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2024年3月20日发(作者：匿名聊天官网)
·
８９４
·
ＤＯＩ１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．１２．０４
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉＤｅｃ．２０２０Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１２
，，，
：
胞的侵袭
ＬｎｃＲＮＡＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
促进三阴性乳腺癌细
·临床实验研究·
王琴
，
唐莉
（
江苏省肿瘤医院
＆
江苏省肿瘤防治研究所
＆
南京医科大学附属肿瘤医院检验科
，
南京
２１０００９
）
ＬｎｃＲＮＡ
）
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合果糖二磷酸醛缩酶
Ａ
（
ｆｒｕｃｔｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
，
ＡＬＤＯＡ
）
摘要
：
目的
探索长链非编码
ＲＮＡ
（
ＭＤＡＭＢ２３１
）
对三阴性乳腺癌细胞
（
侵袭的影响
。
方法
采用
ＲＮＡｐｕｌｌｄｏｗｎ
试验
、
质谱分析和
ＲＮＡ
免疫共沉淀试验检测并
ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ
，
ＴＣＧＡ
）
采用癌症基因组图集
（
中的侵袭性乳腺癌阵列分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
之间的相互作用
；
ＲＴＰＣＲ
和
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
分析三阴性乳腺癌细胞中
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
失调对
ＡＬＤＯＡ
表达
分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
表达的相关性
；
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
试验分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
对乳腺癌侵袭能力的影响
。
结果
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
在乳腺癌细胞内与
ＡＬＤＯＡ
的影响
；
Ｐ＜０．０１
）
ｒ
＝
０．１９
，
Ｐ＜０．０１
），。
与阴性对直接结合
。
ＡＬＤＯＡ
在
ＴＣＧＡ
乳腺癌阵列中高表达
（
并与
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的表达呈正相关
（
照组相比
，
干扰
ＡＬＤＯＡ
能抑制
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
对
ＭＤＡＭＢ２３１
细胞的促侵袭功能
。
结论
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
通过与
ＡＬＤＯＡ
直接结合
促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭
。
关键词
：
乳腺癌
；
侵袭
；
长链非编码
ＲＮＡ
；
果糖二磷酸醛缩酶
Ａ
Ｒ４４６
；
Ｒ７３．３７
文献标志码
：
Ａ
中图分类号
：
ＬｎｃＲＮＡＤＣＳＴ１ＡＳ１ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＡＬＤＯＡｐｒｏｍｏｔｅｓｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ
ＷＡＮＧＱｉｎＴＡＮＧＬｉＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＪｉａｎｇｓｕＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ＆ＪｉａｎｇｓｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ＆ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａ
ｔｅｄＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＮａｎｊｉｎｇ２１０００９ＪｉａｎｇｓｕＣｈｉｎａ
ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＤＣＳＴ１ＡＳ１
，（
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１ａｎｔｉｓｅｎｓｅ１
）
ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
（
ＡＬＤＯＡ
）
ｏｎｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ
ＭＤＡＭＢ２３１
）
．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＲＮＡｐｕｌｌｄｏｗｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
，
ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＮＡｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｅｒｅｕｓｅｄｃｅｌｌｓ
（
ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＤＣＳＴ１ＡＳ１ａｎｄＡＬＤＯＡ．ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓａｒｒａｙｉｎＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ
（
ＴＣＧＡ
）
ｗａｓ
ｏｆｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＤＣＳＴ１ＡＳ１ｏｎＡＬＤＯＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＤＣＳＴ１ＡＳ１ｃｏｍｂｉｎｅｄ
ｗｉｔｈＡＬＤＯＡｏｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＤＣＳＴ１ＡＳ１ｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｓｔｏＡＬＤＯＡｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＡＬＤＯＡｗａｓｈｉｇｈｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＴＣＧＡｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒａｒｒａｙＰ＜０．０１
：
，
，
，，）
（
ＤＣＳＴＡＭＰｄｏｍａｉｎ
ｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＤＣＳＴ１ＡＳ１ａｎｄＡＬＤＯＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＲＴＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓ
ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈＡＬＤＯＡｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤＣＳＴ１ＡＳ１ｏｎＭＤＡＭＢ２３１
ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＤＣＳＴ１ＡＳ１ｍａｙｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｔｏＡＬＤＯＡｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｉｎｖａｓｉｏｎｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
，
（
Ｐ＜０．０１
）
．Ｃｏｍ
），
ａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＤＣＳＴ１ＡＳ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
（
ｒ
＝
０．１９
，
三阴性乳腺癌（
ｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ
，
ＴＮ
ＢＣ
）
ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ
，
ＥＲ
）是雌激素受体（、孕激素受
体（和人表皮生长因子受
ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ
，
ＰＲ
）
体
２
（
ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ２
，
均为阴性的异质性疾病，具有侵袭程度高、
ＨＥＲ２
）
易远处转移等特点，是乳腺癌中预后较差的亚型，而
寻找有效的分子诊断指标和治疗靶标是解决这一困
境的有效途径。
ＤＣＳＴＡＭＰ
域包含
１
反义链
１
（
ＤＣＳＴＡＭＰ
ｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１ａｎｔｉｓｅｎｓｅ１
，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
）是本课
ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ
，题组采用长链非编码
ＲＮＡ
（
：；；；
）芯片在
ＴＮＢＣ
组织中筛选获得的上调表达
的
ＬｎｃＲＮＡ
并证实
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
可作为
ＴＮＢＣ
有效的
分子诊断指标，且能够通过与
ｍｉＲ８７３５ｐ
和致癌基
因
ＭＹＣ
形成正调控环以促进
ＴＮＢＣ
细胞的增殖和
转移
［］
。此外，笔者还发现
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
可以通过与
膜联蛋白
Ａ１
（
ＡＮＸＡ１
）结合通过促进上皮
－
间质转
ＥＭＴ
）化（以增强
ＴＮＢＣ
细胞的化学耐药性
［］
。本
研究拟进一步分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
通过结合果糖二磷
酸醛缩酶
Ａ
（
ｆｒｕｃｔｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
，
ＡＬ
ＤＯＡ
）促进
ＴＮＢＣ
细胞侵袭的机制。
ＬｎｃＲＮＡ
１
２
国家自然科学基金（；江苏省自然科学基金（。
