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2024年4月16日发(作者：html input怎么使用)
研究论文
结核分枝杆菌腺(磷酰硫酸激酶的
异源活性表达和酶学性质
胥睿睿
1
,
王
阳
1
,
史仲平
"12
，
康
振
12
(
1.
江南大学生物工程学院
，
江苏无锡
214122
；
2.
江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，
江苏无锡
214122
)
摘要
：
PAPS
是生物体内磺化反应的惟一活性磺酸基团供体
。
腺+磷酰硫酸激酶是催化
APS
和
ATP
生成
PAPS
和
ADP
的一类酶
。
为实现
PAPS
的酶法合成
，
作者通过密码子优化来自结核分
枝杆菌
(
Mycobacterium
tuberculosis
AUSMDU00018547
%
的腺+磷酰硫酸激酶编码基因与共表达
硫氧还蛋白
TrxB
，
实现了腺+磷酰硫酸激酶在大肠杆菌
Escherichia
coli
BL21
(
DE3
)
中的异源
高活性表达
&
采用
His-Tag
标签实现了对腺+磷酰硫酸激酶的纯化
，
进一步酶学性质分析结果
表明
，
重组腺+磷酰硫酸激酶最适温度
、
最适
pH
以及比酶活分别为
35
"
/
7.5
和
(
1.26
±
0.08
)
U/mg
。
腺+磷酰硫酸激酶的异源活性表达与酶学性质分析为未来实现酶法合成
PAPS
奠定了基础
&
关键词
：
PAPS
:
腺+磷酰硫酸激酶
；
结核分枝杆菌
；
活性表达；
活性分析
中图分类号
:
Q814
文章编号
:
1673-1689
(
2021
)
02-0049-08
DOI
:
10.3969
/.
1673-1689.2021.02.007
Heterologous
Expression
and
Enzymatic
Characterization
of
Adenylyl-Sulfate
Kinase
from
Mycobacterium
tuberculosis
XU
Ruirui
1
,
WANG
Yang
1
,
SHI
Zhongping
*
1,2
,
KANG
Zhen
1
#
2
(1.
School
of
Biotechnology,
Jiangnan
University,
Wuxi
214122,
China;2.
Key
Laboratory
of
Carbohydrate
Chemistry
and
Biotechnology,
Ministry
of
Education,
Jiangnan
University,
Wuxi
214122,
China)
Abstract
:
PAPS
is
the
only
active
sulfonic
acid
group
donor
for
sulfation
in
living
organisms.
Adenylyl-sulfate
kinase
catalyzes
the
formation
of
PAPS
and
ADP
from
APS
and
ATP.
In
order
to
achieve
the
enzymatic
synthesis
of
PAPS,
the
adenylyl-sulfate
kinase
encoding
gene
from
Mycobacterium
tuberculosis
AUSMDU00018547
was
codon-optimized
and
heterologously
co-expressed
with
thioredoxin
TrxB
to
achieve
the
active
and
high-level
heterologous
expression
of
adenosine
phosphorylsulfate
kinase
(APK)
in
Escherichia
coli
BL21(DE3).
His-tagged
recombinant
adenylyl-sulfate
kinase
was
successfully
purified.
Further
enzymatic
property
analysis
results
showed
that
the
optimal
temperature,
pH
and
the
specific
enzyme
activity
of
recombinant
adenylyl-sulfate
kinase
were
35
°C
,
pH
7.5
and
(1.26
0.08)
U/mg,
respectively.
