消毒技术规范(2002版)概要

消毒技术规范

（2002版）

1.1 引言

根据《中华人民共和国传染病防治法》、《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和《消毒管理办法》制订本规范。本规范含总则、消毒检验技术规范、医疗卫生机构消毒技术规范和疫源地消毒技术规范四个部分。

1.2适用范围

本规范适用于在中华人民共和国境内生产、经营、使用和检验消毒产品的组织，医疗卫生机构以及传染病疫源地和其他一切需要消毒的场所。

1.3术语

1.3.1 消毒 disinfection

杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。

1.3.2 灭菌 sterilization

杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。

1.3.3 化学指示物 chemical indicator

利用某些化学物质对某一杀菌因子的敏感性，使其发生颜色或形态改变，以指示杀菌因子的强度(或浓度)和/或作用时间是否符合消毒或灭菌处理要求的制品。

1.3.4 生物指示物 biological indicator

将适当载体染以一定量的特定微生物，用于指示消毒或灭菌效果的制品。

1.3.5 消毒剂 disinfectant

用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。

1.3.6 灭菌剂 sterilant

可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。

1.3.7 高效消毒剂 high-efficacy disinfectant

指可杀灭一切细菌繁殖体（包括分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子等，对细菌芽孢（致病性芽孢菌）也有一定杀灭作用，达到高水平消毒要求的制剂。

1.3.8 中效消毒剂 intermediate-efficacy disinfectant

指仅可杀灭分枝杆菌、真菌、病毒及细菌繁殖体等微生物，达到消毒要求的制剂。

1.3.9 低效消毒剂 low-efficacy disinfectant

指仅可杀灭细菌繁殖体和亲脂病毒，达到消毒要求的制剂。

1.3.10 有效氯 available chlorine

有效氯是衡量含氯消毒剂氧化能力的标志，是指与含氯消毒剂氧化能力相当的氯量(非指消毒剂所含氯量)，其含量用mg/L或%浓度表示。（有效碘及有效溴的定义和表示法与有效氯对应）。

1.3.11 中和剂 neutralizer

在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。

1.3.12 中和产物product of neutralization

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指中和剂与消毒剂作用后的产物。

1.3.13 菌落形成单位 colony forming unit，cfu

在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。

1.3.14 自然菌 natural bacteria

在消毒试验中，指存在于某一试验对象上非人工污染的细菌。

1.3.15 存活时间 survival time， ST

用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本有菌生长的最长作用时间 (min)。

1.3.16 杀灭时间 killing time， KT

用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间 (min)。

1.3.17 D 值 D value

杀灭微生物数量达90%所需的时间(min)。

1.3.18 杀灭对数值 killing log value

当微生物数量以对数表示时，指消毒前后微生物减少的对数值。

1.3.19 杀灭率 killing rate， KR

在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值。

1.3.20 灭菌保证水平 sterility assurance level，SAL

指灭菌处理后单位产品上存在活微生物的概率。SAL通常表示为10-n。如，设定SAL为10-6，即经灭菌处理后在一百万件物品中最多只允许有一件物品存在活微生物。

1.3.21 疫源地消毒 disinfection of epidemic focus

对存在或曾经存在传染源的场所进行的消毒。

1.3.22 随时消毒 concurrent disinfection

有传染源存在时对其排出的病原体可能污染的环境和物品及时进行的消毒。

1.3.23 终末消毒 terminal disinfection

传染源离开疫源地后进行的彻底消毒。

1.3.24 预防性消毒preventive disinfection

对可能受到病原微生物污染的物品和场所进行的消毒。

1.3.25 无菌检验 sterility testing

证明灭菌后的物品中是否存在活微生物所进行的试验。

1.3.26 生物负载 bioburden

被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数。

1.3.27 暴露时间 exposed time

消毒或灭菌物品受到消毒因子作用的时间。又称作用时间、处理时间。

1.3.28 人员卫生处理 personnel decontamination

对污染或可能被污染人员进行人体、着装、随身物品等的消毒与清洗等除污染处理。

1.3.29 载体 carrier

试验微生物的支持物。

1.3.30 抗菌antibacterial

采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。

1.3.31 抑菌bacteriostasis

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采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。

1.4 消毒产品功效检验的基本原则和要求

1.4.1 消毒产品检验的基本要求

1.4.1.1 消毒实验室的基本要求

检验机构的微生物实验室应采取封闭式布局，建筑应便于清洁、消毒。为避免污染应在相对正压洁净条件下进行，但有时因特殊需要，用致病菌作指示菌时，则应在生物安全柜（负压）内进行。对无菌产品的无菌检查试验， 必须在100 级洁净度的实验室，或100 级层流操作柜中进行。

1.4.1.2 无菌操作的基本要求

（1）试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面，然后以紫外线或其他方法对实验室内空气进行消毒；

（2）实验人员应穿戴工作服、口罩、帽子；进行无菌检验时，需经风淋后进入实验室，然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽和口罩；

（3）每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）需在火焰上烧灼灭菌后，才可再次使用；

（4）要求无菌的试剂，如蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中和剂等，均需灭菌或过滤除菌；

（5）无菌器材和试剂，使用前须检查容器或包装是否完整，有破损者不得使用；

（6）正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中；

（7）移液或接种时，应将试管口和琼脂平板靠近火焰，防止污染；

（8）所有用过的污染器材，应立即放入盛有消毒液的容器中，以防止对周围环境和清洁物品造成污染；

（9）若不慎发生微生物培养物摔碎或其他试验微生物泄漏事故时，不论是否具有致病性，均应立即对污染及可能波及的区域进行消毒处理；

（10）全部试验结束后，应按常规对室内空气和环境表面进行消毒处理。

1.4.1.3 试验样品批次（件）的要求

（1）消毒剂样品，送检单位应送检3批样品，样品包装和标识应与拟销售产品完全相同，在理化试验时，需检测3批样品，每批取1个样品平行测定2次，取平均值报告结果。在杀灭试验时，取3批样品中含量最低者进行试验。在毒理试验中，取3批样品中含量最高者进行试验。

（2）消毒器械，送检单位应送检3件样品，大型器械可送检1件样品，标识应与拟销售产品完全相同。

（3）化学指示物、生物指示物、灭菌包装、卫生用品和1次性使用医疗用品，送检单位应送检3批样品。

1.4.1.4试验的基本要求

（1）依据申报单位提供产品研制报告和产品的使用说明书进行检验。

（2）用于评价消毒剂消毒效果的实验室试验应以悬液定量法为主，试验须重复3次。

（3）用于评价医疗器械灭菌的消毒剂和消毒器械灭菌的功能鉴定试验应用载体定性法，试验应重复5次。在无特殊要求的情况下，一般以不锈钢圆片为载体。

（4）对不宜用悬液定量法评价的消毒剂，如粘稠的消毒剂和冲洗消毒的消毒剂等的实验室试验用载体定量法，试验应重复3次。在无特殊要求的情况下，以布片为载体。

（5）评价消毒剂消毒效果的实验室试验，试验浓度要用产品说明书规定的该消毒剂对某

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一有代表性消毒对象的最低使用浓度。试验设3个不同作用时间，原则上第一时间为说明书规定的最短作用时间的0.5倍，第二时间为最短作用时间，第三时间为最短作用时间的1.5倍。对多用途的消毒剂，消毒对象所涉及的微生物相同时，若使用浓度相同，选择各种用途中最短的作用时间。若使用时间相同，选择各种用途中最低的使用浓度。使用浓度低，作用时间短者与使用浓度高和作用时间长者同时存在时，以前者为准。使用浓度高，作用时间短者与使用浓度低，作用时间长者同时存在时，每个剂量均须进行试验。

评价消毒剂灭菌效果的模拟现场灭菌试验，应用产品说明书规定的最低使用浓度和0.5倍的最短作用时间进行试验。评价消毒剂消毒效果的现场或模拟现场试验，应用产品使用说明书的最低有效浓度和最短作用时间进行试验。

（6）在对消毒剂进行监督监测时，定量杀菌试验的消毒剂浓度和作用时间选择消毒对象中抗力最强的微生物，以说明书规定的最低浓度和最短时间验证其消毒效果。对用于灭菌的消毒剂则以说明书中规定的使用浓度和其0.5倍的作用时间验证其灭菌效果。

（7）鉴定和监测多用途消毒剂与消毒器械消毒效果时，现场或模拟现场试验的消毒对象原则上是在类似物品中最难达到消毒合格者，如医疗器械消毒或灭菌选用止血钳；皮肤消毒选择人体前臂屈面皮肤；织物消毒选择棉布；一般物品表面（包括木质、塑料、橡胶、玻璃）消毒选择木质表面；餐具消毒选用竹(木)筷，不用于筷子消毒的可选用瓷质碗盘；地面消毒选择水泥地面；手消毒选择五指屈面；对于特指消毒对象而又在上述物品中不能选出有代表性物品时，则需用该特指对象进行试验。

（8）对于经过充分清洗的消毒对象专用的消毒剂，可按其使用方法，在杀菌试验时可减低干扰物的浓度。

1.4.1.5 消毒产品鉴定测试项目的确定

（1）有效成分含量的测定：有效成分系指具有杀菌作用的成分。所有化学消毒剂均应进行本项检测。所测含量在产品有效期内，不得低于企业标准的下限值。复方化学消毒剂测其杀菌主要成分的含量。植物消毒剂和用其提取物配制的消毒剂可不测定有效成分。

（2）pH 值的测定：所有消毒剂需测定消毒剂原液的pH 值，固体消毒剂应测定最高应用浓度的pH值。对于需调节pH后使用的消毒剂则应在pH调节剂加入前后分别测定pH值。

（3）稳定性试验：所有消毒剂均应进行稳定性试验，可用加速实验法37℃，90d和/或54℃，14d；也可选用室温留样法。以化学成分为主的消毒剂，用化学法进行稳定性实验；以植物为主要有效成分的消毒剂，用微生物法进行稳定性实验；以化学成分和植物为有效成分的消毒剂，同时用化学法和微生物法进行稳定性实验。

（4）金属腐蚀性试验：用于金属物品消毒的消毒剂应进行本项检测，试验浓度应选择最高使用浓度。

（5）微生物杀灭试验：所有消毒剂均应进行本项检测。试验前， 必须先按不同种类的试验微生物分别进行相应的化学中和剂或其它残留消毒剂去除法的鉴定试验，选出适宜的中和试验微生物以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌(Escherichia coli)8099作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 15442作为医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表；白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)8032作为空气中细菌的代表；龟分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacterium chelonae subsp. abscessus)ATCC 93326作为人结核分枝杆菌的代表；枯草杆菌黑色变种芽孢(Bacillus subtilis )ATCC 9372作为细菌芽孢的代表；白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231和黑曲霉菌(Aspergillus niger)ATCC 16404作为致病性真菌的代表；脊髓灰质炎病毒-Ⅰ型疫苗株(Poliovirus-Ⅰ)作为病毒的代表。

在上述规定的菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他

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菌、毒株。

不同用途的消毒剂和消毒器械，实验室杀灭微生物试验的代表微生物应按照表1-1所列者选择。若特指对某微生物有效时，则需进行相应微生物的杀灭试验。

对于专用于灭菌，不作它用的消毒剂，只需做枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭试验，可不做病毒、真菌、分枝杆菌及细菌繁殖体杀灭试验，但对既用于灭菌，又用于消毒的消毒剂则按上述要求选择相应微生物进行试验；对枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭达到消毒要求（杀灭对数值≥5.00）的消毒剂，在不低于此浓度用作消毒时可不作病毒、真菌和分枝杆菌杀灭试验。

表1-1

杀灭试验中微生物的选择

微 生 物 的 种 类

消毒对象

金黄色葡萄球菌

+

+

+

+

+

+

绿脓

杆菌

+

+

+

大肠

杆菌

+

+

+

+

+

白色念珠菌

+

+

+

+

黑曲

霉菌

+

白色葡萄球菌

+

龟分枝杆菌脓肿亚种

+

枯草杆菌黑色变种芽孢

+

脊髓灰质炎病毒

+

+

手

皮肤和黏膜

足

空气

医疗器械和用品(灭菌与高水平消毒)

医疗器械和用品

(中水平消毒)

医疗器械和用品

(低水平消毒)

一般物品表面

和织物

食(饮)具

饮水和游泳池水

瓜果、蔬菜

【注】表中‘+’为必做试验的微生物，消毒剂特指对某微生物具有杀灭作用者，则除按表中要求外，还需另选做该微生物杀灭试验。

（6）模拟现场试验与现场试验：根据不同消毒对象按如下要求选择模拟现场或现场试验:

