP位点

Tab. 2 SNP loci significantly related to the number of

cones in Pinus armandii

杨等

[29]

对2个不同年份的华山松子代材料进行

ISSR遗传多样性分析，结果显示：该种子园的遗

传多样性处于较高水平，遗传变异多处于种源

内，与种子园内亲代群体相比较，初期子代的遗

传多样性指数略有降低，而后期子代的遗传多样

性指数则为最低，可见，对于提高华山松球果产

量和品质刻不容缓。辛静等

[30]

对紫溪山华山松无

性系种子园进行SSR遗传多样性分析，结果表

明：种源间遗传变异不高，其主要遗传变异存在

于种源内。徐剑等

[31]

利用SCoT分子标记对紫溪

山华山松种子园进行遗传多样性分析，表明种子

园内不同无性系拥有较高水平的遗传多样性，且

遗传分化主要存在于种源内。刘成等

[32]

同样利用

紫溪山华山松无性系种子园的材料，通过SRAP

SLAF标签编号

SLAF label number

Marker170924

Marker193307

Marker357784

Marker6337143

Marker17681543

Marker201128

Marker215196

Marker250033

Marker251795

Marker6508087

Marker292650

Marker18895864

物理位置

physical location

51

157

184

50

72

181

142

57

39

20

33

86

P值

P-value

7.922 1E-7

2.195 8E-6

8.473 3E-7

2.614 5E-9

2.124 5E-7

1.036 8E-7

1.822 8E-7

3.114 3E-7

1.923 1E-6

8.325 7E-8

1.002 0E-5

2.809 1E-5

表 3 与球果数量相关的单核苷酸多态性(SNP)序列

Tab. 3 Single-nucleotide polymorphism (SNP) sequence related to the number of cones