８１８０２８９８
）
ＢＫ２０１８１０９０
）
基金项目
：
作者简介
：王琴，女，主管技师，大学本科，从事肿瘤标志物的相关研究。
１９７５
年生，
通信作者
：唐莉，副主任技师，
Ｅｍａｉｌ
：
ｔａｎｇｌｉ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
。
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
１
材料和方法
１．１
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉＤｅｃ．２０２０Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１２
，
细胞系、主要试剂及仪器
三阴性乳腺癌细胞
系
ＭＤＡＭＢ２３１
和
ＢＴ５４９
（中国科学院上海细胞
库），上海康成公司），
ＬｎｃＲＮＡ
芯片（
Ｌ１５
培养基、
胰蛋白酶
－
ＥＤＴＡ
（和胎
ＲＰＭＩ１６４０
培养基、
０．２５％
）
均购自美国
Ｇｉｂｃｏ
牛血清（
ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ
，
ＦＢＳ
）
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ
试剂盒和
ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘ
公司，
日本
ＴａＫａＲａ
公司），
ＭａｇｎａＲＩＰＴａｑ
Ⅱ
试剂盒（
美国
ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉＲＮＡ
结合蛋白免疫沉淀试剂盒（
ＴＭ
·
８９５
·
２
×
）
１０
μ
Ｌ
，
Ｔａｑ
Ⅱ
（上、下游引物（
１０
μ
ｍｏｌ／Ｌ
）各
０．８
μ
Ｌ
，
ＤＮＡ
模板
２
μ
Ｌ
，灭菌水
６．４
μ
Ｌ
。使用两步
法进行
ＰＣＲ
扩增，循环参数：
９５℃３０ｓ
；
９５℃５ｓ
，
共
４０
个循环。在
５６℃
时收集每个循环
５６℃２０ｓ
，
的荧光信号，进行熔解曲线分析。采用仪器自带软
件分析扩增曲线和熔解曲线中的荧光信号，并计算
Ｃｔ
值）平均阈值循环数（。通过
２
法计算待测基
因的相对表达量，公式：
Δ
Ｃｔ
实验组
＝
Ｃｔ
实验组待测基因
－
，
Δ
Ｃｔ
对照组
＝
Ｃｔ
对照组待测基因
－
Ｃｔ
对照组
；
Ｃｔ
实验组
。
，，
－
ΔΔ
Ｃｔ
ＧＡＰＤＨＧＡＰＤＨ
ｐｏｒｅ
隆兔抗体
公司），
ＲＩＰＡ
裂解液（上海碧云天公司），多克
（
ａｎｔｉＡＬＤＯＡ
（
ａｂ２４５４６９
）和羊抗兔
ａｎｔｉＩｇＧ
ａｂ２０５７１８
（
（
）购自美国
Ａｂｃａｍ
公司，
ＡＬＤＯＡ
小干扰
ＲＮＡｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ
，
ｓｉＲＮＡ
）和阴性对照
玛公司）
ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ
，转染试剂
ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
，
ｓｉＮＣ
）购自上海吉
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ
（美国
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司）
司），
，
公司）。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＰＣＲ
仪（美国
Ｒｏｃｈｅ
ＴｒａｎｓＢｌｏｔＳＤ
半干转膜仪（美国
ＢｉｏＲａｄ
公
Ｃｏｒｎｉｎｇ
ＢｉｏＣｏａｔ
ＴＭ
ｎｉｎｇ
公司）
公司）
国
，
，
肿瘤浸润
２４
孔板（美国
Ｃｏｒ
ＯｎｅＤｒｏｐ
超微量分光光度仪（南京五义
ＴｒｉｐｌｅＴＯＦＴＭ５６００ｐｌｕｓ
液质联用质谱仪（美
ＡＢ
的
细胞培养
Ｓｃｉｅｘ
公司）。
１．２ ＭＤＡＭＢ２３１
细胞使用含
１０％ＦＢＳ
Ｌ１５
培养基，置于
３７℃
、空气培养箱中培养。
ＢＴ５４９
置于
细胞使用含
１０％ＦＢＳ
的
ＲＰＭＩ１６４０
培养基，
３７℃
、
５％ＣＯ
２
培养箱中培养。
１
取细胞总
．３ ＲＮＡ
提取及
ＲＴＰＣＲ
反应
用
Ｔｒｉｚｏｌ
试剂提
１０
６
度（
个，使用
ＲＮＡ
，单次提取
ＲＮＡ
的细胞总数不少于
用于后续检测。按照
Ａ
２６０／２８０ｎｍ
）
ＯｎｅＤｒｏｐ
值，取
超微量分光光度仪检测吸光
Ａ
２６０／２８０ｎｍ
值在
１．９～２．１
间的样本
将总量为
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ
试剂盒说明书
１
μ
ｇＲＮＡ
逆转录为
ｃＤＮＡ
，
由上海生工公司合成。
保存。使用软件设计引物，
样本置于
－
２０℃ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ６．０
引物序列：
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
（
ＮＲ＿０４０７７３．１
）上游
物序列：
５′ＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣ３′
；下游引
为
５′ＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣ３′
，退火温度
５６℃
，扩增片段长度为
２３６ｂｐ
。
ＡＬＤＯＡ
（
；
）
ＮＭ＿
００１１２７６１７．２
上游引物序列：
５′ＴＧＴＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡ
ＧＧＴＴＴＣ３′
下游引物序列：
ＧＣＧＧＣ３′
退火温度为
５′ＴＡＧＴＡＧＣＡＡＧＴＴＣＣＴ
５６℃
，扩增片段长度为
２０３
达
［
３
］
ｂｐ
。使用
，以
，
ＧＡＰＤＨ
作为内参计算相对
ｍＲＮＡ
表
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＰＣＲ
仪及
ＴＢＧｒｅｅｎ
Ｐｒｅｍｉｘ
ＥｘＴａｑ
ＴＭ
Ⅱ
试剂盒进行实时荧光定量
ＰＣＲ
检测。
ＰＣＲ
总反应体积为
２０
μ
Ｌ
，包括：
ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘ
ΔΔ
Ｃｔ
＝
Δ
Ｃｔ
实验组
－
Δ
Ｃｔ
对照组
１
得
．４ ＲＮＡｐｕｌｌｄｏｗｎ
连接酶将单个脱硫生物素化胞苷二磷酸酯连接至
的正义链和反义链，
和质谱测定
通过体外转录获
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
并使用
Ｔ４ＲＮＡ
ＲＮＡ
正义链和反义链分别与
链的
３′
末端。将
１
μ
ｇ
生物素化的
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
记的磁珠混合，
５０
μ
Ｌ
重悬的链霉亲和素标
的裂解液中室温温育
４℃
温育过夜，再加入
ＢＴ５４９
细胞
用
１ｈ
，同时加入
液质联用质谱仪分析与
ＲＮａｓｅ
抑制剂。
ＴｒｉｐｌｅＴＯＦＴＭ５６００ｐｌｕｓ
ＲＮＡ
果：
据，
在可信度
结合的蛋白质。通过
≥
９５％
至少包含
Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ
软件分析结
１
个肽段时读取数
污染蛋白质。用于转录的
同时剔除角蛋白、
，
抗体蛋白、血清清蛋白等常见
列：
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
上游引物序
５′ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡ
ＧＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧ３′
；下游引物序列：
５′ＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴ３′
用于扩增反义
。
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的上游引物序列：
５′ＴＡＡ
ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡ
ＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴ３′
；下游引物序列：
５′ＡＡＡＧＣＣＣＧ
ＧＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧ３′
。
１．５ ＲＮＡ
免疫沉淀试验测定
按照
ＭａｇｎａＲＩＰ
ＲＮＡ
结合蛋白免疫沉淀试剂盒说明书操作进行
ＲＮＡ
以测定
免疫沉淀（
ＲＮＡｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
，
ＲＩＰ
），用
ＴＮＢＣ
细胞中能与
ＡＬＤＯＡ
蛋白结合的
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
为每反应管
。用于免疫沉淀的
ＡＬＤＯＡ
抗体加入量
实时荧光定量
５
μ
ｇ
，以
ＩｇＧ
作为阴性对照。按照上述
淀中的
ＰＣＲ
和
步骤扩增
ａｎｔｉＡＬＤＯＡ
和
ＩｇＧ
沉
ＤＣＳＴ１ＡＳ１ＧＡＰＤＨ
，并以
ＩｇＧ
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
作为阴性对照。通过
２
－
ΔΔ
Ｃｔ
法计算
沉淀组中的
ａｎｔｉ
ＡＬＤＯＡ
沉淀组中
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的相对表达量。
１．６ ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
使用本课题组前期工作
［
１
备的用慢病毒作为载体的稳定干扰
］
中制
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的
ＢＴ５４９ｓｈ
达
细胞及其阴性对照
ＢＴ５４９ＮＣ
，稳定过表
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
。将细胞分别接种于
的
ＭＤＡ２３１ｅｘｐ
细胞及其阴性对照
ＭＤＡ２３１ＮＣ６
孔细胞培养板
·
８９６
·
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉ
，
Ｄｅｃ．２０２０
，
Ｖｏｌ．３８
，
Ｎｏ．１２
中，当细胞融合度达
９０％
、单孔细胞总数不少于
１０
性。以
Ｐ＜０．０５
为差异有统计学意义。
个时，收集细胞，用预冷的
ＰＢＳ
洗涤并用
ＲＩＰＡ
缓冲
２
结果
液裂解。使用标准
Ｂｒａｄｆｏｒｄ
试剂盒测定细胞裂解液
中的蛋白质水平，用
１０％ＳＤＳＰＡＧＥ
电泳分离总蛋
２．１ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的靶蛋白分析
通过
ＲＮＡｐｕｌｌ
共计有
２５
种蛋白质能特异性与
ＤＣＳＴ１
白质，使用
ＴｒａｎｓＢｌｏｔＳＤ
半干转膜仪调节稳定电流
ｄｏｗｎ
测定，
转膜
１２０ｍｉｎ
，将蛋白质转移至聚偏二氟
ＡＳ１
正义链结合。将这
２５
种蛋白质与本课题组前
为
２００ｍＡ
，
乙烯膜，用
ＴＢＳＴ
充分洗涤。随后用含
５％ＢＳＡ
的
期检测的三阴性乳腺癌组织