用于、空气消毒的消毒剂须进行现场试验。

用于饮水、手、皮肤、一般物体表面消毒的消毒剂任选模拟现场试验或现场试验。黏膜消毒剂的模拟现场试验或现场试验可用皮肤代替。

用于食（饮）具、医疗器械和用品消毒的消毒剂进行模拟现场试验。其中医疗器械的模拟现场试验应区分消毒或灭菌。

1.4.1.6 消毒器械鉴定测试项目的确定

消毒器械应根据产品功能与用途要求选择以下项目进行检测。对器械、耐压或电气性能及关键部件的使用寿命等的鉴定，由相关行业计量认证考核合格的检验机构按其标准进行检测，提供检验报告。

（1）杀菌因子强度或浓度的测定

杀菌因子指消毒器械所产生的具有杀菌作用的物理或化学因子。物理因子包括热、微波、紫外线等。对物理杀菌因子应测定其规定杀菌条件下的强度，如对热力杀菌器械应测量其温度，对紫外线杀菌器材测定其辐照度值。化学因子则由消毒器械产生具有杀菌作用的化学物

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质，常见有次氯酸钠、臭氧、二氧化氯等，可测定所产生消毒液中有效成分的浓度。

（2）金属腐蚀性试验

主要检测杀菌器械所产生化学杀菌因子对金属的腐蚀性。其要求与消毒剂的金属腐蚀性试验相同。

（3）实验室杀灭微生物试验

用于消毒的器械，应采用定量杀灭试验;用于灭菌的器械应做定性杀灭试验。

（4）安全性试验

包括电器安全试验和消毒器械产生的化学因子的毒理学试验。

（5）模拟现场和现场试验

用于消毒及灭菌的器械均须进行模拟现场试验。消毒器械产生的化学因子按消毒剂的要求进行模拟现场或现场试验。空气消毒剂需用进行模拟现场和现扬试验。

1.4.1.7 消毒产品有效成分含量表示方法

有效成分含量以法定计量单位表示。复方消毒剂以其杀菌主要有效成分含量表示；植物消毒剂以百分浓度表示，如1份原液加4份水即该消毒剂溶液的浓度为20%。

1.4.1.8 对重复试验的要求

对所要求的重复性试验，并不是只在同次试验中增加菌片数，或多作几份样本，而是应分期分批进行。必要的器材和试剂应重新制备或灭菌，以防产生系统性误差。

中和剂鉴定试验，应将各组 3 次重复试验结果平行列出， 以便对比分析。

1.4.1.9 最终评价的要求

由于影响消毒与灭菌鉴定试验结果的因素很多，其中也包括试验的准确性和设计的科学性，所以在根据试验结果进行最终评价时应综合分析。除反复推敲试验过程和结果的准确性外，还应和国内外文献报导该消毒剂（消毒器械）的性能和不同试验方法所得结果进行比较，以判断所下结论有无不妥之处。如有不同于通常规律的结果，应重新考虑实验设计。如试验组距设置，消毒剂(器械)浓度(强度)测定和计算，实验条件(温度、湿度、pH值等)是否符合规定，特别要注意中和剂的选择试验是否符合要求等。必要时，还需要经过多种试验，多个实验室重复，查阅国内外文献，从各个角度证明，才能做出可靠的结论。

1.4.1.10 试验记录的要求

实验室对所进行的试验，必须按计量认证（或实验室认可）要求认真观察试验结果，作好原始记录。为使记录规范化，须用表格方式记录，表格中应包括样品名称与编号、检验日期、检测项目、检测依据、试验条件、使用仪器编号、观察结果、试验者和校核者签名等栏目。表格中每一栏目应用蓝黑或碳素墨水逐项填写。一次试验填写一份表格。原始记录数据和计算应及时校核，整理装订附于检验报告后，入档保存备查。

1.4.1.1 检测报告的要求

检测报告是试验情况和结果的书面表达，具有长期保存和法律价值，因此必须逐项填写清楚。因为技术规范或标准等的规定只写出共性部分，即使再详细亦难以包括所有情况和要求。各样品检测可能有其特殊性，因样品用途、用法不同，其检验条件和检验方法亦可随之改变，若检验报告中不说明其改变的情况，将会影响对所得结果做出准确的评价。凡是检验方法与本规范不一致或有更改者，必须详细叙述补充或删改的部分，以便阅读者了解检验工作的全过程，对检验样品的质量作出恰如其分的评价。

检验报告的结果部分，用表格将各试验组、阳性对照、阴性对照及其他对照组的数据列出（定性的对照可用文字加以说明）。试验组应列出其杀灭对数值，杀灭对数值≥5.00时，无须列出具体数值，当杀灭对数值≤5.00时，则应列出具体杀灭对数值。并用文字简要叙述所

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得的结果。

检验报告的结论部分，应根据试验结果得出明确的结论。

此外，对试验中出现某些异常现象亦应加以说明。

1.4.1.12 实用剂量的要求

日常消毒与灭菌中影响杀菌效果的因素较多，而实验室试验所规定的条件，均应控制在一个固定的范围之内，因此，需根据多种试验结果和实践经验确定。

杀菌剂量包含有两个参数，一是杀菌因子的强度，二是作用的时间。在确定实用剂量时需考虑的因素主要有：污染微生物的种类和数量；有机物的含量；杀菌因子的稳定性；环境的温湿度变化；腐蚀性的强弱；酸碱度；消毒对象的性质；允许使用的浓度；允许作用的时间；杀菌因子的穿透能力；对人体和环境的危害等。实用剂量应符合下列要求：

（1）申请检验单位应根据消毒产品的研制结果，针对不同用途，提出杀灭微生物有效、安全的实用剂量。

（2）实用剂量不低于模拟现场试验或现场试验所测得的结果。

（3）实用剂量应对人体和环境无危害，对物品无损害。

1.4.2 消毒产品理化检验基本要求

消毒剂配方中不能含有“消毒剂禁用物质”，也必须符合消毒剂限量物质要求。消毒剂有效成分必须符合我国允许的消毒剂组分。

1.4.2.1 标准品或对照品的纯度≥99.0%；用标准品或对照品进行标定过的标准溶液作为含量测定的对照物也可。

1.4.2.2 以滴定法分析有效成分时，滴定液用量不宜超过滴定管所标示的量。文内规定滴定时所取样本的质量或容量(包括浓度)，均根据此原则设定。若所测消毒剂浓度过高，可适当减少取样量或经稀释后测定，以减少测定结果的误差；若消毒剂浓度过低，可增加取样量或采用灵敏度更高的方法进行测定。

1.4.2.3 溶液或消毒剂的有效成分含量的表示，以mg/L或mg/kg为主。采用百分数表述含量时有下列2种含义：①液体和液体之间为体积百分数，用“%”表示，即100 ml溶液中含溶质若干ml，或100 ml消毒剂中含有效成分若干ml；②固体和固体之间为质量百分数，用“%”表示，即100 g消毒剂中含有效成分若干g；

对固体和液体之间采用质量浓度表示（mg/L、g/L等），即1L溶液中含溶质若干mg或g，或1L消毒剂中含有效成分若干mg或g等。

1.4.2.4 方法中所用试剂的纯度涉及基准、分析纯、化学纯及色谱纯等，未作专门说明者，一般采用分析纯。配制滴定液试剂 (如硫代硫酸钠)因配制后尚需专门处理，亦可用化学纯。

1.4.2.5 本规范中，“滴定液”是指经过标定，浓度准确至0.001 mol/L～0.0001 mol/L 的溶液。未经浓度标定者则称“溶液”，以示区别。摩尔(mole， mol) 为物质量的单位，当分子、原子或其它粒子等的个数约为6.02×1023时即为 1 mol。本规范中滴定液浓度的计算，除碘滴定液按原子量计算外，其它滴定液均按分子量计算。

1.4.2.6 滴定液的标定及所有样品测定均平行进行两次。将滴定管中滴定液补足至全量后滴定。所有试验结果(包括消毒剂有效成分测定及滴定液标定)应当以空白试验校正。所使用的滴定液应按要求在有效使用期内使用。

1.4.2.7 对仪器设备进行计量检定。玻璃仪器清洗干净，用蒸馏水冲洗3遍。所用容量瓶和量筒等不能加热。

1.4.2.8 容量分析实验室工作温度应控制在20℃～25℃。

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1.4.2.9 送检3批具有代表性的样品。每批取1个样品平行测定2次，取平均值报告结果。

1.4.2.10 粉剂和片剂的取样量为测定所需量的10倍，经研磨后精确称取适量样品进行测定。

1.4.2.11 如果选用色谱法或分光光度法，进行方法可靠性论证时应附空白样品（不含被测成分的其它成分所构成的样品）、模拟样品（空白样品加有效成分的标准品）以及待测样品的色谱图或光谱图。如果无法提供空白样品，可用加入标准量法进行方法可靠性的论证。

1.4.2.12对于本规范中测定方法不适用的产品，有效成分的测定，由厂家提供检测方法及方法可靠性的论证报告，经检验机构认可后方可采用。

1.4.3 消毒产品毒理学实验基本要求

为了确保消毒剂的安全性，消毒剂除在配方组分或杂质（污染物）含量方面必须达到国家有关部门颁发的相关技术法规或强制性标准对它们的禁用或限用的要求外，消毒剂还需进行相应的安全性毒理学评价。

1.4.3.1 消毒产品毒理学实验评价程序

消毒剂安全性毒理学评价，可分为4个阶段。

(1)第一阶段 (急性毒性试验、皮肤刺激试验和黏膜刺激试验)

1)急性经口毒性试验

2)急性吸入毒性试验

3)皮肤刺激试验

4)急性眼刺激试验

5)阴道黏膜刺激试验

6)皮肤变态反应试验

(2)第二阶段 (亚急性毒性试验和致突变试验)

1)亚急性毒性试验

2)致突变试验

① 体外哺乳动物细胞基因突变试验 (体细胞基因水平，体外试验)

L5178Y 细胞基因突变试验

V79 细胞基因突变试验

② 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 (体细胞染色体水平，体外试验)

③ 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 (体细胞染色体水平，体内试验)

④ 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 (体细胞染色体水平，体内试验)

⑤ 程序外 DNA 修复合成试验 (DNA水平，体外试验)

⑥ 小鼠精子畸形试验 (性细胞基因和染色体水平，体内试验)

⑦ 睾丸生殖细胞染色体畸变试验 (性细胞染色体水平，体内试验)

小鼠精原细胞染色体畸变试验

小鼠精母细胞染色体畸变试验

(3)第三阶段（亚慢性毒性试验和致畸胎试验）

1)亚慢性毒性试验

2)致畸胎试验

(4)第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）

1)慢性毒性试验

2)致癌试验

1.4.3.2 各种消毒产品毒理学试验的规定

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为便于对消毒剂进行毒理学评价，将消毒剂分为三类。

(1)第一类消毒剂：指我国首创或根据国内外文献报道首次生产的消毒剂。原则上需进行上述4个阶段的毒理学试验。首先必须做急性经口毒性试验(包括小鼠和大鼠)、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验和三项致突变试验(包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型试验)。根据试验结果，判断是否需继续做其它试验项目。

(2)第二类消毒剂：指国外已批准生产、现由我国首次生产或首次进口的消毒剂。首先必须做急性经口毒性试验、亚急性毒性试验和两项致突变试验 (包括反映基因水平和染色体水平两种类型试验)。根据试验结果，判定是否需继续做其它项目试验。

(3)第三类消毒剂：指与国内已获准生产的消毒剂属于同类的产品或植物成分组配的消毒剂。首先必须做急性经口毒性试验和一项致突变试验(反映体细胞基因水平或染色体水平类型的试验) ；若消毒剂（皮肤黏膜消毒剂）直接用于人体，并有可能重复接触的，还必须增做亚急性毒性试验。根据试验结果，判定是否需继续做其它试验。

(4)室内空气消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须做急性吸入毒性试验和急性眼刺激试验。视其试验结果，判定是否需做其它试验项目。

(5)手和皮肤消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须进行完整皮肤刺激试验。如果偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，采用一次完整皮肤刺激试验；如果每日使用或连续数日使用的消毒剂，采用多次完整皮肤刺激试验。接触皮肤伤口的消毒剂，还必须增做一次破损皮肤刺激试验；接触创面的消毒剂，应增做眼刺激试验。使用过程中，必需接触皮肤的其它消毒剂，也应增做完整皮肤刺激试验。根据消毒剂的成分，估计可能有致敏作用者，还需增做皮肤变态反应试验。

(6) 黏膜消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须做急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验。如果偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，采用一次阴道黏膜刺激试验；如果每日使用或连续数日使用的消毒剂，采用多次阴道黏膜刺激试验。

1.4.3.3 毒理学试验用消毒产品样品的规定

（1）受试样品必须是按照既定的生产工艺和配方进行规范化生产的消毒产品，其成分和浓度与实际生产和销售的相同。

（2）提供受试样品与毒性有关的物理、化学性质的资料，以及消毒剂的配方、主要成分的化学结构和含量、pH值等，但植物成分组配的消毒剂可不提供化学结构。

（3）进行安全性毒理学评价用受试物

根据不同毒理学试验的目的，采用相应的受试物。

1）在急性经口毒性试验、急性吸入毒性试验、亚急性毒性试验、致突变试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验、慢性毒性试验和致癌试验时，一般采用消毒剂原形样品。消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉剂、片剂或原液。对于二元或多元包装的消毒剂，以按比例混合配制后作为消毒剂原形。