SNP

Marker170924

Marker193307

Marker357784

Marker6337143

Marker17681543

Marker201128

Marker215196

Marker250033

Marker251795

Marker6508087

Marker292650

Marker18895864

碱基序列

base sequence

ATAGGGGCCTCGGTGTGCATGATGTTATCATCAAACACCAAAAATAGTCAGGAGAAAGAGGCTAGTAGTAATGAA

ACCAAGGCCACAGGCATGAATTTTCCATAGAAAATTTCTCATTCTTGAAGCCTTCTGATGCTGTATAAACTCAAAA

AGTAATCTTCATTACTGTTTCATTCAAAAATCCACCAAGAAACCCTGCT

ATATATCTCACCTTCTCTGACACACCTGCGAATAATCAAATCGGTCCAATGAAATAGAGGTCTCCCTTAATCCAGG

AGTAATTAGCACTTTTCCTAATAATAATTTTATTTTCCCGACATTTCCAATACTGTGATGTCAAATTCCTACAGCAA

CAAAAGCCACCTAGTGATCCTGCCATCAGTGATTGGTTTTTTCATGA

CAGACCTCAAATCAATCTTAGAGAAAAAAATTTCTCCTTTCACCTAATCAAACAGATCATCAATTCACAGTAATGA

ATATTTTTTTTTTTACCGTCAATTCCTGAAGCTTCATTTTGAGCTCGATTAGCCCTGGTGTTCTCATTCGGTAAGGGG

CCCTAAATACTAGTGTTGCCCCAGGAATAAGTTCGATGGTGAAATT

CATACCTCTATAGACGAAAATGATATTCAAAGCAGGAGACCATTCTTAAAAACAATCCATGTTGTTCTCCAGCAAA

ATAAACCATGGGAGGTGAAGGAAGCATCCATGCTTTAATTAATATAAACCAAAATTCGTGAACATCCTCATGAAG

AAGTTGGGTTCTCAGTTGCTTCTTCTCTCAGCAGGGACATAAATATAAC

TCATATGACATCATTTTTTTGAAACATTTATGGCGCTGGAATCAGGAAGACGAGATCTACGCAACCATCCTGGTTTC

AACCCAATCCTGTCACTTTGAATCCTTTAAGCCCAACTCAAAGGTATTCAACACTCCCCCTCTTGGATGCTTTTGTC

CTAGTGTCAAGAATTGTATCTTCTTTTATCTCATCTAGAAATTCCA

GCAAACGTATTTCTATTGGTCAAACCTTTGAAATTATGTAGGGTGTTGATCATGTCAGCATTCTGTTAAATTCTGTT

AAATTATGTTAAGCAATTCCCTTATAAGCTTTGGCACCTTTCGGCCCTAGCCCCTCAGTATTTTTCTCCATGTAACCT

GGGTGCTAGACCAATCTGTAGCCTGGAGAGCGCTTATCGCAGGGG

TCATTAACACATATACTAGTGTGTCCATCTAAATTAATGGGTCAATAGACATCACGACACTTACCTTTTAATACATC

TCACAATGCTAAGTATATAATTANNNNNNNNNNAGAATTCAATGACACTTATGAACATGACATTCTTTTAATTAAC

TTGATAAGAAAAAGAAAACATAACTACTTTCAAGATAAATCTCAACCCTTTATCCTA

AGCAATTTTTTCTTTTGTACAAACATACTCGAGTTTTATATTCTTTTCAGTGACTTGTTCTCTAACAAAATTATATTT

TATCAGAATTTTTTTTGTTTTTTTGCAATTTATTCTACTTCCACTGTAGATAACGAGATTGAAGTTTGCTTTTTGCTCA

ACCATGATACGAGACAACCACCTAGATAGAATGCTGCTCCACT

ACACCAATCCTTTGAACTTGAAATTGCACACTATATTTACAAAAAACAAAAAAAGATAGAAATATATATGAAATAT

TAATACAATCATTATTTAACCAGACAACCAACTTTGGAAACTGGGATCTAGCCATGCCAGTTTCAGAGAGAGCTCT

CTCTATAAGATTTAACTTTATTTGAATAATTTTTAGGCTAGTTAATAT

TTCAGCGTATTTGTATCGGTTGCTACCATGTATATCTGTACATATCTATGATTAGATTTAGGTTCACTGGATATTATG

AATTGCGAGAGCGAGACCCAGTCCATCTCGCCTAGCGTACCTTCCATTCCCACCAGATCGAGACCCAGACCTTTGT

GCTCGTTATCCAGTTTCTTATTAGCGTGATCGACAGCTAGGTTTTA

TTGTATTAGCAAACAAATTTCTCCCAAACATTCTACCTACACAGCCCACTTTCCTAACATTTTTTCTTCATAAGGTGC

ATTTGGACTTGCTAACCTTTGATCTGCCAGGATTAAACTGTCTGACAGATTTTATTCTCTACATTCTAAAACAGAAA

ATTTAAAACACAGCCAAGTCAGGATTAAACTTTTTGACTTGCTAT

GATGGCTCTGGGGAAGACAAAGCTTTTCTATTTTTAGAGAGAAGTTGGGGATGATCAAGAATCCATTTTAGTAGCA

CGAATGGATAGGATTAGGATTCAGCATGCAACAGGCATATTGCTAGAACACTTTCCTCGCTAAGAGGGAGTATTGA

TTTTTGTAGCATCGGAAAGTGTTTTTAAGTCTCAAAATTTTTGAGGAG

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云南农业大学学报第 38 卷

3.0

m

R

N

A

相

对

表

达

量

m

R

N

A

r

e

l

a

t

i

v

e

e

x

p

r

e

s

s

i

o

n

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

针叶

needles

木质部

xylem

根

root

幼嫩球果

cone

树皮

bark

韧皮部

phloem

种的果实发育期进行了生理生化机制研究，结果

表明：伴随着果实的发育，果实中纤维素以及半

纤维素的含量先呈上升趋势，14 d后急剧下降，

而纤维素酶在果实生长发育过程中则一直呈上升

趋势。另有学者以壶瓶枣作为试验材料，测定其

果实的果肩果皮、果肩果肉、果底果皮和果底果

肉在盛花后40、55、70和85 d的纤维素含量变

化，结果表明：壶瓶枣果实整体的纤维素含量呈

先上升后下降的趋势

[36]

