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2024年12月29日发(作者：pgc全球总决赛奖金)
重要提醒：
SuperSignal West Pico化学发光底物是一个高敏感性的物质，
它比大多数化学发光产物（包括ECL,鲁米诺）都要敏感，为了
超敏感底物的最佳性能，抗体必须比其他使用的溶液浓度要稀。
如果你一直用以上的底物或者另外初级的化学发光底物，那么，
用此化学发光底物稀释一抗和二抗要5倍以上。例如，如果你用
ECL溶液的时候，以1：100稀释一抗。那么，你用SuperSignalWest
Pico溶液的时候，就要以1:500稀释。建议使用Table1的稀释
范围。
Table1. 用SuperSignalWest Pico化学发光底物的抗体稀释度。
一抗：1:1000-1:5000或者0.2-1.0ul/mL
二抗：1:20000-1:100000或者10-50ng/Ml
说明
Thermo Scientific SuperSignal West Pico化学发光底物是检
测辣根过氧化物酶标记的抗体的一种高度敏感性增强的溶液。这
种溶液能够强烈的检测到皮微克的抗原总量。信号的灵敏性、强
度、持续时间允许用摄影或其他的成像方法来检测辣根过氧化物
酶。免疫印记可以重复的曝光以获取最佳的结果，或者重新洗膜，
再敷上另一种抗体，检测另一种蛋白。
重要产物的信息
为了最好的结果，优化Western Blot中所有的组成部分是必不
可少的，包括样品总量、一抗及二抗的浓度、膜的选择、封闭液。
因为溶液是极端敏感的，所以SuperSignalWest Pico溶液比其
他市场上可以买得的液体来说，需要更少的样品总量、一抗及二
抗，通常减少10-20倍。同时应用Thermo Scientific
SuperSignal Western Blot增强剂可以使该溶液敏感性增强，
背景减少，抗体特异性提高。
抗体浓度要比用沉淀比色合系统的浓度更加稀释，为了选择最适
当的浓度，可以应用斑点印迹分析法。
没有任何一种封闭液是所有系统的最佳选择，所以对于Western
Blot的来说，实验检测是选择适合封闭液的必要步骤。选用适
合的封闭液有利于提高敏感性，以及防止抗体和封闭液之间非特
异性的交叉反应。此外，当把膜从一种溶液转入另一种溶液时，
由于没有选择适合的封闭液，会导致信号的消失以及背景的增
强。
当应用抗生素-生物素系统时，要避免用牛奶作为封闭液，因为
牛奶含有各种大量的内源性生物素。
用足量的洗涤缓冲液、封闭液、抗体溶液、底物工作液覆盖膜，
确保膜不会变干。大量的封闭液和缓冲液能够减少非特异性信
号。
为了最佳的结果，在抗体孵育时可以应用摇床。
当准备稀释所有的抗体以减少非特异性信号时，在封闭液中加入
TWEEN-20(最终浓度是0.05%)。仅用高质量的产品，例如Thermo
Scientific Surfact-Amps20(产品号28320)，这是一种放于安
培瓶中的纯化的清洁剂，并确保里面有少量的过氧化物和其他的
污染物。
不要用叠氮化钠作为缓冲液的防腐剂，叠氮化钠是辣根过氧化物
酶的抑制剂，干扰这个系统。
不要用手直接接触膜。要戴手套或用干净的镊子。
所有的设备必须是干净的，没有异物。金属器材（剪刀等）没有
肉眼可见的灰尘，灰尘可以导致黑点或者高背景。
底物工作液室温条件下可稳定24h，暴露于阳光下或者其他强烈
的光下可损坏工作液。为了最佳的结果，工作液置于琥珀色瓶子
里并避免任何强光长时间的照射。实验室灯光的短时间照射是不
损害工作液的。
我们提供各种转移蛋白的膜、封闭液、一抗、酶标记的二抗、缓
冲液、洗涤剂。对于我们的产品或者订购信息感兴趣的话，可以
访问我们的网页。
程序总结：
注意：抗原抗体浓度达到最优化，使用推荐的抗体稀释比例从而
可以一贯性地获得阳性结果，推荐的抗体比例可以参考
Additional Materials Required部分。
1. 将1mg/mL的一抗稀释至0.2-1.0μg/mL 或者 1:1000-1:5000
稀释；
2. 将1mg/mL的二抗稀释至10-50ng/mL或者
1:20,000-1:100,000稀释；
3. 将两种基础成分（即显影剂的A液与B液）按照1:1的比例
配成工作液；
注意：工作液暴露于太阳光或者其他任何强光下都会受到损害，
因此将工作液盛放于琥珀色瓶子中并且避免长时间暴露于强光
下，短期放置于实验室标准光下不会损伤工作液。
4. 将印迹膜放置于SuperSignal West Substrate工作液中孵育
5分钟；
5. 排干多余的试剂，使用干净的塑料薄膜覆盖印迹膜；
6. 在X-光下曝光
其他所需材料：
完整的Western Blot膜：用适当的方法用电泳分离蛋白质，并
把蛋白质转移至硝酸纤维膜上。其他类型的膜也可以应用；但是，
最佳的膜优先。
稀释缓冲液：用TBS（产品号28376）或者PBS（产品号28374）。
二者择其一，稀释SuperSignal Western Blot增强剂里的一抗，
以进一步增强敏感性和特异性，降低背景。
洗涤缓冲液：在1000mL稀释缓冲液中加入10%Tween-20 5mL。