2）在皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用受试物的浓度，通常是对皮肤、黏膜消毒时应用浓度的 5倍。使用原形（原液）对皮肤、黏膜进行消毒的消毒剂，则采用消毒剂原形（原液）作为试验受试物，不需对消毒剂原形再进行浓缩。

3）在皮肤变态反应试验时，采用的诱导浓度应为引起皮肤刺激反应的最低浓度或原液，激发浓度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液。

1.4.4 医疗卫生机构消毒、灭菌基本要求

1.4.4.1消毒因子作用的水平

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根据消毒因子的适当剂量（浓度）或强度和作用时间对微生物的杀灭能力，可将其分为四个作用水平的消毒方法。

（1）灭菌：可杀灭一切微生物（包括细菌芽孢）达到灭菌保证水平的方法。属于此类的方法有：热力灭菌、电离辐射灭菌、微波灭菌、等离子体灭菌等物理灭菌方法，以及用甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等消毒剂进行灭菌的方法。

（2）高水平消毒法：可以杀灭各种微生物，对细菌芽孢杀灭达到消毒效果的方法。这类消毒方法应能杀灭一切细菌繁殖体（包括结核分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子和绝大多数细菌芽孢。属于此类的方法有：热力、电力辐射、微波和紫外线等以及用含氯、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、含溴消毒剂、臭氧、二溴海因等甲基乙内酰脲类化合物和一些复配的消毒剂等消毒因子进行消毒的方法。

（3）中水平消毒法：是可以杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法，包括超声波、碘类消毒剂(碘伏、碘酊等)、醇类、醇类和氯已定的复方，醇类和季铵盐（包括双链季铵盐）类化合物的复方、酚类等消毒剂进行消毒的方法。

（4）低水平消毒法：只能杀灭细菌繁殖体（分枝杆菌除外）和亲脂病毒的化学消毒剂和通风换气、冲洗等机械除菌法。如单链季铵盐类消毒剂(苯扎溴铵等)、双胍类消毒剂如氯己定、植物类消毒剂和汞、银、铜等金属离子消毒剂等进行消毒的方法。

1.4.4.2 医用物品对人体的危险性分类

医用物品对人体的危险性是指物品污染后造成危害的程度。根据其危害程度将其分为三类：

（1）高度危险性物品：这类物品是穿过皮肤或黏膜而进入无菌的组织或器官内部的器材，或与破损的组织、皮肤、黏膜密切接触的器材和用品，例如，手术器械和用品、穿刺针、输血器材、输液器材、注射的药物和液体、透析器、血液和血液制品、导尿管、膀胱镜、腹腔镜、脏器移植物和活体组织检查钳等。

（2）中度危险性物品：这类物品仅和破损皮肤、黏膜相接触，而不进入无菌的组织内。例如，呼吸机管道、胃肠道内窥镜、气管镜、麻醉机管道、子宫帽、避孕环、压舌板、喉镜、体温表等。

（3）低度危险性物品：虽有微生物污染，但在一般情况下无害，只有当受到一定量的病原微生物污染时才造成危害的物品。这类物品和器材仅直接或间接地和健康无损的皮肤相接触，包括生活卫生用品和病人、医护人员生活和工作环境中的物品。例如，毛巾、面盆、痰盂（杯）、地面、便器、餐具、茶具、墙面、桌面、床面、被褥、一般诊断用品(听诊器、听筒、血压计袖带等)等。

1.4.4.3 微生物对消毒因子的敏感性

一般认为，微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序为：

（1）亲脂病毒（有脂质膜的病毒），例如乙型肝炎病毒、流感病毒等。

（2）细菌繁殖体。

（3）真菌。

（4）亲水病毒（没有脂质包膜的病毒），例如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。

（5）分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、龟分枝杆菌等。

（6）细菌芽孢，例如炭疽杆菌芽孢、枯草杆菌芽孢等。

（7）朊毒（感染性蛋白质）。

1.4.4.4 选择消毒、灭菌方法的原则

（1）使用经卫生行政部门批准的消毒药、械，并按照批准使用的范围和方法在医疗卫生

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机构和疫源地等消毒中使用。

（2）根据物品污染后的危害程度选择消毒、灭菌的方法。

1）高度危险性物品，必须选用灭菌方法处理。

2）中度危险性物品，一般情况下达到消毒即可，可选用中水平或高水平消毒法。但中度危险性物品的消毒要求并不相同，有些要求严格，例如内窥镜、体温表等必须达到高水平消毒，需采用高水平消毒法消毒。

3）低度危险性物品，一般可用低水平消毒方法，或只作一般的清洁处理即可，仅在特殊情况下，才作特殊的消毒要求。例如，在有病原微生物污染时，必须针对所污染病原微生物的种类选用有效的消毒方法。

（3）根据物品上污染微生物的种类、数量和危害性选择消毒、灭菌的方法

1）对受到细菌芽孢、真菌孢子、分枝杆菌和经血传播病原体（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等）污染的物品，选用高水平消毒法或灭菌法。

2）对受到真菌、亲水病毒、螺旋体、支原体、衣原体和病原微生物污染的物品，选用中水平以上的消毒方法。

3）对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品，可选用中水平或低水平消毒法。

4）对存在较多有机物的物品消毒时，应加大消毒药剂的使用剂量和/或延长消毒作用时间。

5）消毒物品上微生物污染特别严重时，应加大消毒药剂的使用剂量和/或延长消毒作用时间。

（4）根据消毒物品的性质选择消毒方法

选择消毒方法时需考虑，一是要保护消毒物品不受损坏，二是使消毒方法易于发挥作用。应遵循以下基本原则：

1）耐高温、耐湿度的物品和器材，应首选压力蒸汽灭菌；耐高温的玻璃器材、油剂类和干粉类等可选用干热灭菌。

2）不耐热、不耐湿，以及贵重物品，可选择环氧乙烷或低温蒸汽甲醛气体消毒、灭菌。

3）器械的浸泡灭菌，应选择对金属基本无腐蚀性的消毒剂。

4）选择表面消毒方法，应考虑表面性质，光滑表面可选择紫外线消毒器近距离照射，或液体消毒剂擦拭；多孔材料表面可采用喷雾消毒法。

1.4.4.5 消毒、灭菌基本程序

被甲类传染病病人，以及肝炎、结核、艾滋病、炭疽病等病人的排泄物、分泌物、血液等污染的器材和物品，应先消毒再清洗，于使用前再按物品危险性的种类，选择合理的消毒、灭菌方法进行消毒或灭菌处理。普通病人用过的物品，可先清洗后消毒。

1.4.4.6 消毒工作中的个人防护

消毒因子大多对人是有害的，因此，在进行消毒时工作人员一定要有自我保护的意识和采取自我保护的措施，以防止消毒事故的发生和因消毒操作方法不当可能对人体造成的伤害。

(1) 热力灭菌：干热灭菌时应防止燃烧；压力蒸汽灭菌应防止发生爆炸事故及可能对操作人员造成的灼伤事故。

(2) 紫外线、微波消毒：应避免对人体的直接照射。

(3) 气体化学消毒剂：应防止有毒有害消毒气体的泄漏，经常检测消毒环境中该类气体的浓度，确保在国家规定的安全范围之内；对环氧乙烷气体消毒剂，还应严防发生燃烧和爆炸事故。

(4) 液体化学消毒剂：应防止过敏和可能对皮肤、黏膜的损伤。

(5) 处理锐利器械和用具应采取有效防护措施，以避免可能对人体的刺、割等伤害。

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1.4.5 疫源地消毒基本要求

1.4.5.1 组织执行与人员

（1）对甲类传染病和肺炭疽、艾滋病等乙类传染病必须在当地疾病预防控制和监督机构的监督指导下，由有关单位和个人及时进行消毒处理，或由当地疾病预防控制和监督机构负责进行终末消毒。

（2）对乙类传染病中的病毒性肝炎、细菌性痢疾、伤寒和副伤寒、脊髓灰质炎、白喉、布鲁菌病、炭疽、钩端螺旋体病、流行性出血热、淋病、梅毒等和丙类传染病中肺结核，必须按照当地疾病预防控制和监督机构提出的卫生要求，由病人陪护人或所在单位进行消毒处理或由当地疾病控制机构组织进行消毒处理。

（3）对丙类传染病中的急性出血性结膜炎、感染性腹泻等由病人或其陪护人进行消毒处理。

（4）各类传染病(包括非法定传染病)爆发流行时应在当地疾病预防控制和监督机构的监督指导下，由有关单位及时进行消毒，或由当地疾病预防控制和监督负责对其进行消毒处理。

（5）在医院中对传染病病人的终末消毒由医院安排专人进行。

（6）非专业消毒人员开展疫源地消毒前应接受培训。

1.4.5.2 时限要求

接到甲类传染病疫情报告和乙类传染病中的肺炭疽和艾滋病的疫情报告后，城市应在6 h内，农村应在12 h内采取消毒措施，其他传染病按病种不同应在24h至48h内采取消毒措施。

1.4.5.3 装备要求

承担疫源地消毒任务的单位，应根据工作需要和条件配备消毒工具和防护用品，储备一定数量的消毒剂。

(1)消毒工具：背负式喷雾器、气溶胶喷雾器、机动喷雾器、配药桶（10L）、刻度量杯（筒）、工具箱、消毒车。

(2)防护用品：工作服、隔离服、防护眼镜、口罩、防鼠疫口罩、帽子、手套、长筒胶靴、毛巾、污物袋、手电筒、皮卷尺、雨衣、长柄毛刷、装工作衣的布袋（30cm×30cm×40cm）、肥皂盒、皮肤消毒盒（瓶）。

(3)消毒剂：储备一定量的消毒剂并与有关厂家建立联系，确保处理突发疫情的需要。常用消毒剂有过氧乙酸、含氯消毒剂、碘伏等。

1.4.5.4 技术要求

(1)疫区消毒

1)消毒范围和对象：以传染源排出病原体可能污染的范围为依据确定消毒范围和对象。

2)消毒持续时间：以传染病流行情况和病原体监测结果为依据确定消毒的持续时间。

3)消毒方法的选择：以消毒因子的性能、消毒对象、病原体种类为依据选择消毒方法。尽量避免破坏消毒对象的使用价值和造成环境的污染。

4)疑似传染病疫源地的消毒：可按疑似的该类传染病疫源地进行消毒处理或按下一条进行处理。

5)不明传染病疫源地的消毒：应根据流行病学指征确定消毒范围和对象，采取最严格的消毒方法进行处理。

6)注意与其它传染病控制措施配合：搞好传染源的管理，疫区的封锁、隔离，杀蝇、防蝇，灭鼠、防鼠，灭蚤，搞好饮用水、污水、食品的消毒及卫生管理，搞好环境卫生。加强易感人群的保护。

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7)填报消毒工作记录，必要时进行消毒效果评价。

(2)疫点的随时消毒

1)对病人应根据病情做到“三分开”与“六消毒”。“三分开”是指：①分住室（条件不具备可用布帘隔开，至少要分床）；②分饮食；③分生活用具（包括餐具、洗漱用具、便盆、痰罐等）。“六消毒”是指：①消毒分泌或排泄物（如呼吸道传染病主要为口鼻分泌物，肠道传染病主要为粪便，接触性传染病主要为脓液、痂皮等）；②消毒生活用具；③消毒双手；④消毒衣服、被单；⑤消毒患者居室；⑥消毒生活污水、污物。

2)病人陪伴和护理人员，除做好病人的随时消毒外，应做好本人的卫生防护，护理病人后，应消毒双手。

(3)疫点的终末消毒程序

1)在出发前，应检查所需消毒用具、消毒剂和防护用品，做好准备工作。

2)消毒人员到达疫点，首先查对门牌号和病人姓名，并向有关人员说明来意，做好防疫知识宣传，禁止无关人员进入消毒区域内。

3)对脱掉外衣应放在自带的布袋中（不要放在污染或可能受到污染的地方）。穿隔离服、胶鞋，戴上口罩、帽子。用过氧乙酸或含氯制剂时，须戴防护眼镜。

4)仔细了解病员患病前和患病期间居住的房间、活动场所，用过的物品、家具，吐泻物、污染物倾倒或存放地点，以及污水排放处等，据此确定消毒范围和消毒对象。根据消毒对象及其污染情况，选择适宜的消毒方法。