，这与李萍

[35]

对新疆杏果

实的研究基本一致。可见，纤维素在果实的生长

发育中起到重要的作用，而参与调控纤维素合成

的KOR1基因也在果实的生长发育中有着不可或

缺的地位。KOR1是纤维素合成所必需的基因，

在植物和其他生物(如细菌)质膜—细胞壁的合成

中也发挥着重要作用

[37-38]

。目前，已经确定KOR1

与纤维素合成酶复合物具有物理相互作用，并参

与了纤维素伸长过程中甾醇连接引物的断裂或纤

维素纤维结晶度的降低，KOR1等位基因突变会

导致纤维素合成受阻以及生长迟缓，在KOR1基

因点突变的irx2突变体中，束间纤维和木质部的

纤维素含量降低，导致导管塌陷，表明KOR1参

与次生壁中纤维素的生物合成

[39-41]

。此外，KOR1

的其他突变会导致细胞板形成缺陷

[42]

和初级细胞

壁纤维素含量减少

[43-44]

，表明KOR1在初级细胞

壁的纤维素生物合成中也起着重要作用。本研究

的qPCR结果显示KOR1基因在华山松幼嫩球果

中的表达量较高，因此认为KOR1基因参与了幼

嫩球果的生长发育。

图 4 KOR1在华山松各个部位中的表达量变化

Fig. 4 Expression changes of KOR1 gene in different

tissus of P. armandii

分子标记技术对其进行遗传多样性分析，结果显

示：该园的华山松群体遗传多样性处于相对较高

的水平，遗传变异在种源内。因此，利用该种子

园进行华山松杂交育种时，应多进行种源内杂

交，兼顾遗传距离较远的种源间杂交。同时，需

尽量开发较多的早期选择标记，以实现早期选择。

由于分子标记方法的不同，开发基因标记的

试验结果会有一定差异。本研究所采用的分子标

记方法是SNP标记技术，与其他分子标记方法相

比较，SNP标记数量多、遗传稳定，且不需要凝

胶电泳检测，为试验节省了大量的时间和成本。

而利用如简单重复间序列分子标记(ISSR)、序列

相关扩增多态性分子标记(SRAP)和简单重复序

列分子标记(SSR)等方法开发华山松基因组的

DNA分子标记难度相对较大、需要的时间较长，

且标记数量有限。赵杨等

[29]

利用ISSR分子标记

共获得13条具有多态性的引物；刘成等

[32]

利用

SRAP分子标记共筛选出15对多态性引物组合；

祝娟利用SSR标记对华山松基因组DNA进行

PCR扩增，筛选获得12对具有多态性的引物。

而本研究利用SLAF-seq测序技术共得到3 469 074

个SNP标记。可见，SLAF-seq测序技术开发分子

标记的效率较其他分子标记技术效率较高。

4 结论

[33]

巍山种源的华山松较其他种源拥有较为广泛

的遗传变异。结合华山松表型数据和SNP标记进

行全基因组关联分析，得到12个与球果数量性

状显著关联的SNP标记，并通过检索得到1个与

植物纤维素合成相关的基因KOR1，该基因在幼

嫩球果中的表达量较高，可能与球果数量性状

相关。

[ 参考文献 ]

3.2 华山松球果数量性状的相关基因

本研究共检测到与华山松球果数量显著相关

的SNP位点12个，并在Marker13307位点中检

索到KOR1基因。KOR1基因是一种纤维素酶，

它参与调控纤维素合成，对植物生长发育、组织

脱落以及维持植物正常生理代谢有着极其重要的

作用

[34]

。李萍

[35]

对新疆杏中早熟、中熟和晚熟品

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责任编辑：何承刚

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