Heterologous
expression
of
收稿日期
：
2020-02-09
基金项目
：
国家
&
十三五
’
重点研发计划项目
(
2018YFA0901401
)
；
国家轻工技术与工程一流学科自主课题
(
LITE2018-16
)
。
"
通信作者
：
史仲平
(
1962
—
),
博士
，
教授
，
博士研究生导师
，
主要从事发酵工程及自动控制方面的研究
。
±
:
******************.cn
很
2021
年第
40
卷第
2
期
RESEARCH
ARTICLE
XU
Ruirui
,
et
al
:
Heterologous
Expression
and
Enzymatic
Characterization
of
Adenylyl-Sulfate
Kinase
from
Mycobacterium
tuberculosis
adenylyl-sulfate
kinase
and
enzymatic
property
analysis
lay
a
foundation
for
the
enzymatic
synthesis
of
PAPS
in
the
future.
Keywords:
PAPS,
adenylyl-sulfate
kinase,
Mycobacterium
tuberculosis,
active
expression,
activity
analysis
肝素和硫酸软骨素都含有磺酸基团
在医药方
，
(
EC
2.7.1.25
)
，
基因名称为
cysC
,
GenBank
登录号为
QGK78545.1
"
其基酸
和结构分
,
54<
和
559
的
酸
成的
硫
其
面
,
肝素具有抗凝血等重要的生理学功能叫硫酸软
骨素在治疗关节炎等疾病有显著疗效叫目前
商品
,
化肝素和硫酸软骨素依赖于动物组织提取
然而提
,
在
中
，
硫
的要
。
取法获得的肝素和硫酸软骨素含有其他杂多糖
磺
,
于
确
成
[12-13]
O
有
可
重组
，
于硫的
TrxA
、
TrxB
酸化程度难以控制⑶
。
酶法合成肝素和硫酸软骨素
策略具有诸多优势
，
如可以获得结构明确的肝素和
硫酸软骨素
[4_5]
O
在酶法合成肝素和硫酸软骨素中
3
-
磷酸腺昔
-
5
’
-
磷酰硫酸
(
3
‘
-phosphoadenosine-5
(
-
硫
确
[15
-
19]
O
网
，
二硫
酶
DsbA
&
DsbB
和
DsbC
对可影响二硫
的从头合成并
促进二硫键的正确
5
促溶
与
phosphosulfate
,
PAPS
)
,
的磺酸基团供体⑹
。
此
目的
腺昔磷硫酸酶共
发
，
其中
硫
的
,
促进重
PAPS
于
⑺
、
罔和醇凹化合
TrxB
能有效
重组
物的合成
,
应广泛
O
但
PAPS
价格贵
,
效
组
的可溶表达
。
研究实了对腺
磷硫
，
并利用
His-Tag
编码
成
合
PAPS
有
重要的
O
PAPS
酸酶的异源高效
,
硫酸物
广泛
在于
,
生物
硫
节重
要的
中
重组酶实
了
3
柱亲和层纯化
°
，
还
研究了
重组
的酶学
,
酶法合
PAPS
有
重要
O
[10]
O
目前
,
PAPS
的获得主要依
化学法合成和酶
法合成
O酶法合成
基
的
PAPS
合成
:
(
生物表达
,
以三磷酸腺昔
adenosine
材料与方法
1.1
材料与试剂
triphosphate
,
ATP
)
为底物
，
经过
ATP
硫酸化酶合成
中
腺
磷
硫
酸
adenosine
phosphosulfate
,
(
Escherichia
coli
JM109
、
E.
coli
BL21
(
DE3
)
:分
APS
)
，
后又经
APS
激酶合成
PAPS
[11]
,
此方法能有效
合成
PAPS
,
1
O
别作为克隆宿主和
，
均为作者所在实验室
保存菌株
；
质粒
pET-28a
(
+
)
：
美国
Novagen
公司
；
Taq
DNA
polymerase
&
DL
5
000
bp
Marker
、
蛋白质
电泳
Marker
、
制胶
、
4
#
loading
Buffer
、
5
#
蛋
白质上样缓冲液:购买于
Thermo
Fisher
公司
；
Nde
I
、
Hind
III
和
Xho
I
限制性内切酶
、
细菌基因组
DNA
提取试剂盒
、
DNA
纯化试剂盒
、
DNA
凝胶回收试剂
盒:购买于
Vazyme
生物技术有限公司
;
抗生素
(
硫
酸卡那霉素
)
：
购自上海生工
；
PAPS
、
APS
和
ATP
:购
ATP
ADP
自
Sigma
(
USA
)
；
亲和层析
Ni
柱:购自
GE
(
USA
)
；
异
丙基
-
!