5)进入疫点时，应先消毒有关通道。

6)测量房屋、家具及地面需消毒的面积和体积，估算需消毒的污水量。

7)必要时，由检验人员对不同消毒对象进行消毒前采样。

8)消毒前应关闭门窗，将水缸盖好，将未被污染的贵重衣物、饮食类物品、名贵字画及陈列物品收藏好。

9)如系呼吸道传染病，应对室内空气进行消毒。

10)如系肠道传染病，应先于室内灭蝇，再进行消毒。

11)对室内地面、墙壁、家具和陈设物品消毒时，应按照先上后下，先左后右的方法，依次进行消毒。

12)病人用过的餐（饮）具、污染的衣物若不能集中在消毒站消毒时，可在疫点进行煮沸、浸泡或擦拭消毒。 作浸泡消毒时，必须使消毒液浸透被消毒物品。作擦拭消毒时，必须反复擦拭2次～3次。对污染重、经济价值不大的物品和废弃物，在征得病家同意后焚烧。

13)室内消毒后，必要时对厕所、垃圾、下水道口、自来水龙头、缸水和井水等进行消毒。

14)对传染源密切接触者进行人员卫生处理。

15)疫点消毒工作完毕，对消毒人员穿着的工作服、胶靴等进行喷洒消毒后脱下。将衣物污染面向内卷在一起，放在布袋中带回消毒。所用消毒工具表面用消毒剂进行擦洗消毒。

16)必要时，到达规定的消毒作用时间后，由检验人员对不同消毒对象进行消毒后采样。

17)填写疫点终末消毒工作记录。

18)离开病家前，让病家开窗通风，擦拭打扫。

(4)消毒人员注意事项

1）出发前，要检查应携带的消毒工具是否齐全无故障，消毒剂是否足够。

2）应主动取得病家合作和相关人员的配合。选择消毒因子时，应尽量采用物理法消毒。在用化学法消毒时应尽量选择对相应致病微生物杀灭作用良好，对人、畜安全，对物品损害轻微，对环境影响小的消毒剂。

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3）消毒过程中，不得吸烟、饮食。要注意自我保护，既要防止或减少受到消毒因子的伤害又要避免受到微生物感染。

4)消毒过程中，不得随便走出消毒区域，禁止无关人员进入消毒区内。

5)消毒应有条不紊，突出重点。凡应消毒的物品，不得遗漏。严格区分已消毒和未消毒的物品，勿使已消毒的物品被再次污染。

6)携回的污染衣物应立即分类作最终消毒。

7)清点所消耗的药品器材，加以整修、补充。

8)填好的消毒记录应及时上报。

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2.1消毒产品消毒效果检验技术规范

2.1.1 消毒剂杀微生物试验

2.1.1.1 适用范围

主要适用于消毒剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证，侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。

2.1.1.2 菌悬液与菌片的制备

2.1.1.2.1 适用范围

制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。

2.1.1.2.2 试验器材

（1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC 9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。

（2）有机干扰物：见附录A。

（3）磷酸盐缓冲液：见附录A。

（4）无菌蒸馏水。

（5）稀释液：见附录A。

（6）细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。

（7）革兰染色液：见附录A。

（8）芽孢染色液：见附录A。

（9）恒温水浴箱。

（10）玻璃漏斗。

（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。

（12）数字可调移液器（10μl， 20μl， 100μl，200μl，1000μl）及配套用一次性塑料吸头。

（13）离心机。

（14）电动混合器

（15）浊度计。

2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序

（1）细菌繁殖体悬液的制备

1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养 18h～24h。挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。

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2）取菌种第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0 ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。

3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。

4）细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。

5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

（2）细菌芽孢悬液的制备

1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5 ml～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养 18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养

18h～24h，即为第 3 代培养物。

2）用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3代～5代的18h～24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养 5d～7d。

3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。

改良芽孢染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃ 条件下，加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5% 沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。

4）罗氏瓶培养物，用10.0ml 吸管加10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。

5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中 24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。

6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块。

7）将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以3000 r/min 速度离心 30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。

8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。

9）将芽孢液放于80℃水浴中 10min（或60℃，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。

10）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。

11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

2.1.1.2.4 菌片的制备程序

（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为 10mm×10mm。 当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试

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管撞碎，故改用 12mm 直径圆形金属片（厚 0.5mm）。

（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30 min；②以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸 10min；④用蒸馏水漂洗至

pH 呈中性；⑤晾干、熨平备用。

（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。

（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。

染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经18h～24h培养的斜面培养物，细菌芽孢可使用4℃冰箱贮存液。含菌量约为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml，可使用浊度计调整菌液浓度。

滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内干燥（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。

（5）每个菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片。

2.1.1.2.5 注意事项

（1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告（如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量），必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。

（2）滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。

（3）细菌繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌在37℃干燥过程中，滴度最高可下降1个对数值。此时，应提高初始菌浓度，以便达到所需的菌量。

（4）配制菌悬液和制备菌片时，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。

（5）用带橡皮塞的容器保存菌液时，应将其预先煮沸10min 进行脱硫处理。

（6）制得的菌悬液和菌片，用毕应随时放入冰箱内，尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。

2.1.1.3 活菌培养计数技术

2.1.1.3.1 适用范围

测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。

2.1.1.3.2 试验器材

（1）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。

（2）稀释液：见附录A。

（3）营养琼脂培养基：见附录A。

（4）电动混合器

2.1.1.3.3 操作程序

本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。

（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含

5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。

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（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、等。

（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取 0.5ml加至 10-1 管内。

（4）将 10-1 管依前法用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），混匀，再吸取出0.5ml加入10-2

管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。

（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般需接种2个～3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。

（6）将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml～20ml。

（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。

（8）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。

（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。

（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度 3 个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。但对黑曲霉菌活菌计数及杀灭试验时，平板菌落数应在15cfu～100cfu之间。

对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果。

将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。

2.1.1.3.4 活菌计数中技术操作误差的测定

试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。

（1）平板间误差率计算公式：

平板间菌落数平均差平板间误差率100%

平板间菌落平均数

(平板间菌落平均数各平板菌落数)的绝对值之和

平板间菌落数平均差平板数

平板间菌落平均数

各平板菌落数之和

平板数（2）稀释度间误差率计算公式：

稀释度间菌落数平均差稀释度间菌落数误差率100%

稀释度间菌落平均数

(稀释度间菌落平均数各稀释度菌落数)的绝对值之和

稀释度间菌落平均差=稀释度数

稀释度间菌落平均数=

各稀释度平均菌落数之和

稀释度数—18—

2.1.1.3.5 注意事项

（1）严格无菌操作，防止污染。

（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。

（3）注意菌液的均匀分散。

（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。

（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。

（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。

（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。

（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 15cfu～300cfu 之间的平板。

（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。

2.1.1.4 残留消毒剂的去除方法

2.1.1.4.1 目 的

在化学消毒试验中，达到规定消毒时间终点时，要求立即终止残留消毒剂的继续作用，以便准确检测出消毒体系中残留存活的微生物及其数量。因为消毒体系中残留的消毒剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对杀菌效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。残留消毒剂的去除（下简称除药），可排除残留消毒剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。

2.1.1.4.2 除药的原则

（1）可有效去除残留的消毒剂。

（2）对微生物无害，不减少微生物应有的回收量。

（3）不破坏培养基的营养成份，不影响其透明度。

（4）必须按规定方法进行鉴定试验，并认为合格者方可在相应的消毒试验中使用。

2.1.1.4.3 除药的方法

（1）化学中和法：又称中和剂法，是指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。本法同时含有稀释作用效果（至少1:1稀释，常用1:10稀释），是最为普遍使用的方法。

对常用消毒剂，虽有一些中和剂介绍，但在实际应用中由于情况多变，效果不一定都理想。所以，在消毒试验前仍应将拟用中和剂按试验具体情况，经鉴定合格后再使用。

操作要点：①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中；②所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同；③即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；④在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。

（2）过滤冲洗法

将经消毒剂作用过的微生物样本，立即加入适量稀释液中混匀（通过适量稀释，可减轻消毒剂的持续作用），并倾入装有微孔滤膜的滤器内，接真空泵抽吸过滤（或加压过滤）后，再加适量稀释液冲洗，同时过滤，可去除残留的消毒剂。多用于难以找到适宜中和剂的消毒

—19—

剂试验中，如以植物提取物制备的消毒剂。本除药方法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。

操作要点：①准备好装有相应孔径微孔滤膜的滤器；②滤膜及滤器需先经灭菌处理；③初次过滤后，应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗，冲洗次数一般以洗净消毒剂为准；④最后一次冲洗、滤净后，将微孔滤膜以无菌操作法取出，进行随后的培养检测。

（3）稀释法

将经消毒剂作用过的微生物样本，用稀释液稀释，降低残留消毒剂浓度，以消除对微生物的抑制作用。但若稀释过多，微生物浓度下降，可出现假阴性结果。本法可单独使用，但更常见的是与其它方法同时使用。单独使用时，一般多用于浓度系数较高的消毒剂（如醇类消毒剂）。本法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。

操作要点：①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间后，即时以对微生物无害的稀释液稀释，稀释比例随试验需要决定；②电动混合或敲打振荡，使之混匀；③吸取稀释样液进行随后培养检测。

2.1.1.4.4 注意事项

（1）处理时应严守无菌操作要求，所有试液须无菌，接触样本和试液的器材（如吸管、平皿、试管、滤材等）亦均须经灭菌，以免污染样本，影响试验结果。

（2）每次吸液，均须更换一支无菌吸管，以防交叉污染。此点由于操作繁琐，器材需求量大，往往不能认真执行，应加以注意。

（3）为保证试验的准确性，所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近，不要用大吸管吸取少量液体；试验样本的混匀操作，必须认真进行；尽量减少中和剂或中和产物与试验微生物的接触时间。

（4）所用方法适宜与否，和消毒剂性质、复方中的附加成份、试验微生物种类、消毒试验种类等等均有关系，试验条件稍有改变就可能影响除药效果。故每进行一种消毒试验（包括消毒剂或微生物的更换），均需按规定对所选方法进行鉴定试验，合格者方可用于正式试验。此步骤绝不可省略，否则极有可能导致试验产生错误结果。

2.1.1.5 中和剂鉴定试验

2.1.1.5.1 目 的

确定所选中和剂是否适用于拟进行的细菌和真菌杀灭试验。

2.1.1.5.2 试验器材

（1）试验菌菌悬液和菌片（见 2.1.1.2）。

（2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。

（3）小平皿（4 cm～6cm 直径）。

（4）恒温水浴箱。

（5）稀释液：见附录A。

（6）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。

（7）电动混合器

2.1.1.5.3 试验设计原则

（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用细菌以及其恢复期培养是否有害或不良影响。

（2）在确定用何种中和剂进行鉴定试验有困难时，可对多个中和剂进行初选以确定（见本款文后【附】）。

（3）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低，则不足

—20—

以显示能否将高浓度消毒剂全部中和。

（4）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组（第2组）无菌生长，不能表明中和后受到消毒剂作用后的细菌是否能恢复生长。细菌是否复苏。此时可适当缩短作用时间重新进行试验，但作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。若缩短作用时间后仍无菌生长，在排除其他原因的基础上，可适当下调杀菌试验中消毒剂浓度，再次进行中和剂鉴定试验。

（5）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，应按微生物种类分别进行鉴定试验。对细菌繁殖体，在大肠杆菌（8099）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（ATCC

15442）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。

当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。

（6）鉴定时根据所用杀菌试验方法，使用相应的悬液或载体定量试验。

【附】中和剂初选试验

中和剂鉴定试验前，若难确定拟检测的中和剂，可通过本试验初选，而后以选中的中和剂进行正式的鉴定试验。初选操作程序如下：

（1）将0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～3×103 cfu/ml）加入含 4.5ml 中和剂试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。

（2）将0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～3×103 cfu/ml）加入含 4.5ml中和产物试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。

（3）试验同时设阳性对照组。阳性对照组以 0.5ml 菌悬液加入含 4.5ml 稀释液试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。

当3组平板上长出的菌落数接近，如果以阳性对照组为标准（X），前两组长菌数为（X±50%X）以内，可进行正式的鉴定试验。

2.1.1.5.4 试验分组

第1组 消毒剂 + 菌悬液 →培养

观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。

第2组 （消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养

观察残留消毒剂被中和后受到清毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。

第3组 中和剂 + 菌悬液 → 培养

观察中和剂是否抑菌。

第4组 （消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养

观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。

第5组 稀释液 + 菌悬液 → 培养

作为菌数对照。

第6组 稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养

作为阴性对照。

2.1.1.5.5 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序

根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将消毒剂按所需浓度配制好后，置20℃±1℃水浴中待用。

按2.1.1.2制备试验菌悬液。取2.0ml试验菌悬液于试管中，加入2.0ml有机干扰物质，制成含有机干扰物质的菌悬液，置20℃±1℃水浴中备用。

（1）第 1 组。吸取1.0ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中

—21—

5min 后，再吸加4.0ml消毒剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含有

4.5ml 稀释液的试管中，混匀。吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。

（2）第2组。吸取1.0ml含有机干扰物质试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min

后，再吸加4.0ml消毒剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和剂溶液管中，混匀，作用10min。吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。

