Western-Blot-操作要点

细心整理

Content

1. Objective

2. Scope

3. Materials

➢ Reagents

➢ Instrument

➢ Consumable

4. Procedure

5. Changing history

1．Objective

2. Scope

3．Procedure

－鉴定蛋白表达状况－

－－本SOP适用于 Western-Blot试验操作

仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、

—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴

摇床、多用脱色摇床。

试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、12％分别

胶、5％浓缩校、2XSDS上样缓冲液、电泳缓冲

液、转移缓冲液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体

缓冲液、显影液、定影液、一抗〔由托付人供

应〕、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗、ECL

化学发光试剂、显影液、定影液。

杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规

格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；PVDF膜，乳

胶手套，保鲜膜，搪瓷盘〔>20×20cm〕，X-光片

夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点〔见下所示〕，最终

用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

10％SDS

SDS 10g

蒸馏水至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，

水浴溶化后，仍可运用。

10％过硫酸胺〔APS〕

过硫酸胺 0.1g

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超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/L Tris·HCl〔pH8.8〕

Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最终用超纯水定容至

250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl〔pH6.8〕

Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最终用超纯水定容至

250ml，高温灭菌后室温下保存。

30％Acr

丙稀酰胺〔Acr〕 29g

甲叉双丙稀酰胺〔Bic〕 1g

超纯水至 100ml

溶解后，0.45μm滤膜过滤后4℃保存。运用时复原至

室温且无沉淀。

0.01mol/L PBS〔 pH 〕

Na

2

HPO

4

2.9g

KH

2

PO

4

0.2g

NaCl 8g

KCl 0.2g

蒸馏水至 1000ml

12％分别胶和5％浓缩校

10mL12％分别 4mL 5％浓缩胶

超纯水 3.3ml 2.7ml

30％Acr 4.0ml 0.67ml

1.5 mol/L Tris·HCl〔pH8.8〕2.5ml －

1.0 mol/L Tris·HCl〔pH6.8〕 － 0.5ml

10％SDS 100 l 40 l

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10%AP〔过硫酸胺〕 100 l 40 l

TEMED 4 l 4 l

加TEMED后，立刻混匀即可灌胶。

复原型2XSDS上样缓冲液

1.0mol/L Tris·HCl〔pH6.8〕 0.5ml

SDS 0.2g

溴酚蓝 10mg

甘油 1.0mL

DTT，MW154.5〕 0.39g

临用前取1.0 mol/L贮存液DTT 1.0mL参与4.0mL 2 X SDS

loading buffer，混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存,

一周内用完。

DTT

DTT 5.0g

DDW 32.4 Ml

分成小份，-20度保存。

5*Tris-Glycine Buffer 电泳液缓冲液

Tris〔MW121.14〕 15.1g

甘氨酸〔MW75.07〕 94g

SDS 5.0g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复运用3～5次。

10*转移缓冲液

甘氨酸〔MW75.07〕 14.5g

Tris〔MW121.14〕 29g

SDS 0.5g

蒸馏水至 500ml

溶解后室温保存，临用前取200mL甲醇参与800mL 转膜

缓冲液中共1000 mL 。次溶液可重复运用3～5次。

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TBS缓冲液

1 mol/ LTris·HCl〔pH7.5〕 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

TBST缓冲液〔含Tween20的TBS缓冲液〕

0.05％Tween20 0.25ml

TBS 500ml

混匀后即可运用，最好现用现配。

1*TBST 1L

Tris base 2.422g (MW121.4)

Nacl 8.775g

Tween20 0.5ml

封闭液〔含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液〕

脱脂奶粉〔国产，安怡牌〕 5g

TBST 100mL

溶解后4℃保存。运用时，复原室温，用量以盖过膜面

即可，一次性运用。

显影液

一小袋溶于250 mL DDW中，棕色瓶保存。

定影液

一盒溶于1000mL DDW，室温棕色瓶保存。

抗体

用封闭液稀释至必需浓度运用，每张膜需0.5ml。

ECL化学发光试剂

购自碧云天，分A和B两种试剂。

操作步骤：

（一） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦

洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干

净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

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1玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上