-D-
硫
乳糖
(
IPTG
)
:购买于上海生物
图
1
PAPS
的合成途径
生工
；
PCR
引物合
及测
：
均
上海生物生工公
司完
；
考马斯亮蓝
R-250
、
咪卩坐
、
三羟甲基氨基甲
Fig.
1
Synthetic
pathway
of
PAPS
作者以
，
pET2
；
a
(+
)
为表
烷
、
KH
2
PO
4
、
K
2
HPO
4
、
MgSO
4
、
NaCl
、
盐酸
、
乙月青:均购
于国药集团
；
胰
I
、
酵母粉:购买于美国
Oxoid
；
乙青
纯,其余试均
纯
。
达载体
，
异源表达结
(
Mycobacterium
tuberculosis
AUSMDU00018547
)
来源的
APS
激酶
■
5
M
JOURNAL
OF
FOOD
SCIENCE
AND
BIOTECHNOLOGY
Vol.
40
Issue
2
2021
胥睿睿
，
等
：
结核分枝杆菌腺+磷酰硫酸激酶的异源
5
性表达和酶学性质
研究论文
1.2
仪器与设备
Agilentl260
高效液相色谱仪
:
美国安捷伦有限
公司产品
；
polyamine
II
柱
：
日本
YMC
科技有限公司
成
：
从
NCBI
上查得结核分枝杆菌腺苗磷酰硫酸激
酶基因
cysC
序列
(
GenBank
:
QGK78545.1
),
用在线
软件
(
http
：
//
)
，
按照大肠杆菌密
产品
；
PCR
仪
、
凝胶成像仪
：
Bio-Rad
公司产品
；
UV1800
紫外可见分光光度计
：
岛津企业管理有限
公司产品
；
蒸汽灭菌器
：
致微
(
厦门
)
公司产品
；
落地
码子
优化
，
优化
合成
生工合成
*
pET28a
(
+
)
质
，
质
：
的
Nde
I
和
Hind
III
限
粒
pET28a-
cysC
,
见图
2
。
高速冷冻离心机
：
美国贝克曼
Beekman
公司产品
；
恒温水浴锅
：
常州中诚仪器公司产品
；
NanoDrop
超
微量紫外可见分光光度计
、
蛋白质电泳仪
:
Thermo
公司产品
；
超净工作台
：
苏州净化设备有限公司产
品
；
恒温培养摇床
、
生化培养
：
品
；
蛋白质化仪
:
美国
GE
公司产品
;
超
科学仪器有限公司产品
。
质
NCBI
据库搜索
，
共表达
TrxA
(
GeneID
:
948289
)
、
TrxB
(
GeneID
:
949054
)
、
DsbA
(
GeneID
:
948353
)
、
DsbB
(
GeneID
：
946344
)
和
DsbC
(
GeneID
：
947363
)
基
因
。
公司产
仪
：
扩增后添力口一段
RBS
序列
(
AAGGAGATATACAT
)
在
pET28a-cysC
质粒的
Hind
III
和
Xho
I
限制性酶
1.3
实验方法
,
，
见表
1
。
1.3.1
表达载体构
建
目的基因密码子优化与合
1.3.2
目的蛋白质的表达与纯化
LB
培养基
：
10
g
PT7
cysC
cysC
RBS
RBS
trxA
trxB
PT7
P
?
cysC
cysC
RBS
RBS
RBS
DsbA
DsbB
DsbC
Pl7
Pn
cysC
(a)
原始质粒示意图
(b)
共表达质粒示意图
图
2
质粒构建示意图
Fig.