如平板生长菌落数均超过 300 个，应以稀释液对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。

（3）第 3 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中

5min 后，加入0.4ml硬水，混匀。加入4.5ml中和剂，作用10min。用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（4）第 4 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中

5min 后，吸加4.9ml中和产物溶液（以0.4ml消毒剂加4.5ml中和剂，作用 10min 配制而成）于试管内，混匀。作用10min，吸取该最终样液 0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（5）第5组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中5min

后，吸加0.4ml硬水于试管内，混匀。加入4.5ml稀释液，作用 10min ，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（6）第 6 组。分别吸取稀释液、中和剂和硬水各1.0ml于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基25ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。

2.1.1.5.6 中和剂载体定量鉴定试验操作程序

根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。

（1）第1组。吸取消毒剂5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃±1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至试验预定的时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml稀释液试管中，作用10min。用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，吸取该最终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。

（2）第 2 组。吸取消毒剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至试验预定时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打80 次。作用10min，吸取该最终样液1.0ml，分别接种于各平皿中，做活菌培养计数。

如平板生长菌落数均超过 300个， 应重新吸取该最终样液 0.5ml，用稀释液做适当稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（3）第 3 组。吸取中和剂 5.0ml 于无菌小平皿中，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和剂内，作用 10min。立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0 ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打80 次，混匀。吸取该最终样液 1.0ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（4）第 4 组。 吸取中和产物溶液 （以一片浸有消毒剂的载体置 5.0ml 中和剂内，作用10min） 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用无菌镊子取出菌片，移入含 5.0ml 中和产物溶液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，

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用中和产物溶液做10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（5）第 5 组。吸取稀释液 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，

用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于稀释液中。作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用稀释液 做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，提示试验材料或操作过程中可能有污染。应重新进行试验。

2.1.1.5.7 评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

（1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长。

（2） 第 2 组有较第 1 组为多，但较第 3、4、5（组）为少的试验菌菌落生长，并符合表 2-1 要求者。

表 2-1 中和剂鉴定试验合格标准中对第 1 组与第 2 组菌落数的要求

第 1 组平板平均菌落数

0

X（1～10）

Y（>10）

第 2 组平板平均菌落数

>5

>（X + 5）

>（Y + 0.5 Y）

注：对抑菌作用不明显消毒剂（如乙醇）所用中和剂的鉴定试验中，当第 1 组与第 2 组菌落数相近，难以达到本表要求时，可根据具体情况另行作出判断和评价。

（3） 第 3、4、5（组）有相似量试验菌生长，悬液试验在1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml之间，载体试验在 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片 之间。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第3、4、5 组间菌落数误差率计算公式其计算公式如下。

(三组间菌落平均数各组菌落平均数)的绝对值之和组间菌落数误差率100%

3三组间菌落平均数

（4）第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。

（5）连续 3 次试验取得合格评价。

2.1.1.5.8 注意事项

（1）试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。

（2）严守无菌操作，保持试液和器材的无菌，注意更换吸管，以防止沾染影响试验的准确性。

（3）在计算微生物浓度时，须考虑其稀释倍数。

（4）试验组序应按本规范所列排列。

2.1.1.6 物理法去除残留消毒剂试验

2.1.1.6.1 目 的

通过本鉴定试验，确定常用的物理去除法是否可去除消毒体系中残留的消毒剂，使消毒剂鉴定试验显示出真正的杀菌效果。

2.1.1.6.2 试验器材

—23—

（1）过滤冲洗法需用经过灭菌处理的滤器、微孔滤膜、真空泵（或抽滤泵）。

（2）离心沉淀法需用离心机与离心管。

（3）吸附柱、分子筛柱（主要供病毒灭活试验用）。

（4）无菌稀释液、冲洗液。要求不应影响除药材料（如滤膜、吸附柱等）的性质，对微生物无伤害作用。常用的有：水、缓冲液（如PBS）、稀释液、含0.1%～0.5%吐温80的PBS、中和剂（可中和部分消毒成分）。

（5）其他器材随所用试验微生物而定。

2.1.1.6.3 试验设计原则

（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试消毒剂有良好的去除作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。

（2）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低不足以显示能否将高浓度消毒剂全部去除。

（3）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组无微生物生长，不能表明去除处理后细菌是否复苏。此时可增加处理时间或次数，亦可适当缩短作用时间再试。作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。

（4）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用物理去除消毒剂法应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得互相取代。对细菌繁殖体的试验，可在大肠杆菌（8099）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）或金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。

当用其他特定微生物 （如龟分枝杆菌脓肿亚种） 进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再次进行去除消毒剂方法的鉴定试验。

（5）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。

2.1.1.6.4 物理去除方法的鉴定

（1）分组方法如下：

1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养

观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制作用。

2）（菌悬液 + 消毒剂） + 过滤冲洗法处理 → 培养

观察所用去除消毒剂处理后，受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。

3）（菌悬液 + 水） ＋过滤冲洗法处理 → 培养

观察去除消毒剂处理是否影响试验菌的生长数量。

4）菌悬液 → 培养

作为菌悬液阳性对照值。

（2）操作程序如下：

1） 第 1 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂（应先置 20℃±1℃中水浴）于试管内，混匀，作用至试验预定时间。吸取该最终样液0.5ml，加于含4.5ml 稀释液试管中，混匀。吸取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数。

2） 第 2 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂于试管中，混匀。作用至试验预定时间，对其进行去除消毒剂处理，并取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。如平皿生长菌落数均超过300 个，应再吸取该最

—24—

终样液 0.5ml，用 PBS 做适当稀释，选择适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数。

3） 第 3 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml硬水于试管内，混匀。不加消毒剂，做同上处理。取最终样液 0.5 ml 用稀释液做 10 倍系列稀释，选择 2个～3个适宜稀释度悬液，各取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可先进行10 倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。

4） 第 4 组。吸取试验菌悬液 1.0ml，置含 4.0 ml 稀释液的试管中，不加消毒剂，亦不作任何去除处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。

（3） 评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数生长。

2） 第 2 组有远较第 1 组为多，但较第 3、4（组）为少的试验菌生长。在第 1 组无菌生长时，第 2 组平均每个平板 （或滤膜） 上生长菌落不少于 5 个。

3） 第 3、4 （组）测定的结果，微生物数量应在 1×107 cfu/ml～5×107

cfu/ml 之间，其组间差不得超过两组回收菌数平均值的50%。组间差的计算可按下式进行:

（两组间菌落平均数各组菌落平均数）的绝对值之和组间菌落数误差率100%

2两组间菌落平均数4）连续 3 次试验取得合格评价。

5）本规范推荐使用过滤冲洗法。

2.1.1.6.5 注意事项 见 2.1.1.5.8。

2.1.1.7 细菌定量杀灭试验

2.1.1.7.1 目 的

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢所需剂量，以验证实用消毒剂量。

2.1.1.7.2 试验器材

（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，准备其他菌种的悬液或菌片。

（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以试验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度为准。

（3）去除残留消毒剂的中和剂或设备 （经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材）。

（4）消毒剂稀释用硬水：见附录A。

（5）有机干扰物质。悬液试验用3%BSA溶液，载体试验直接用TSB(见附录A)。

（6）TSA培养基：见附录A。

（7）含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（中和剂TSB），中和剂经鉴定合格。

（8）刻度吸管 （1.0ml、5.0ml）。

（9）恒温水浴箱。

（10）喷雾器（用于喷雾消毒试验）。

—25—

（11）电动混合器。

（12）秒表。

2.1.1.7.3 试验分组

试验中应分以下各组：

（1）试验组。按测试目的有两种选择。

第一种适用于消毒产品鉴定。根据本规范中表1-1和使用说明书，选定试验菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及3个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最低作用时间的1.5倍。如说明书指定最短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。

第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及一个作用时间（说明书指定最短作用时间）进行试验。

（2）阳性对照组。根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数的初始浓度。

2.1.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序

（1）首先按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），置20℃±1℃ 水浴备用。

（2）按照2.1.1.2 配制实验用菌悬液，浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。

（3）取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。

（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验菌与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。

（5）各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

（6）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。

（7）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

（8）试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:

杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。

2.1.1.7.5 载体浸泡杀菌试验操作程序

（1）载体浸泡定量杀菌试验操作程序

1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

2）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的

—26—

菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。

3）待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，吸取 1.0ml 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。

4）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。

5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

6）试验重复 3 次 （包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。

（2）载体浸泡定性灭菌试验操作程序

1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片5.0ml的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

2）将盛有消毒剂平皿置20℃±1℃水浴箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片6片，（每个作用时间2片菌片）并使之浸透于消毒液中。

3）待试验菌与消毒液相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含5.0ml中和剂TSB试管中。用电动混合器混合20s，作为试验组样本。

4）另取一平皿，注入20.0ml硬水代替消毒液，放入4片菌片，作用至预定时间，取出2片，分别移入含5ml中和剂TSB试管中。其随后的试验步骤与上述试验组相同，作为阳性对照组样本。另取出2片，分别移入一含5.0ml中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲80次，然后用稀释液做10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸取1.0ml接种平皿，每管接种2个平皿，做活菌培养计数，作为菌数对照组样本。

5）所有试验样本均在37℃温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h，观察最终结果；对细菌芽孢需培养7d，观察最终结果。

6）试验重复5次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片）。

2.1.1.7.6 载体喷雾定量杀菌试验操作程序

（1）根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最低作用时间的1.5倍。如说明书指定最短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。

（2）选定消毒剂的浓度与作用时间。每种菌所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。

（3）每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。

（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml

中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。

（5）吸取 1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种 2 个平皿。

（6）每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒

—27—

剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。

（7）用硬水代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，作为阳性对照组。如为压力罐装自动喷雾式气雾消毒剂，可直接用染菌载体作活菌计数，作为处理前阳性对照组。

（8）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

（9）试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。

2.1.1.7.7 定量杀菌试验的评价规定

（1）产品监督检验，在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验3次。要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定为消毒合格。要求载体定量杀灭试验，各次的杀灭对数值均≥3.00，可判定消毒合格。

（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3作用时间，重复试验3次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应≥5.00。要求载体定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均应≥3.00，可判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可容许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。

（3）对载体浸泡定性灭菌试验，阳性对照组应有菌生长，菌数对照组符合要求，阴性对照组应无菌生长，5次试验所有作用时间均无菌生长为灭菌合格。

（4）报告中应将各此试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次试验菌浓度，以及平均试验菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。

2.1.1.7.8 注意事项

（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。

（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。

（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。如果某消毒剂使用说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。

2.1.1.8杀灭分枝杆菌试验

2.1.1.8.1 目的

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上分枝杆菌所需剂量，以验证对分枝杆菌（包括结核杆菌）实用消毒剂量。

2.1.1.8.2 试验器材

(1) 试验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326。

(2) 培养基 分枝杆菌干燥培养基(上海奥普生物医药有限公司)。

(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备。

(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。

(5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液。

(6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。

(7) 有机干扰物质：见附录A。

(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

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(9) 恒温水浴箱。

(10) 喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。

(11) 电力混合器。

(12) 计时装置。

(13) 恒温培养箱。

2.1.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326 菌悬液的制备

（1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0mlMADC肉汤或罗氏肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，于 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于 37℃ 培养 72h，即为第3代培养物。密封后，在4℃保存，时间不得超过6周。

（2）试验时取第3代斜面培养物，在分枝杆菌琼脂斜面上连续传代，培养方法与第3代相同。取第5代～6代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml

稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至一含有6-7g玻璃珠的无菌圆锥底试管中，在电动混合器混合至少5min。然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。

（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。

（4）菌悬液保存在4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。

2.1.1.8.4 试验分组

试验分为下列各组:

(1) 试验组，按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。

(2) 阳性对照组， 以硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。

(3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。

2.1.1.8.5 试验程序

常用杀灭试验有: 悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.1.7.4，2.1.1.7.5，2.1.1.7.6。接种后的平皿应放入干净的塑料袋内，在37℃中培养1周，观察最终结果。

2.1.1.8.6 评价规定

(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均 ≥4.00 ，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对分枝杆菌污染物消毒合格。

(2)产品鉴定检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3

次，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。

用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定的使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为试验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。

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2.1.1.9 真菌杀灭试验

2.1.1.9.1 目的

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子所需剂量，以验证对真菌及其孢子实用消毒剂量。

2.1.1.9.2试验器材

(1) 麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。

(2) 沙堡琼脂培养基：见附录A。

(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备

白色念珠菌ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子悬液与菌片按 2.1.1.9.3(1)