准备灌胶。〔操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。〕

2按前面方法配12％分别胶，参与TEMED后立刻

摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃

放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一

层水，液封后的胶凝的更快。〔灌胶时起先可快一些，胶

面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶必需要沿玻璃板

流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否那

么胶会被冲变型。〕

3当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再

等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水

吸干。

4按前面方法配5％的浓缩胶,参与TEMED后立刻摇

匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩

胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产

生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收

缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝

固的过程中要常常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手

分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。〔小玻

璃板面对内，大玻璃板面对外。假设只跑一块胶，那槽另

一边要垫一块塑料板且有字的一面面对外。〕

6测完蛋白含量后，计算含50g蛋白的溶液体积即

为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，参与5×SDS

上样缓冲液至终浓度为1×。〔上样总体积一般不超过

15l，加样孔的最大限度可加20l样品。〕上样前要将样

品于沸水中煮5min使蛋白变性。

7加足够的电泳液后起先准备上样。〔电泳液至少要

漫过内测的小玻璃板。〕用微量进样器贴壁吸取样品，将

样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢

参与样品。〔加样太快可使样品冲出加样孔，假设有气泡

也可能使样品溢出。参与下一个样品时，进样器需在外槽

电泳缓冲液中洗涤3次，以免穿插污染。

（3） 电泳

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电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用

60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进展转膜。

（二） 转膜

（1） 转一张膜需准备2张7.0～8.3cm的滤纸和1张

7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时必需要

戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸

纤维素膜置于转膜缓冲液中浸15min才可运用。

（2）

（3）

（4）

（5）

〔用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿

里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样

由于毛细管作用可使整个膜浸湿。假设膜沉入水

里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻挡膜吸

水。

在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块

海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

将夹子翻开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海

绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。〔一

手擀另一手要压住垫子使其不能随意移动。〕在垫

子上垫一层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其

中的气泡。

要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，

要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便起

先松动，直到撬去玻板。〔撬时必需要当心，玻板

很易裂。〕除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去

〔浓缩胶影响操作〕，要幸免把分别胶刮破。当心

剥下分别胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对

齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满

整个胶〔膜盖下后不行再移动〕并除气泡。在膜上

盖3张滤纸并除去气泡。最终盖上另一个海绵垫，

擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进展，

要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，

接触后会发生短路。〔转移液含甲醇，操作时要戴

手套，试验室要开门以使空气流通。〕

将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑

面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽

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的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或

40V转移3 h。

（6） 转完后将膜取出，可以看到预染Marker已经转印

到膜上了，这个过程要保证膜的潮湿，不能枯燥，

否那么会产生较强的非特异性。

膜一：

A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3

2

120kD

86kD

1

47kD

5

36kD

26kD

3

20kD

膜二：

A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3

120kD

6

7

86kD

47kD

4

36kD

26kD

20kD

1 Occluding 65kD

2 ZO-1 220kD

3 Claudin-1 22kD

4 Claudin-4 22kD

5 JAM-A 36-41kD

6 PKC 80kD

7 UGT 64kD

内参 βactin 42 kD

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分别将目的蛋白四周的膜切开，以DDW冲洗。分别参与

相应一抗。

（三） 免疫反响

（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的

平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度〔在1.5ml离心

管中〕；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于试验

（3）

（四）

（1）

（2）

台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将

抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用

滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液

面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育

1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两

次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵

育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两

次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进

展化学发光反响。

化学发光，显影，定影

将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；

1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；

1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包

好，放入X-光片夹中。

在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料

盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适

当大小〔比膜的长和宽均需大1cm〕；翻开X-光

片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能

移动，关上X-光片夹，起先计时；依据信号的

强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，

也可选择不同时间屡次压片，以达最正确效果；

曝光完成后，翻开X-光片夹，取出X-光片，快

速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻

终止显影。显影时间一般为1～2min〔20～

25℃〕，温度过低时〔低于16℃〕需适当延长显

影时间；显影完毕后，立即把X-光片浸入定影

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液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透亮为

止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾

干。

应留意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一

角，手指甲不要划伤胶片，否那么会对结果产生影响。

（五） 凝胶图象分析

将胶片进展扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目

标带的分子量和净光密度值。

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4. Changing history