2
Schematic
diagram
of
plasmid
construction
表
1
PCR
扩增引物
Table
1
Primers
for
PCR
amplification
引物名称
cysC-F
cysC-R
序列
(
5
'
-3
‘
)
GCCGCGCGGCAGC
CATATG
ATGACGACGCTATTGCGGC
GGTGGTGGTGGTGGTG
CTCGAG
CTAAGACGATGACTCCAACAGGTCG
TrxA-F
GTCATCGTCTTAG
AAGCTT
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACG
GTGCTCGAGT
GCGGCCGC
TTACGCCAGGTTAGCGTCGAG
TrxA-R
TrxB-F
TrxB-R
GTCATCGTCTTAG
AAGCTT
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGCACGACCAAACACAGTAAAC
GTGCTCGAGT
GCGGCCGC
TTATTTTGCGTCAGCTAAACCATCGAG
DsbA-F
DsbA-R
DsbB-F
GTCATCGTCTTAG
AAGCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTG
GTGCTCGAGT
GCGGCCGC
TTATTTTTTCTCGGACAGATATTTCACTGTATCAGC
GTCATCGTCTTAG
AAGCTT
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTTGCGATTTTTGAACCAATGTTCAC
GTGCTCGAGT
GCGGCCGCTTAGCGACCGAACAGATCACGTTTTTTC
DsbB-R
DsbC-F
GTCATCGTCTTAG
AAGCTT
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGAAAGGTTTTATGTTGTTTACTTTGTTAGCG
GTGCTCGAGT
GCGGCCGCTTATTTACCGCTGGTCATTTTTTGGTGTTCG
DsbC-R
注
：
红色为限制性酶切位点
报
2021
年第
40
卷第
2
期
RESEARCH
ARTICLE
XU
Ruirui
,
et
al
；
Heterologous
Expression
and
Enzymatic
Characterization
of
Adenylyl-Sulfate
Kinase
from
Mycobacterium
tuberculosis
NaCl
,
10g
胰蛋白
$
,
5g
酵母粉
，
加去离子水至
1
L
,
分装后高压蒸汽灭菌
；
TB
培养基
:
KH
2
P0
4
2.31
g
,
K
.
HPO
i
12.54
g
,
胰蛋白
$
12
g
,
酵母粉
24
g
,
甘油
5
polyamine
II
柱
(
4.6
mm
x
250
mm
，
'
为
12
nm
)
，
流动
：
50
mmol/L
KH
2
P0
4
液
，
：
0.6
mL/min
，
:
UV
254
nm
㈣
$
量
：
5
|!L
,
检测时
35
min
，
g
,
加去离子水至
1
L
,
调节
pH
至
7.0-7.2
,
分装后高
压蒸汽灭菌
。
目的蛋白质的表达
：
将重组质粒转入
E.
coli
2
结果与讨论
2.1
腺"磷酰硫酸激酶的表达优化与纯化
2.1.1
腺(磷酰硫酸激酶的初步表达
将成功构
建的
pET28a-cysC
质粒转化
E.
coli
BL2
(
DE3
)
菌株
中
，
挑取
BL21
&
DE3
)
菌株中
，
将验证正确的菌株在含有卡那
霉素
50
!
g/L
平板上划线并过夜培养
$
挑取单菌落
接种于
LB
种子培养基中
,
置于弹簧摇床
(
37
!
)
220
r/min
'
培养
8~10
h
；
将种子液按
2%
体积分数转
子分
在不同浓度的
IPTG
和不
接到
50
mL
TB
发酵培养基中
，
培养至
0D
为
0.6~
0.8
时
，
加入不同浓度的
IPTG
(
0.5
、
1
mmol/L
'
并在不
同温度下诱导
达
，
目的蛋白质
含有
615
基
酸
，
蛋白质
分子质量为
67
800
$
I
的表达结果见图
3
$
通过
SDS-PAGE
分
同温度
(
30
)
37
!