和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。

此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或孢子悬液与菌片。

（4）中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。

（5）磷酸盐缓冲液( PBS， 0.03 mol/L，pH7.2)。

（6）消毒剂稀释用硬水：见附录A。

（7）有机干扰物质：见附录A。

（8）刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

（9）恒温水浴箱。

（10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。

（11）电动混合器。

（12）计时装置。

2.1.1.9.3 真菌悬液制备

（1）白色念珠菌悬液的制备

1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过6周。

2）试验时，取第3代斜面培养物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。

3）悬液杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为1×107cfu/ml～5×107cfu/ml；菌片制备按2.1.1.2 要求进行。

4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。

5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。

（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。

1) 取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取少量麦芽浸膏肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含5.0ml麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。用接种环划线接种第1代培养物于MEA培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于

—30—

麦芽浸膏营养琼脂斜面培养基，置 30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h，即为第3代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过9周。

2) 试验时，取第3代斜面培养物接种麦芽浸膏琼脂斜面，30℃培养48h，取得3.0~5.0ml麦芽浸膏肉汤，洗下斜面上的培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后吸弃多余肉汤培养物液体，置 30℃±1℃ 培养 7d～9d。

3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后，滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。

4) 黑曲霉分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。

5) 使用时，可用稀释液适当稀释。悬液试验时实验用菌悬液的含菌量为1×107

cfu/ml～5×107 cfu/ml。

6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10μl。染菌后，置 37℃ 培养箱内干燥(约 30min)，或置室温下自然阴干后再使用。

7) 回收菌数应达5×105cfu/片～5×106cfu/片，可依试验要求确定。

2.1.1.9.4 试验分组

试验分为下列各组:

(1) 试验组，按2.1.1.7.3规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。

(2) 阳性对照组，以硬水代替消毒剂溶液，按2.1.1.7.3规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。

(3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。

2.1.1.9.5 试验程序

常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体喷雾定量杀菌试验等。培养基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见 2.1.1.7。

活菌培养计数时，对白色念珠菌，在37℃培养箱中培养48h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃培养箱中培养72h观察最终结果。

2.1.1.9.6 评价规定

(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对真菌污染物消毒合格。

(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最低作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。

用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为实验室试验

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该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。

2.1.1.9.7 注意事项

(1) 黑曲霉菌试验操作应在 Ⅱ 级生物安全柜内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。

(2) 其它注意事项见 2.1.1.7.8。

2.1.1.10 病毒灭活试验

2.1.1.10.1 适用范围

主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技

术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。

2.1.1.10.2 试验器材

（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1

型（HIV-1）美国株。

（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。

（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。

（4）恒温水浴箱。

（5）二氧化碳培养箱。

（6）层流超净工作台。

（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。

（8）液氮罐。

（9）倒置显微镜。

（10）离心机。

（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。

（12）细胞维持培养基：见附录A。

（13）细胞完全培养基：见附录A。

（14）去离子水。

2.1.1.10.3 病毒悬液的制备

（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。

（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。

（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。

（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。

2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法

—32—

（1）终点稀释法病毒感染滴度的计算

以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。

TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例

（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”）。

具体计算方法如下：

1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。

各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表 2-2〕。

2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：

高于50%组的病变率50

距离比例高于50%组的病变率低于50%组的病变率

3）计算举例

设试验数据如表 2-2

样本

稀释度

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

对数值为6。

表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果

接种 细胞病变 累积值 病变比

孔数

4

4

4

4

4

-

0

0

1

3

4

+

4

4

3

1

0

细胞病变(-)

0

0

1

4

8

细胞病变(+)

12

8

4

1

0

12/12

8/8

4/5

1/5

0/8

病变率（%）

100

100

80

20

0

本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度距离比例

80500.5

8020TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5

（2）噬斑法病毒感染滴度的计算

噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。

每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数

（3）平均灭活对数值的计算

平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。

—33—

平均灭活对数值 = log No－log Nx

2.1.1.10.5 残留消毒剂化学中和法的鉴定试验

（1）目 的

本鉴定试验只在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。

（2）试验设计原则

1） 通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。

2） 根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。

3） 中和试验用药物浓度应为正式消毒试验最高浓度。作用时间最短不得少于30s。

（3）试验分组

在使用细胞感染法进行病毒灭活试验时，对所用中和剂的鉴定，应进行以下各组试验。其中，先进行预备试验中的第 1组～3 组试验，如中和剂与中和产物对细胞生长无影响，再进行以下的正式试验。

预备试验:

1）中和剂 + 细胞 → 培养

观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。

2）（消毒剂 + 中和剂）+ 细胞 → 培养

观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。

3）（消毒剂 + 细胞）→培养

观察消毒剂对细胞生长有无影响。

正式试验:

1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养

观察所试消毒剂对病毒有无抑制或灭活作用。

2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 中和剂 → 接种细胞培养

观察残留消毒剂被去除后，病毒是否可恢复对细胞的感染作用。

3）中和剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养

观察中和剂对病毒有无抑制作用。

4）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 → 接种细胞培养

观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。

5）病毒悬液 → 接种细胞培养

观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。

6）未接种病毒的细胞 → 培养

观察其生长是否正常。

（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序

根据试验分组，准备足量有关器材，依次摆放，进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。各组每吸一次试剂或样本，即应更换一次吸管或微量移液器吸头，以防相互污染。

1）预备试验第 1 组。 将试验用细胞，分别加入不同稀释度的中和剂溶液，作用3 h～4h

后，吸去液体，另加细胞维持培养液，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

2）预备试验第 2 组。将试验用细胞， 分别加入不同稀释度中和产物溶液作用3h～4h 后，

—34—

吸去中和产物溶液，另加细胞基础培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

3）预备试验第 3 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的消毒剂，作用 3h～4h后，吸去消毒剂，另加细胞维持培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

4）正式试验第 1 组。吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中

5 min 后，吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验预定的灭活病毒时间，加入1.0ml去离子水，根据试验规定量，吸取该最终样液 （或以对病毒无害的稀释液作系列稀释），进行随后的病毒滴度测定。

5）正式试验第 2 组。吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中

5min 后，再吸加 0.5ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，加入 1.0ml 中和剂溶液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。

6）正式试验第 3 组。吸取 0.5 ml 去离子水于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用10 min，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。

7）正式试验第 4 组。吸取双倍浓度消毒剂 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min

后，加入 1.0ml 中和剂，再吸加 0.5ml病毒悬液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。

8）正式试验第 5 组。吸取去离子水 1.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。

9）正式试验第 6 组。将试验用细胞，加细胞维持培养液后，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

10）本试验中对各种病毒的接种和检测操作技术，若无特殊要求，按病毒学中各种病毒的常规培养和检测方法进行即可。

（5）评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

1）正式试验中第 1 组无试验病毒，或仅有少量试验病毒生长。

2）正式试验中第 2 组有较第 1 组显著为多，但较第 3、4、5（组）显著为少的试验病毒生长。

3）正式试验中第 3、4、5（组）病毒生长与原接种量相近。

4）正式试验中第 6 组细胞生长正常。

5）预备试验结果显示，中和剂和中和产物，在正式试验的最高浓度下对细胞生长无影响。

6）连续 3 次试验取得合格评价。

（6）注意事项

病毒载体中和试验法可参照上述悬液定量中和试验程序，并按照病毒学原理进行适当修改后使用。

2.1.1.10.6 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验

病毒灭活试验中的物理除药法，首先稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。

（1）分 组

1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种培养

观察所试消毒剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响。

2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 除药处理 → 接种培养

观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。

—35—

3）病毒悬液 + 除药处理 → 接种培养

观察除药处理对病毒滴度有无影响。

4）病毒悬液 → 接种培养

观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。

5）未接种病毒的细胞 → 培养

观察细胞生长是否正常。

（2）悬液定量操作程序

1）第 1 组。吸取消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml

病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该最终样液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

2）第 2 组。吸消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本 （或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

3）第 3 组。吸取病毒悬液 0.1ml，加 0.9ml细胞基础培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

4）第 4 组。 吸取病毒悬液 0.1 ml， 加细胞维持液 0.9ml，不加消毒剂亦不做任何除药处理。根据试验规定量，吸取该病毒悬液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

5）第 5 组。 向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。

（3）评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格:

1）第 1 组无试验病毒，或仅有少量生长。

2）第 2 组有远较第 1 组为多，但明显较 3组～5组为少的试验病毒生长。

3）第 3、4、5 （组）试验病毒生长量相近。

4）连续 3 次试验取得合格评价。

5）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。

2.1.1.10.7 脊髓灰质炎病毒灭活试验

（1）目的

测定消毒剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，以验证病毒污染物消毒实用剂量。

（2）实验原理

用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。

（3）试验分组

1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。

2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。

3）阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。

（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序

—36—

1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。

2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒株，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。

3）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。

4）取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。

5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。

6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。

7）试验重复3次。

8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。

终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。

9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。

接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml待测样品，放置37℃吸符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶，放置37℃培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml甲醛溶液固定数分钟，用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：

pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数

注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。

（5）平均灭活对数值的计算

平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。

平均灭活对数值 = log No－log Nx

（6）评价规定

1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到4个对数值。

2）在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7 之间。

（7）注意事项

—37—

1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。

2）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。

3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。

2.1.1.10.8 艾滋病病毒灭活试验

（1）目 的

测定消毒剂对艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）灭活所需的剂量，以验证对该病毒污染物消毒实用剂量。

（2）实验原理

用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。

（3）安全防护

试验中要求采取严密防护措施。我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级（biological safety level 3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的安全防护措施。 在 HIV 灭活试验时，必须严格按照有关安全规定进行。

（4）试验分组

1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量（药物浓度与作用时间）。

2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。

3）阴性对照组。 用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。

4）消毒剂对细胞毒性组。取 100μl 待测消毒剂，加入含有100μl 用完全培养基制备的MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/ml）的 96 孔培养板内。置二氧化碳温箱（37℃）中培养

7 d，观察细胞生长情况，确定消毒剂对细胞无毒性的最高稀释度。

（5）HIV 悬液定量灭活试验操作程序

1）从液氮中取出冻存的 MT4 细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有 10ml 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞对数生长期时收获细胞用于消毒试验。

2）从液氮中取出冻存HIV-1毒种，接种于含10ml细胞悬液（含细胞700 000个/ml～800 000个/ml）培养瓶中。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管 0.5ml 分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。如不能立即离心，可暂将培养瓶冷冻保存于-20℃，并争取尽快离心分装。

3）取待测消毒剂，用无菌去离子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀释。视消毒剂的类型和实验目的，确定最高稀释度。为防止污染培养液，必要时在试验前需将消毒剂过滤除菌。

4）取 50μl 待检消毒剂，与 50μl 病毒原液混合。在规定温度作用一定时间（根据试验要求确定作用时间和温度），立即加入0.9ml 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（400 000 个/ml），在37℃，放置 40min，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂；消毒剂对细胞毒性组试验中，用无菌去离子水代替病毒。

5）取出反应管，立即采取去除残留消毒剂处理。处理可用物理去除法或中和剂法（所用方法需先经试验证明，既可有效去除残留消毒剂，又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用。

—38—

6）在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量。先在培养板（96孔）的各孔中，加入 100μl

用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞 400 000 个/ml）。同时，用完全培养基对待滴定样本做 1：10 系列稀释，然后取 100μl 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的 96孔培养板内。每个稀释度做 4 孔。

7）将按上述程序加液的 96 孔培养板，放入二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2），逐日在显微镜下观察细胞病变。被感染细胞融合肿胀，出现多核巨细胞。 第 4 d，在各反应孔内补加 50μl 新鲜完全培养基。第7d，逐孔观察并记录细胞病变情况。

8）试验重复 3 次。

（6）评价规定

1）对测试滴度的HIV，3次灭活试验后均应不再检出，此时的灭活对数值应≥4.00，可判为该消毒剂浓度与作用时间，对HIV污染物消毒的实验室试验合格。

2）在正常情况下，HIV阳性对照组病毒感染滴度（TCID50）对数值应在5～7之间。阴性对照组宿主细胞生长良好，并且无HIV 检出。所用浓度的消毒液对宿主细胞生长无不良影响。否则，根据发现的问题，或调整 HIV悬液浓度，或选择适宜消毒液浓度，或更换污染试剂和培养基，或改进其他有关条件后，重做试验。

（7）注意事项

1）操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验，必须绝对遵守BSL3实验室的安全制度。身体状态欠佳，或有伤口时，应暂时停止工作。

2）有感染可能性的操作，均应在BSL3实验室的层流负压超净工作台中进行。

3）一旦发生事故，有病毒感染或污染环境的可能时，切莫惊慌，除立即进行妥善消毒处理外，并应尽快报告实验室和单位领导。

4）本试验周期较长，在全部过程中应注意防止样本污染。

2.1.1.11 能量试验

2.1.1.11.1目的

测定连续加入细菌悬液对消毒剂杀菌作用的影响， 以验证该消毒剂用于多次消毒污秽物品(含较多有机物)，如浸洗拖布的消毒液、浸泡污染医疗器械的消毒液、浸泡洗手消毒液等实用剂量。