ＬｎｃＲＮＡ
芯片数据中显
室温摇床振荡温育
２ｈ
。再次用
ＴＢＳＴ
著上调表达的
２０９２
种基因
［］
进行整合（
ＧｅｎｅＥｘ
ＴＢＳＴ
封闭，
，结果发现磷酸三糖
充分洗涤后，加入多克隆兔抗体
ａｎｔｉＡＬＤＯＡ
（
１∶
ｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓＧＳＥ１１５２７５
）
、
ＡＬ
与膜在
４℃
摇床温育过夜。加入辣根过
异构酶
１
（
ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅＩｓｏｍｅｒａｓｅ１
，
ＴＰＩ１
）
１０００
稀释）
同时存在于
ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎ
，
ＣＤＳＮ
）
ＤＯＡ
和角蛋白（
氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体
ａｎｔｉＩｇＧ
（
１∶２０００
稀
。
ＴＰＩ１
、
ＡＬＤＯＡ
、
ＣＤＳＮ
蛋白分
释）与膜在室温摇床振荡反应
２ｈ
。用
ＧＡＰＤＨ
作为
这
２
项检测中（图
１
）
蛋白质表达的内参照。使用
ＳＹＮＧＥＮＥＧ
：
ＢＯＸ
子中与
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合的序列分别为
ＳＮＶＳ
ＡＬＡＮＳＬＡＣＱＧＫ
和
ＳＮＶＳＤＡＶＡＱＳＴＲ
。
英国
Ｓｙｎｇｅｎｅ
公司）采集图像，并使
ＤＡＶＡＱＳＴＲ
、
ｃｈｅｍｉＸＲ５
系统（
用
ＧｅｌＰｒｏ３２
软件读取并计算
ＡＬＤＯＡ
和
ＧＡＰＤＨ
的
蛋白质灰度值。
１．７
细胞侵袭能力测定
预包被基质胶的
Ｃｏｒｎｉ
该小室由
ｎｇＢｉｏＣｏａｔ
肿瘤浸润
２４
孔细胞培养板［
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
膜滤器（孔径为
８
μ
ｍ
）插入
２４
孔细胞培养
板中组成］，用不含血清的培养基将待测细胞密度
图
１
韦恩图分析乳腺癌组织芯片检测结果和
ｐｕｌｌｄｏｗｎ
调节至
２．５
×
１０ｍＬ
，取
２００
μ
Ｌ
细胞悬液加入小室上
蛋白的质谱检测结果
室中，并将
５００
μ
Ｌ
含
１０％ＦＢＳ
的培养基加入小室下
２．２ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
表达的相关性分析
通
室中，置于
３７℃
细胞培养箱中温育
１０ｈ
。使用棉签
过
ＧＥＰＩＡ２
分析癌症基因组图集（
ＴｈｅＣａｎｃｅｒ
擦去小室膜上层的基质胶和未穿过膜的细胞。用
ＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ
，中的乳腺癌阵列结果发现，
ＴＣＧＡ
）
通过
ＡＬＤＯＡ
在乳腺癌中显著上调表达，
４％
多聚甲醛固定膜下层细胞后用结晶紫染色，
ＴＰＩ１
、
ＣＤＳＮ
在乳
倒置显微镜观察比较穿过基质胶与膜小孔的细胞。
腺癌组织和正常组织中的表达差异无统计学意义
１．８
统计学分析
采用
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７
统计软件
图
２
）。
Ｐｅａｒｓｏｎ
相关性分析发现，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
处理数据，所有实验数据至少重复
３
次。配对
ｔ
检
（
Ｐ＜０．０１
）表达量呈正相关（
ｒ
＝
０．１９
，，而与
验用于
ＲＴＰＣＲ
中实验组与对照组差异的比较。单
ＡＬＤＯＡ
（、
ｒ
＝
０．０１３
，
Ｐ
＝
０．６５
）
ＣＤＳＮ
（
ｒ
＝
０．０４５
，
Ｐ
＝
０．１２
）
尾
ＡＮＯＶＡ
用于
ＴＣＧＡ
乳腺癌阵列中肿瘤组织与正
ＴＰＩ１
常组织的基因表达差异的比较。
Ｐｅａｒｓｏｎ
相关性系
的表达量均无相关性。
数用于分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与靶蛋白表达之间的相关
６
１
ＴＭ
５
注：肿瘤组织（红色）；正常组织（灰色）；每百万映射读取的转录本；
Ｔ
，
Ｎ
，
ＴＰＭ
，
Ｐ＜０．０１
。
，
ＴＰＩ１
和
ＣＤＳＮ
在癌组织和正常组织中的表达
图
２
箱形图分析
ＡＬＤＯＡ
、
２．３ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
结合并影响其表达
ＲＴＰＣＲ
检测发现，与阴性对照组（
１００％
）相比，
·
８９７
·
ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ
的相对表达量在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺失时
ＡＬＤＯＡ０．０９
）（图
３Ａ
）。
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测结果表明，
Ｐ＜０．０５
）下调至
５８．８％
（
ｔ
＝
１５．６
，，而在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
在蛋白质水平的变化趋势与
ｍＲＮＡ
水平相同（图
ｔ
＝
３５．６
，
Ｐ＜０．０５
）
ＴＰＩｍＲ３Ｂ
）过表达时上调至
３６８．８％
（；。进一步用剩余的拉下蛋白液进行
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
鉴定，发现只有
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
正义链拉下的蛋白液中
ＮＡ
在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺失时下调至