)
下诱导培养
10
h
后离心收集菌
体
。
将收集的细胞用
20
mmol/L
、
pH
7.5
Tris-HCl
洗
后
,
加入适量的缓冲液重悬细胞
，
超声破碎
后用于
和分析
。
目的蛋白质的
：
将填充好的Ni-NTA
层析
析
，重组
菌在不同浓度的诱导
和不同诱导
温度下
达
为
体
，
过
IPTG
浓度和温度调
子
度不
中
正确
达到
达的目的
$
柱用
10
倍柱体积的上样缓冲液
Buffer
A
(
NaCl
0.5
mol/L
，
20
mmol/L
，
Tris
-HCl
20
mmol/L
，
pH
2.1.2
共表达二硫键促溶蛋白促进
pET28a-cysC
可溶表达
将二硫键促溶蛋白构建到原始质粒上
并利用一段
RBS
7.5
)
平衡
$
Buffer
A
平
子
，
1~2
mL/min
上样
，
上
后
不同浓度
度
达
,
将验证正确的
子划线过夜培养
，
挑取单菌落接入
LB
培养基
液 Buffer
B
(
NaCl
0.5
mol/L
，
Tris-HCl
20
mmol/L，
pH
7.5
)
500
mmol/L，
中
，
37
!
培养
8~10
h
。
以
2%
接种体积分数转接至
蛋白质和目的
TB
发酵培养基中
，
继续
培养至
0D
为
0.6~0.8
时
，
对
培养
蛋白质
，
的
浓度分
为
50
、
100
、
150
、
200
、
250
)
300
)
500
mmol/L
$
纯化后蛋白质用
SDS-PAGE
优
$
分
不同浓度的诱导
IPTG
和不同的诱导温度试验
，
确
诱导条件下
，
有目的蛋白质
佳诱导条件为
：
诱
达且共表达标签
分析
，
析去
于
$
导剂
IPTG
终浓度
0.5
mmol/L
，
诱导温度
30
!
$
在此
1.3.3
酶活测定方法
1
mL
催化体系
：
Tris-HCl
100
mmol/L
(
相应
pH
)
，
MgS0
4
1
mmol/L，
ATP
1
mmol/L，
TrxB
)
TrxA
，
DsbA
，
DsbB
均可见表达条带
。
培养
10
h
APS
1
mmol/L
，
30
!
后加入
0.5
mg
CysC
纯化
后收集菌体
，
经
TrxB
可以有效
后利用
SDS-PAGE
分析
，
蛋白质
，
在
30
!
不
同
温
度
下
时
㈣
4
$
从蛋白质达情况
看出
，
达
的
达没有显著效果
$
的
：
Tris-HCl
100
mmol/L
达
，
(
pH
7.5
)
，
MgS0
4
1
mmol/L
，
ATP
1
mmol/L
，
APS
1
mmol/L
，
30
!
后加入
0.5
mg
銀
而共表达
TrxA
、
DsbA
、
DsbB
或
DsbC
对腺昔磷酰硫
的
酶纯化蛋白质
，
分
在
25
)
30
)
35
)
40
!
下
$
2.1.3
目的蛋白质的纯化
重组菌
E.
coli
BL21
不同
pH
下
的
：
Tris-HCl
100
mmol/L，
MgS0
4
1
mmol/L
，
ATP
1
mmol/L
，
APS
1
mmol/L
，
30
!
(
DE3
)
-pET28a-cysC-TrxB
经诱导表达后
，
破壁离
心后去
沉淀
，
载体自带组
标签
，
经
后加入
0.5
mg
温度设置为
30
!