2.1.1.11.2 试验器材

(1) 试验菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 大肠杆菌 8099 铜绿假单胞菌 ATCC 15442

(2)磷酸盐缓冲液 (PBS，0.03mol/L，pH值7.2～7.4)。

(3)标准硬水(硬度为 342mg/L)：见附录A。

(4)含中和剂营养肉汤培养基 (所用中和剂应为经试验鉴定合格者，见 2.1.1.5)。

(5)细菌定量杀灭试验所用器材 (见 2.1.1.7.2)。

2.1.1.11.3试验程序

(1)试验用菌悬液配制 选择上述试验菌中对所试消毒剂抗力强者作为试验菌， 配制菌悬液。用标准硬水将酵母粉配成50mg/L 溶液 (pH值6.9～7.1)。然后，吸取试验菌新鲜营养肉汤24h 培养物6.0ml，加于含 4.0ml酵母液试管中，混匀。依此配制成的菌悬液，所含菌量应为 106 cfu/ml～107cfu/ml。

(2)将待测消毒剂用硬水稀释成A(1.5x)、B(x)、C(0.5x) 等3 个浓度的消毒液 (括弧中的

“x” 代表杀菌试验所得有效浓度)， 各取 3.0ml 分装于无菌试管内。

—39—

(3)第 1 次，取试验菌悬液 1.0ml 加入到第 1 管 A 浓度消毒剂溶液内，立即混匀。

(4)在 A 管加菌悬液后8min，分别吸取A管内混合液20μl移种至A组的第1批5支盛有5.0ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。

(5)在第1 次加菌悬液后10min，第2次取1.0ml菌悬液加入到A浓度消毒剂管内，立即混匀。

(6)在第2次加入菌悬液后8min(即第1次加菌悬液后18min) 时，分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第2批5支盛有5ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。

(7)在第2次加入菌悬液后10min(即第1次加菌后20min)，取1.0ml 菌悬液加入到 A 浓度消毒剂管内，振摇混匀。

(8)在第3次加入菌悬液后8min(即第1次加入菌液后28min) 时， 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至A组的第3批5支盛有5ml 含中和剂的营养肉汤培养基管中。

(9)B(x)、C(0.5x)两浓度药液的试验内容和操作程序，与上述A浓度者相同。3个稀释度消毒药液同一批进行操作时，可按表2-3 规定的时间和顺序进行。

表2-3 能量试验操作时间

加菌与移种次序 各浓度组操作时间(第 X min)

A B C

第 1 次加菌

第 1 次移种(5 管)

第 2 次加菌

第 2 次移种(5 管)

第 3 次加菌

第 3 次移种(5 管)

0

8

10

18

20

28

1

9

11

19

21

29

5

13

15

23

25

33

(10)以2支含5ml中和产物 (用同次试验所用消毒剂与中和剂配制) 的营养肉汤培养基管，加入5μl试验菌液，作为阳性对照。

(11)以2支含 5ml与上相同的中和产物的营养肉汤培养基管，作为阴性对照。

(12)将以上各试验组和对照组样本管，置 37℃ 培养箱中培养 48h，观察是否有菌生长

(13)所有试验均在20℃±1℃ 水浴中进行。

(14)重复上述试验，每日1次，以连续取得3次同一评价结论者为准。

(15)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其长菌量应在106cfu/ml～107cfu/ml。阳性对照管应变浑浊，阴性对照，不应有菌生长。

对照组结果不符合要求时，应检查原因，改正后重新进行试验。

2.1.1.11.4 评价规定

当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)时，第 1 次和第 2 次移种的 5管样本中，有2 管或 2管以上不长菌的浓度组，作为合格浓度组。如 3 个浓度组均合格， 应降低消毒剂浓度继续试验; 反之，3个浓度组均不合格，则增加消毒剂浓度，直至找到最低合格浓度。连续3次重复试验，得到同样最低合格浓度，该最低合格浓度可作为设定反复浸泡用消毒液实用浓度的依据。

2.1.1.11.5 结果举例

设对某消毒剂能量试验结果如表2-4。

—40—

表 2-4 某消毒剂能量试验结果

试验序号

消毒剂浓度

(%，v/v)

0.6

1.2

1.8

0.6

1.2

1.8

0.6

1.2

1.8

3 次加菌后移种 5 管肉汤中细菌生长情况

(1)

―――――

―――――

―――――

＋―＋＋＋

―――――

―――――

――＋＋＋

―――――

―――――

(2)

＋＋＋＋＋

―＋＋＋―

―――――

＋＋――＋

―――＋＋

―――――

＋＋―＋＋

＋――――

―――――

(3)

＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋

―――――

＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋

―――＋―

＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋

―――――

1

2

3

注: "+" 表示有菌生长， "-"表示无菌生长。

结论：此次试验结果，该消毒剂的最低合格浓度为1.2%。

2.1.1.11.6 注意事项

(1)试验应选用规定菌株。

(2) 3 个消毒剂浓度组操作，应严格按表 2-3规定的时间进行。

2.1.1.12 各种因素对消毒剂杀菌作用影响的测定

2.1.1.12.1 目 的

了解有机物、温度和 pH 对消毒剂杀菌作用的影响规律，为制定消毒剂的实用剂量提供参考。

2.1.1.12.2 试验器材

（1）菌片与菌悬液（按 2.1.1.2 要求和方法制备）。

（2）恒温水浴箱。

（3）冷水浴装置（可放入试管架的容器，以冰水调节水温）

（4）温度计。

（5）pH 计。

（6）有机物，根据消毒剂的使用对象选择，如酵母粉、血清、蛋白胨。

（7）中和剂（经中和剂试验鉴定合格）。

（8）盐酸（用无菌蒸馏水配制）。

（9）氢氧化钠（用无菌蒸馏水配制）。

2.1.1.12.3 试验微生物的选择

根据所测消毒剂鉴定需要决定。一般情况下，除需用于特定微生物者外，对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，作为革兰阳性与阴性细菌的代表即可；用作灭菌剂，可使用枯草杆菌黑色变种芽孢。

2.1.1.12.4 消毒液浓度和作用时间的设定

各种因素影响的测定，均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度，和 3个～4个作用时间进行杀灭试验。在 3个～4个作用时间中，以该最低有效浓度所需的最短有效时间为第 1 时间（T），其后的第 2 时间为第 1 时间的一倍（2T）。依此，第 3 时间为 3T，第 4 时间为 4T。试验结果应根据需要测出杀灭对数值达 5.00（消毒用）的最低有效剂量。必要时，可根据需要调整消毒剂浓度或作用时间，若第 1 时间较长（> 30min），可根据情况适当缩短作

—41—

用时间的组距。对第1时间较短者（＜5min），可根据情况适当延长作用时间的组距。

2.1.1.12.5 有机物对杀灭微生物效果影响的测定

（1）如以小牛血清为有机物代表，应设置无小牛血清对照组；含25% 小牛血清组；含

50% 小牛血清组等3组。各组所用消毒液浓度和作用时间，见2.1.1.12.4。

（2）以稀释液配制的微生物悬液与无菌小牛血清，按 1：1 与3：1 比例混合，分别配成含50%与25%小牛血清的微生物悬液。此含小牛血清的微生物悬液，可用于悬液定量杀菌试验，亦可滴染菌片进行载体定量试验。

（3）试验中根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可参见2.1.1.7。

（4）其它有机物按此设计类推。各组试验应重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。

2.1.1.12.6 温度对杀灭微生物效果影响的测定

（1）设置10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃等，以10℃为间隔。各组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。

（2）对要求试验温度高于室温者，用恒温水浴箱（电热）调节；低于室温者用冷水浴装置（加适量冰水）调节。当上述温度调节装置到达要求温度后，放入装有试验样液的试管，同时放入一含与试验样液等量蒸馏水并插有温度计的试管。待试管内温度计指示到达试验所需温度时，开始随后的试验。

（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可分别参见2.1.1.7。

（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。

2.1.1.12.7 pH 对杀灭微生物效果影响的测定

（1）本项试验根据所测消毒剂使用溶液的 pH 值，分为以下 3 组进行：

第 1 组 pH 值 x - 2

第 2 组 pH 值 x

第 3 组 pH 值 x + 2

[例如，所测消毒剂使用溶液的 pH 值为 7.8，则 3 组的 pH 值应为：第 1 组 5.8，第

2 组 7.8，第 3 组 9.8]。

各 pH 组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。

（2）对消毒液 pH 的调节，先用 pH 计测定原消毒剂的pH，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用pH 计测定消毒液的pH。当达到所要求的pH 后，停止调整，进行随后的试验。必要时，在pH 调整后可测定有效成分含量以观察是否受到pH 变化的影响。

（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序见 2.1.1.7。

（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。

2.1.1.12.8 评价规定

评价时，有机物影响试验应以不含外加有机物组（直接用稀释液配制微生物）的结果为对照；温度影响试验应以20℃±1℃ 组的结果为对照；pH 影响试验应以消毒剂使用溶液pH组的结果为对照。

（1）该组第 1个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果均合格，判为该组所试因素无影响。

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（2）该组第 2个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有轻度影响。

（3）该组第 3个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有中度影响。

（4）该组只第 4 个作用时间的试验， 对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有重度影响。

（5）全部试验对所试微生物杀灭效果均不合格，判为本试验所试因素有严重影响。为取得消毒或灭菌的有效剂量，需增加消毒液浓度或作用时间，重新进行试验。

2.1.1.12.9 注意事项

（1）本试验目的是为制定消毒剂实用剂量提供必要的参考数据，系统研究各种因素对消毒剂杀灭微生物效果的影响，尚需作更多系统的观察。

（2）为加强各组结果的可比性和可重复性，非观察因素应保持稳定不变。例如，在观察有机物的影响时，除有机物浓度根据需要改变外，其他如温度和pH等因素均应先后一致。

2.1.2 消毒剂模拟现场和现场消毒鉴定试验

2.1.2.1 消毒剂对食(饮)具消毒效果的模拟现场鉴定试验

2.1.2.1.1 目的

鉴定消毒剂对食(饮)具上细菌的杀灭作用，以验证该消毒剂对食(饮)具消毒的实用剂量。

2.1.2.1.2 试验器材

(1)大肠杆菌(8099)。对尚需用于杀灭其他特定细菌者，可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。

(2))磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)稀释液：见附录A。

(4)中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者)

(5)胰蛋白胨大豆琼脂培养基

(6)无菌棉拭

(7)规格板(用可略弯曲的软性材料制备，中央留一大小为5.0cm×5.0cm空格作为采样部位)。

(8)试验用食(饮)具样本 瓷碗（盘）或竹（木）筷前端（周长2.0cm， 长度为12.5cm。

2.1.2.1.3 操作程序

（1）按产品使用说明书的用法，选定本试验拟用浓度和作用时间，分别进行大肠杆菌杀灭试验。

（2）用无菌规格板在试验用瓷碗（盘）中间标出染菌区(5.0cm×5.0cm)。用无菌吸管吸取菌悬液，分别滴加于染菌区，每区0.1ml，用无菌L棒在区内涂匀，置37℃恒温箱干燥。

对筷子取前端12.5cm长度，蘸染预定量菌液后，并置37℃或室温干燥。

（3）试验组：将30个染菌碗或3 0个筷子样本，依次定时放入含消毒剂溶液的容器中，使其完全浸没。作用至规定时间后取出，弃掉消毒剂，向瓷碗（盘）内的染菌区加入5ml中和剂，用L棒刮洗染菌区，作用10min后，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将筷子放入含20ml~25ml中和剂的试管中，使其完全浸没在中和剂中，电动混匀器震荡60s或振敲200次，作用10min后，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将接种好的平皿放37℃恒温箱培养48h，计数菌落数，作为试验组。

（4）阳性对照组：将3个染菌碗或3只筷子样本不浸泡消毒剂，直接向瓷碗（盘）内的染菌区加入5ml中和剂，或直接将筷子放入含20ml~25ml中和剂的试管中。待试验组消毒处

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理完毕后，随试验组进行采样和检测。阳性对照组菌量应为1.25×107cfu/样本～1.25×108cfu/样本(相当于5×105cfu/cm2～5×106cfu/cm2)。

（5）阴性对照组：待试验组与阳性对照组试验结束后，将未用过的同批次中和剂、PBS接种培养基和未种菌的培养基等与上述两组样本同时进行培养，作为阴性对照。

（6）按下式计算每件食具上的生长菌落数。

每件食具样本生长菌落数（cfu/样本）=平板上平均菌落数×检测时样本稀释倍数

（7）计算杀灭对数值。

2.1.2.1.4 评价规定

以每种食（饮）具30个样本中大肠杆菌杀灭对数值均≥3.00所用消毒剂的浓度和作用时间为消毒合格剂量。

2.1.2.1.5 注意事项

(1)试验操作过程必须采取严格的无菌技术。直接或间接接触样本的器材必须经灭菌后

使用。模拟现场试验所用食(饮)具在染菌前亦必须经灭菌处理。

(2)每次试验必须设置阳性和阴性对照，绝不可省略。

2.1.2.2 消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场试验

2.1.2.2.1 目的

鉴定消毒剂对人工污染于医疗器械上细菌芽孢的杀灭作用作用，以验证对医疗器械处理的实用剂量。

2.1.2.2.2 试验器材

(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)