（Tween-20最终的浓度是0.05%）
封闭液：100mL封闭液中加入10%Tween-20 0.5mL。用与稀释溶
液相同的基底成分配制封闭液。
一抗：选择对靶蛋白有特异性的抗体。用稀释缓冲液稀释1mg/mL
抗体的原液。用这种封闭液去配这种抗体原液的所有工作稀释
液。准备抗体稀释至1：1000～1：5000或者0.21ug/Ml。最佳
稀释浓度以特异性一抗和膜上抗原的总量而定 。
辣根过氧化物酶标记的二抗：选择针对一抗的辣根过氧化物酶标
记。把1mg/mL抗体稀释在缓冲液中。用这种缓冲液去配这种抗
体原液的所有工作稀释液。稀释浓度为1：20000～1：100000或
者10-50ng/mL。最佳稀释浓度与辣根过氧化物酶结合和膜上抗
原的总量而定。
放膜的暗盒、显影和定影：曝光机。
摇床：孵育时，摇晃膜。
Western Blot的详细步骤
1. 转膜之后，室温条件下，把膜放在封闭液中20-60分钟，以
阻止非特异性蛋白，要置于摇床上摇晃。注意：用前文提到
的其他所需材料中建议的抗体稀释浓度是非常重要的。
2. 倒出封闭液，敷上所需的一抗。置于摇床上，孵育1h。如果
需要的话，一抗孵育也可在2-8℃过夜。
3. 用洗涤缓冲液洗膜，置于摇床上，4-6次，每次大于等于5min。
增加清洗缓冲液的量或洗的次数能够降低背景。注意：在孵
育之前洗一下膜的话，将提高冲洗液的效率。用前文其他所
需材料中所提到的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释的建议是
很重要的。
4. 在室温条件下，用适合的HRP标记的二抗孵育1h，置于摇床
上。
5. 重复3步骤，移去非结合的HRP。注意：膜用HRP标记的二抗
孵育之后，必须彻底的清洗。
6. 定影液和显影液以1：1混匀制成显影定影液。1㎝²的膜需要
0.1mL的液体，显影定影液在常温下稳定24h。注意：暴露于
太阳下或者其他强光下都能损坏显影定影液。因此，应该置
于棕色瓶子，并避免长时间强光的照射。标准实验室灯光对
它没有损害。
7. 在显影定影液中敷5min。
8. 把膜从显影定影液中取出，放在两层塑料薄膜之间，这里可
以用塑料薄膜，也可以用塑料包装袋。用吸水薄膜吸取多余
的液体，除去膜与塑料薄膜之间的气泡。
9. 把膜置于显影的暗箱里，蛋白面向上。除了适合曝光的灯，
所有的灯都要关掉。注意:膜必须保持干，为了好的结果，做
到以下措施：①确保过多的溶液已从膜和塑料薄膜移除。②
在整个有关膜的操作过程中都要镊子。③不要弄脏膜，因为
有可能引起膜发生化学反应而减弱信号。
10. 在膜的顶端放一张胶片，建议第一次曝光时间为60s。为
了获得最好的结果，曝光时间是可以变的。增强的或者预照
射的胶片是不需要。注意:灯照射是强烈的，任何膜与胶片之
间的移动都会在胶片上形成伪迹。曝光时间是可变的。如果
信号太强的话，可以减少曝光时间，也可以通过减少抗原或
者抗体的浓度。显影定影液孵育之后，在第一个5-30min灯
照射是强烈的。灯照射会持续数小时，随着时间而强度会减
少。随着印记的老化，曝光次数时间的延长是必须的。
11. 用适当的显影和定影液洗胶片。如果有 需要的话，可以
重新洗膜，再重新敷抗体。
疑难解答
问题 可能原因 解决方法
胶片上图像颠倒（例如：用了太多的HRP(辣根过稀释辣根过氧化物酶标
白色条带黑色背景 ）
膜出现棕色或者黄色的
条带
在暗室中污点曝光
信号持续时间少于8小
时
弱或者无信号 ⑴太多的HRP消耗了显⑴稀释HRP至少10倍
影液，导致信号消失很快
⑵抗原或者抗体的数量⑵增加抗体或者抗原的
不足
氧化物酶) 记至少10倍
数量。用SuperSignal
⑶蛋白转移的数量不足 Western Blot增强剂（货
⑷HRP或者显影液的活性号46640）
降低 ⑶完善转膜步骤
⑷看下面的注意事项
高背景 太多的HRP 稀释HRP至少10倍
封闭不足
不适当的封闭液
冲洗不足
胶片过爆
优化封闭条件
试试不同的封闭液
增加洗涤液的时间、次
数、量
抗体或者抗原浓度过高 增加曝光时间或者用皮
抗体缺乏特异性 尔斯背景消除剂（产品号
21065）
减少抗原或抗体的量
用SuperSignal Western
Blot增强剂（货号
46640）
蛋白条带中有斑点 蛋白转运不足
膜上的水不均匀
膜与胶片之间有气泡
优化转膜步骤
按照制造商的建议湿润
膜
在曝光前，要移除膜与胶
片之间的气泡
胶片上的亮背景
杂带
在HRP中聚合物的形成 通过0.2um的滤过器滤
太多的HRP
出聚合物
稀释HRP至少10倍
SDS造成非特异性的蛋白在Western Blot过程中
带
抗体的特异性减弱
不要应用SDS
用SuperSignal Western
Blot增强剂（货号
46640）
在暗室中检测该显影液的敏感性，在干净的检测管中准备1-2ml
的SuperSignal Substrate工作液。关灯，加入1uL的HRP结合
物。这个溶液会立即发出一道蓝光，这种现象将在数分钟内消失。
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