，
调节
液
pH
蛋白质
，
<
亲和层析
后
，
SDS-PAGE
分析
，
保
$
(一定温度和
5
$
纯化后的目的蛋白质条带较单一
，
目的条带
分子质在
62
000
上
，
与
蛋白质
分
的活力单
：
在
一定
pH
)
下
，
1
h
内反应生成
1
!
mol
PAPS
所需要
的
㈣
列$
PAPS
的检测
：
采用
Agilent
1600
HPLC
系统
，
子质
(67
300
'大
小一致
，
因此
，
结核分枝
菌
：
基因在
达并
有效
$
菌中实现了高效可溶
JOURNAL
OF
FOOD
SCIENCE
AND
BIOTECHNOLOGY
Vol.
40
Issue
2
2021
胥睿睿
，
等
：
结核分枝杆菌腺+磷酰硫酸激酶的异源活性表达和酶学性质
研究论文
Al
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
Bl
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
198
000
一
Al
：25
!
1
mmol/L
IPTG
CysC
上清液
；
A2
：
30
!
1
mmol/L
IPTG
CysC
上清液
；
A3
：
37
!
1
mmol/L
IPTG
CysC
上清液
；A4
：
空白
上清液
；
A5
：
空白沉淀
；A6
：
37
!
1
mmol/L
IPTG
CysC
沉淀
；A7
：
30
!
1
mmol/L
IPTG
CysC
沉淀
；
A8
：
37
!
1
mmol/L
IPTG
CysC
上清液
。
B1
：
25
!
0.5
mmol/L
IPTG
CysC
上清液；
B2
：
30
!
0.5
mmol/L
IPTG
CysC
上清液
；
B3
：
37
!
0.5
mmol/L
IPTG
CysC
上清液
；
B4
:
空白上清液
；
B5
：
空白沉淀
；
B6
：37
!
0.5
mmol/L
IPTG
CysC
沉淀
；
B7
：30
!
0.5
mmol/L
IPTG
CysC
沉淀
；
B8
：37
!
0.5
mmol/L
m
28
000
14
000
14
000
6
000
IPTG
CysC
上清液
。
红色箭头所指为腺昔磷酰硫酸激酶所在位置
。
图
3
原始质粒
pET28a-cy#C
的表达情况
Fig.
3
SDS-PAGE
analysis
of
pET28a-cy%C
expression
in
BL21
(
DE3
)
M
Al
A2
A3
A4
A5
A6
A7
M
Bl
B2
B3
B4
B5
B6
B7
红色条带所指为目的条带所在位置
,
黄色条带所指为二硫键促溶蛋白所在位置
。
A1
：
空白上清液；
A2
:
原始
CysC
上清液
；
A3
：
共表达
TrxA与
CysC上清液
；A4
:
共表达
TrxB
与
CysC上清液
；
A5
：
共表达
DsbA
与
CysC
上清液
；A6
：共表达
DsbB
与
CysC
上清液
；A7
：
共表达
DsbC
与
CysC
上清液
。
B1
：
空白沉淀
；
B2
:
原始
CysC
沉淀
；
B3
:
共表达
TrxA
与
CysC
沉淀
；
B4
：
共表达
TrxB
与
CysC
沉淀
；
B5
：共表达
DsbA
与
CysC
沉
淀
；
B6
:
共表达
DsbB
与
CysC
沉淀
；
B7
:
共表达DsbC
与
CysC
沉淀
。
图
4
共表达硫氧还蛋白和二硫键异构酶对腺
磷酰硫酸表达的影响*
Fig
・
4
Effect
of
co-expression
of
thioredoxin
and
disulfide
isomerase
on
adenylyl-sulfate
kinase
expression
2.2
腺
磷酰硫酸激酶的酶学性质分析
*
2
・
2
・
1
PAPS
标准曲线的绘制
配置不同质量浓度
线
,
结果见图
6
。
绘制所得
PAPS
质量浓度范围为
0
〜
800
mg/L
时
的标准
曲线为
y
二
0.282
"+
26.004
,
$
2
二
的
PAPS
水溶液
，
经
HPLC
测定分析绘制
PAPS
质
0.993
7
,
线性良好
，
以此建立的
PAPS
的高效液相检
量浓度与峰面积的点线图
，
通过拟合绘制标准曲
测方法适合催化体系中
PAPS
的检测
。
2021
年第
40
卷第
2
期
RESEARCH
ARTICLE
M
1
198 000
98
000
62
000
XU
Ruirui
,
et
al
:
Heterologous
Expression
and
Enzymatic
Characterization
of
Adenylyl-Sulfate
Kinase
from
Mycobacterium
tuberculosis
2
1.6
1.4
1.2
49
000
38
000
28
000
14
000
0.2
6
000
25
30 35
40
1
:
150
mmol/L
咪"洗脱
；
2
：
200
mmol/L
咪"洗脱
。
温度代
图
7
不同温度下的酶活
图
5
腺#磷酰硫酸激酶纯化分析图
Fig.