(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)

(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基

（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后，烤干备用)。

(6)塑料试管(1.8cm×18cm)。

2.1.2.2.3 操作程序

(1)以载体浸泡定量杀菌试验进行消毒效果的测定。按产品使用说明书的剂量，选定本试验拟用浓度和和作用时间。

(2)染菌时，用无菌镊子将止血钳样本齿面朝上，并固定在无菌支撑物上。用0.1ml无菌吸管或定量无菌移液器，将0.02ml芽孢悬液滴染于齿部，用无菌L型铂金丝涂匀，置37℃恒温箱内干燥备用。

(3)取无菌平皿，按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。

(4)将30个染菌样本浸没于消毒液中进行消毒处理。

(5)作用至规定时间，取出样本，分别移入含10ml中和剂溶液的塑料试管内。在手掌上振敲200次，分别取样液1.0ml倾注接种两个无菌平皿，放37℃恒温箱培养72h，计数菌落数，作为试验组。

(6)以无菌蒸馏水代替消毒液，将3个染菌样同样条件处理，然后与试验组样本同法进行活菌培养计数，作为阳性对照组，其菌量应在5×105 cfu/样本～5×106cfu/样本。

(7)试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基，进行培养;另将未

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用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照。

2.1.2.2.4 评价规定

在规定作用时间内，阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照均无菌生长时，以对试验组30个样本上人工污染芽孢的杀灭率对数均值≥3.00，可判为消毒合格。

2.1.2.2.5 注意事项

与本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。

2.1.2.3消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验

2.1.2.3.1目的

用于验证消毒剂对人工染有芽孢的医疗器械灭菌效果。

2.1.2.3.2 试验器材

(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)

(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)

(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基

（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后，烤干备用)。

(6)塑料试管(1.8cm×18cm)

2.1.2.3.3 操作程序

(1) 按产品使用说明书中的最低使用浓度与0.5倍最短作用时间。

(2) 25个染菌样本制备按2.1.2.2.3中 (2)规定进行。

(3)无菌平皿，按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。

(4)将20个染菌样本浸没于消毒液中进行灭菌处理，作用至规定时间，将样本取出，分别放于含10ml中和剂肉汤的试管内（共20支），置37℃培养箱中定性培养7d，观察最终结果，作为试验组。有菌生长者，肉汤培养基呈轻度浑浊，有皱褶状菌菌膜，轻轻振摇可见絮状沉淀，无菌生长者肉汤清澈透明。

（5）以标准硬水代替消毒液，将2个染菌载体依上同样条件处理，然后与试验组载体同法接种、培养、观察结果，作为阳性对照组。

(6)另取3个染菌样本，分别放入10ml中和剂溶液塑料试管内。振荡1min，或在手掌上振敲200次，取样液进行活菌培养计数。培养72h计数菌落。作为菌数对照组，其菌量应为5×105cfu/样本～5×106cfu/样本。

(7)试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液和稀释液接种培养基，进行培养，另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照。

(8)试验重复3次。

2.1.2.3.4 评价规定

各次试验组所有60个样本均无菌生长，同时阳性对照组均有菌生长，菌数对照组活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照组均无菌生长时，可判定为灭菌合格。

2.1.2.3.5 注意事项

(1)灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。

(2)于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。

2.1.2.4 连续使用稳定性试验

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2.1.2.4.1目的

验证消毒剂在反复取放浸泡医疗器械条件下的使用有效期。

2.1.2.4.2 试验器材

(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)

(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)

(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：见附录A。

（5）试验样本[参照2.1.1.2.4（2）]。

(6)满载用医疗器械(选用医用剪刀、止血钳等小型器械，或根据需要选用其他器械。

(7)无菌带盖搪瓷盘。

2.1.2.4.3 操作程序

(1)以枯草杆菌黑色变种芽孢为试验菌。

(2)试验时，配制双份2000ml消毒液，分别盛装于2个无菌带盖搪瓷盘中。各放入清洁的试验用医疗器械，使达满载要求。每次试验，同时分别对2个搪瓷盘中的消毒液进行检测。

(3)搪瓷盘内放入器械后，每日将器械取出，用清水洗涤，沥干，再回放入消毒液中。连续每日将器械取出、洗涤、沥干、再放入，直至试验结束。

(4)放入器械至说明书上连续使用的最长时间，吸取消毒液样本，医疗器械消毒按消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场试验(2.1.2.2)，医疗器械灭菌按消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验（2.1.2.3）的方法，测定该消毒液对芽孢的杀灭效果。

2.1.2.4.4 评价规定

试验重复3次，以3次试验均达到合格要求，可判为连续使用稳定性试验合格。

2.1.2.4.5 注意事项

(1) 盛装消毒液的搪瓷盘，在每次操作完毕后应加盖。

(2) 灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。

(3) 本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。

2.1.2.5 消毒剂对手消毒模拟现场试验

2.1.2.5.1 目的

用于测定消毒剂对人工污染于手表面细菌的杀灭作用，并作为确定该消毒剂对手消毒实用剂量的参考。

2.1.2.5.2 试验器材

（1）大肠杆菌8099或NCTC 10538，对尚需用于杀灭其他特定细菌目的者，可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。

（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。

（3）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。

（4）中和剂（以TSB为溶剂，经鉴定合格）。

（5）液体肥皂 200g/L。

（6）参考样品：正丙醇 60%（V/V）与异丙醇 60%（V/V）。

（7）标准硬水：见附录A。

（8）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（9）无菌纱布巾。

（10）吸管、试管、平皿若干。

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（11）振荡混合器。

2.1.2.5.3 试验步骤

(1)菌悬液的制备 取2支在TSB中培养18h～24h的大肠杆菌培养物分别接种于1LTSB大三角烧瓶中，在36℃±1℃培养箱中培养18h～24h，用TSB将其稀释为2×108cfu/ml～2×109cfu/ml菌悬液。

（2）将12名～15名志愿者随机分为两组，第一组使用参考样品，第二组使用试验样品

（3）使用液体肥皂洗手1min 去除手表面污染的自然菌，然后用无菌纱布将手擦干。

（4）将2×108cfu/ml-2×109cfu/ml大肠杆菌的菌悬液放入一无菌容器中，

（5）将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中，手指分开，停留５s，将手离开菌悬液，在空气中干燥３min。

（6）干燥后立即将拇指与其他手指尖在含 10ml TSB的平皿中搓洗１min，取适当稀释度接种平皿。计数菌落数，作为试验前菌数。

（7）不再重复污染手，立即进行消毒处理。

（8）试验样品组：按说明书介绍的用量、作用时间和使用频率以标准的洗手方法（如图2-1）搓擦30s～60s（卫生手消毒）或最长5min（外科手消毒）。以流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。立刻将拇指与其它手指尖在含10ml中和剂的平皿中搓洗1min，做适当稀释后，分别取样液1.0ml以倾注法接种两个无菌平皿，放37℃恒温箱培养48h，计数菌落数。

(9)参考样品组：对于卫生手消毒，取60%异丙醇3 ml到入手心中，按标准的洗手方法用力搓擦30s。以确保手的所有部位均匀接触异丙醇。重复使用异丙醇按上述方法搓擦使总的搓擦时间为60s。对于外科手消毒，使用60%正丙醇3ml，按标准的洗手方法用力搓擦，当接近干燥时，再加3ml正丙醇搓擦。以保持作用3min。用流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。其余步骤与试验样品组相同。

1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦

4.两手互握互搓指背 5.拇指在长中转动搓擦 6.指尖在掌心中摩擦

图2-1 标准的洗手方法

(10) 在试验当日，第一组与第二组样品对换，重复上述试验。

(11) 分别计算参考样品组和试验样品组的菌数减少的对数值。

2.1.2.5.4 评价规定

(1) 试验样品的杀灭对数值大于或等于参考样品的杀灭对数值为合格。

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(2) 若试验样品的杀灭对数值小于参考样品的杀灭对数值，应进行统计学处理，以确定差异是否显著。

(3) 若试验样品的杀灭对数值不显著小于参考样品的杀灭对数值，可判为消毒合格。若试验样品的杀灭对数值显著小于参考样品的杀灭对数值，表明该试验样品不符合本规范的要求。

2.1.2.5.5 注意事项

（1）试验必须在同一受试者、同一天、相同环境、同样条件下进行，使试验样品和参考样品的结果具有可比性。

（2）所有受试者应年满18岁，身体健康。手部皮肤应无破损、无皮肤病，手指甲短而干净。

（3）试验用菌悬液应在第1只手浸入后3h内使用。在1次试验中，无论使用试验样品还是参照样品，所有受试者手的染菌都应使用同一批菌悬液。

（4）对受试者，在每次试验结束时，应及时对双手进行彻底的消毒处理。

2.1.2.6 消毒剂对手消毒现场试验

2.1.2.6.1目的

测定消毒剂对手表面自然菌消毒所需使用的剂量，以验证该消毒剂对手消毒实用剂量。

2.1.2.6.2试验器材

（1）中和剂（中和剂经鉴定合格)

（2）无菌棉拭

（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2

（4）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（5）标准硬水：见附录A。

（6）无菌纱布巾

（7）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。

（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。

（9）振荡混合器

（10）吸管、试管、平皿若干。

2.1.2.6.3试验步骤

(1) 在使用现场，随机选定受试者。试验不少于30人次。

(2) 消毒前，在受试者双手相互充分搓擦后，让受试者左手指并拢，用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿，于管壁上挤干后，在五指屈面指尖至指根，往返涂擦2遍，每涂擦一遍，将棉拭转动一次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入中和剂试管内，作为阳性对照组样本。

(3)根据消毒剂使用说明书的方法对右手进行消毒，对手的卫生消毒一般设定作用时间为1min， 对外科洗手后的泡手一般设定作用时间为3min。消毒后用中和剂代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右手上残留的自然菌采样一次，作为试验组样本。

(4)分别将未用过的同批中和剂、稀释液各1.0ml、棉拭1份～2份作为阴性对照组样本。

(5)分别取试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各1ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察最终结果。

(6) 计算杀灭对数值

2.1.2.6.4 评价规定

阳性对照组应有较多细菌生长，阴性对照组应无菌生长，以对30人次手上自然菌的平均杀灭对数值≥1.00可判为消毒合格。

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2.1.2.6.5 注意事项

(1)本试验需有志愿者参与，重复人次较多，一人可多次受试，但不得在一批试验或同日反复参与，否则可影响结果的准确性。

(2) 受试者接受试验时，不得触摸任何表面，以免使手的试验部位沾染杂菌。

(3)棉拭涂抹采样，较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量， 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。

(4) 擦拭消毒时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。

(5) 现场样本须及时检测，室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内，但亦不得超过4h。

2.1.2.7 消 毒 剂 对 皮 肤 消 毒 模 拟 现 场 试 验

2.1.2.7.1 目的

测定消毒剂对人工污染于皮肤表面细菌的杀灭作用，以验证该消毒剂对皮肤消毒实用剂量。

2.1.2.7.2试验器材

（1）试验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 27217，对尚需用于杀灭其他特定细菌者，可增用该特定细菌进行试验。

（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），见附录A。

（3）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（4）中和剂（中和剂经鉴定合格）。

（5）液体肥皂 200g/L。

（6）金属筒 （直径2.2cm、高度3cm）。

（7）尼龙刮菌棒。

（8）无菌纱布巾。

（9）吸管、试管、平皿若干。

（10）振荡混合器。

（11）一次性接种环（直径4mm）。

（12）抗生素软膏。

（13）皮肤消毒剂。

（14）恒温箱。

2.1.2.7.3 试验步骤

（1）菌悬液的制备按2.1.1.2.3规定的方法和要求进行。

（2）使用液体肥皂清洗受试者前臂内侧1min，用自来水冲净残留皂液，然后用无菌纱布擦干，以去除前臂内侧表面污染的自然菌。

（3）用一端醮有印墨直径为3.0cm的玻璃筒扣印在受试者的每只前臂中段（不要在手腕和肘皱褶处），划分出一个试验区。

（4）使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（使回收菌落数为2×106 cfu/试验区～1×107 cfu/试验区），用一次性接种环，把菌悬液涂成一圆形，与试验区边缘应有4mm～5mm的距离，在空气中自然干燥。

（5）根据消毒剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行消毒，一般设定作用时间为1 min～3min。

（6）消毒后用中和剂对前臂上接种的区域进行取样。采样时，将金属筒放置于试验区中间部位，罩住染菌区，不要接触到盖有印墨的边缘。将1.0ml中和剂吸移至金属筒内，用尼

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