5
Purification
of
SDS
-PAGE
electrophoresis
by
Fig
%
7
Enzyme
activity
at
different
temperature
recombinant
protein
结果见图
3
#
经测定
&
在
35
!
时
&
重组蛋白酶在
pH
为
7.5
时催化活力最高
，
即重组蛋白最适反应
pH
25
20
超
15
醤
10
5
袂
r
0
为
7.5
,
此时比酶活为
(
1.26
±
0.08
)
U/mg
o
o
5
10
15
20
25
30
35
40
保留时间
/min
(a)500
mg/L
PAPS
高效液相色谱图
00(
(
m
u
l
)
SdVd
8
oo
6
o
o
磁
番
4o
o
径
2o
o
尸
0.2852x+26.004
疋
=0.993
7
图
8
不同
pH
值下的酶活
0
500
1
000
1
500
2
000
2
500
3
000
相对峰面积
(b)PAPS
标准曲线
图
6 PAPS
高效液相色谱图
Fig.
8
Enzyme
activity
at
different
pH
3
结语
作者以大肠杆菌
Escherichia
coli
BL21
(
DE3
)
为宿主
&
以
pET-28a
(
+
)
为载体
&
表达结核分枝杆菌
Fig.
6
HPLC
analysis
of
PAPS
content
2
・
2
・
2
重组蛋白质最适反应温度的确定
控制催
化体系
pH
为
7.0
,
测定温度为
25
、
30
、
35
、
40
!
下腺
(
Mycobacterium
tuberculosis
AUSMDU00013547
)
来
源的腺
2
磷酰硫酸激酶
&
由于第
549
和
556
位的半
2
磷酰硫酸激酶的酶活
，
结果见图
7
。
经测定
，
在
pH
为
7.0
、
温度为
35
!
时
&
重组蛋白酶活力最高
&
即重
组蛋白最适反应温度为
35
!
,
此时比酶活为
(
1.20
±
胱氨酸形成的一对二硫键无法正确折叠
&
目的
以
体形
在
&
温度和
的蛋
的
表
。
键
蛋
0.10
)
U/mg
o
IPTG
的度以控制
子强度不能有效地现目
表
5
不的二硫
TrxB
以有效
；
&
硫
2
・
2
・
3
重组蛋白质最适反应
pH
的确定
控制催化
体系的温度为
35
!
&
分别测定催化缓冲液
pH
为
6.0
、
6.5
、
7.0
、
7.5
、
3.0
时腺
2
磷酰硫酸激酶的酶活
&
腺
2
磷酰硫酸激酶的
表
#
TrxB
■
54
JOURNAL
OF
FOOD
SCIENCE
AND
BIOTECHNOLOGY
Vol.
40
Issue
2
2021
胥睿睿
，
等
：
结核分枝杆菌腺+磷酰硫酸激酶的异源活性表达和酶学性质
研究论文
氧化还原反应中的氢供体
，
伴随着电子和质子的转
异源过表达腺
S
磷酰硫酸激酶实现
PAPS
的合成
。
移
，
从而调节胞质的氧化还原状态倒-
251
,
使二硫键能
够正确折叠
。
本研究中共表达
TrxB
有效地促进腺
S
磷酰硫酸激酶的可溶表达
，
其原因可能与蛋白质
在相关研究中
为
表达
表达的腺
S
磷酰硫酸激酶
[20
,
22]
。
本研究
：
PAPS
的
酶
，
有
对
分
的腺
S
磷酰硫酸激
酶活
有体的
二硫键的正确折叠相关
。
经
C
柱纯化后对重组蛋白
质酶学性质进行测定
，
发现目的蛋白质最适反应温
度为
35
!
,
最适
pH
为
7.5
,
最大比酶活为
（
1.26
士
酶
，
因
高
分
酶的酶活和
大
的腺
S
磷酰硫酸激
可溶表达
有
大的
。
0.08
）
U/mg
。
腺
S
磷酰硫酸激酶的研究主要分为两
个方
：
硫酸激酶
化
为表达
主
，
表达效
和表达
高
，
的腺
S
磷酰
的腺
ST
方便
。
腺
S
磷酰硫酸激酶作为
PAPS
台
研究其酶学性质
，
中最后步酶
，
该酶的活性表达及纯化对体外酶
酰硫酸激酶的比酶活最高能达到
7
560
U/mg
㈣
,
但
PAPS
有着重要的
。
该方式步骤琐
，
蛋白质
，
不适合应
（
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2021
年第
40
卷第
2
期
XU
Ruirui
,
et
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科
技
息
食品领域顶级期刊在线发表了肉品加工与品质调控团队综述文章
“
肉品质生物标志物最新研究进展及发展趋势
$
肉品质生物标志物能够阐明畜禽宰后肌肉转化为肉过程中发生一系列复杂的生理生化变化
，
涉及能量代谢
、
钙信号
传导和细胞凋亡等数十种途径
,
决定肉品质
#
生物标志物是众多生化反应的物质基础和关键靶标
，
筛选和确证肉品质生物
标志物是国际肉品科技研究的最新前沿
,
但一直未明确目标研究对象
。
近年来
，
肉品加工与品质调控创新团队聚焦能量代
谢与靶标蛋白质
（
酶
）
翻译后修饰关联调控肉品质的新机制
，
筛选了肉品质
文
50
余篇
$
基于
质
（
酶
）
，
解析了多条代谢途径
，
发表论
基础
，
该团队对肉品质生物标志物最新研究进展进行了系
理和科学分析
，
筛选和
79
种表征肉类品质的潜在生物标志物
，
其中
GAPDH
、
TPI1
、
HSPB1
、
HSPA1B
、
PARK7
、
ACTA1
和
TTN
可同时表征肉嫩度
、
色
泽和持水力
，
这些标志物可从糖
酵解
、
热应激
、
蛋白质氧化与水解
、
细胞凋亡等途径调控肉品质
。
本综述为从分子层面解析
和调控肉品质提供了靶标
，
为构建肉品质精准评价体系和快速在线监测方法提供了方向
。
该成果在线发表在食品领域顶尖期刊
Trend
in
Food
Science
and
Technology
（
一区
,
IF
:
11.077
）
上
，
得到了中国农业科
学院科技创新工程和
“
十三五
”
国家重点研发计划项目资助
$
[信息来源+中国农业科学院农产品加工研究所.食品领域顶级期刊在线发表了肉品加工与品质调控团队综述文章
“
肉品质生物标志物最新研究进展及发展趋势
”
[EB/OL].
（
2020-10-9
）
.
/xwzx/kyjz/
■
5
^
JOURNAL
OF
FOOD
SCIENCE
AND
BIOTECHNOLOGY
Vol.
40
Issue
2
2021
版权声明：本文标题：结核分枝杆菌腺苷磷酰硫酸激酶的异源活性表达和酶学性质 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://roclinux.cn/b/1713251071a625995.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
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