９８．０％
（
ｔ
＝
１．１０
，
Ｐ
＝
０．３３
），而在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
过表达时上调至
１１９．１％
检测到
ＡＬＤＯＡ
（图
３Ｃ
）。
ＲＩＰ
结合
ＲＴＰＣＲ
实验表
（；明，在
ＡＬＤＯＡ
蛋白的
ＲＮＡ
沉淀物中检出的
ｔ
＝
２．４６
，
Ｐ
＝
０．０７
）
ＣＤＳＮｍＲＮＡ
在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺
失时上调至
１１２．２％
（
ｔ
＝
２．２１
，
Ｐ
＝
０．１０
），而在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
表达量是阴性对照组的
４５５．７
倍（
ｔ
＝
。
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
过表达时上调至
１３２．１％
（
ｔ
＝
２．２３
，
Ｐ
＝
Ｐ＜０．０５
）
５１．５
，
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉＤｅｃ．２０２０Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１２
，，，
Ａ
，
ＲＴＰＣＲ
检测
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺失和过表达时
ＴＰＩ１
、
ＡＬＤＯＡ
和
ＣＤＳＮｍＲＮＡ
的变化，
Ｐ＜０．０５
；
Ｂ
，
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
敲减和注：
，
Ｃ
，
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的正义链和反义链拉下蛋白液中的
ＡＬＤＯＡ
。过表达时
ＡＬＤＯＡ
蛋白质水平的变化；
图
３ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
结合并影响其表达
２．４ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
促进乳腺癌细胞的侵
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
表达并未受到明显影响（
ｔ
＝
１．９１
，
Ｐ
＝
袭
ＲＴＰＣＲ
结果表明，图
４Ａ
）。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
侵袭试验表明，干扰
ＡＬＤＯＡｓｉＲＮＡ
能有效干扰
０．１３
）（
将
ＡＬＤＯＡＡＬＤＯＡ
的表达抑制了
ＭＤＡ２３１ｅｘｐ
细胞的侵袭
ＭＤＡＭＢ２３１
细胞中的
ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ
，
，而（图
４Ｂ
）。
ｍＲＮＡ
下调至对照组的
１０．８％
（
ｔ
＝
２９．８
，
Ｐ＜０．０５
）
×
２００
）
Ａ
，
ＲＴＰＣＲ
检测
ＡＬＤＯＡｓｉＲＮＡ
的干扰效率，
Ｐ＜０．０５
；
Ｂ
，
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
侵袭试验检测
ＡＬＤＯＡ
对
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
侵袭能力的影响（注：。
，
图
４ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
促进乳腺癌的侵袭
１２
３
讨论
性
［］
。除了乳腺癌，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
作为促癌因子发
挥作用也在其他类型的癌症中得到了证实。有学者
ＬｎｃＲＮＡ
的失调是在各种癌症中观察到的特征
指出，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
在子宫内膜癌中表达上调并通过
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
标志之一
［］
。本课题组前期研究发现，
影响
Ｎｏｔｃｈ１
蛋白促进癌症侵袭和转移
［］
。
ＤＣＳＴ１
在
ＴＮＢＣ
中上调表达且与癌组织的远端转移（
Ｐ
＝
ＡＳ１
参与调节
ＡＫＴ／ｍＴＯＲ
信号通路，促进肝癌细胞
及病理组织学（
Ｐ
＝
０．０２６
）分级相关；
０．０２４
）
ＤＣＳＴ１
［］
。
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
可以通过竞争的增殖、转移和自噬
ＡＳ１
能够促进乳腺癌细胞的增殖、转移和化疗耐药
４
５
６
·
８９８
·
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉ
，
Ｄｅｃ．２０２０
，
Ｖｏｌ．３８
，
Ｎｏ．１２
内源性
ｍｉＲ６０５３ｐ
调节胃癌细胞的增殖、迁移、侵
］，，（）：
袭和凋亡
［］
。在本研究中，笔者提出
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
能
［］
［
，，，
够与
ＡＬＤＯＡ
直接结合，通过调控
ＡＬＤＯＡ
的表达以
促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭。
［］
ＡＬＤＯＡ
是关键的糖酵解酶，在包括乳腺癌在内
，，：
在食管鳞状细胞
的多种类型的癌症中呈高表达，被认为是独立的癌
［］王晓飞，崔渊博，孙晓燕，等血浆
］临床检验杂志，，（）：
症临床预后标志物
［］
。
ＡＬＤＯＡ
在促进癌症转移方
［］
癌中的表达及意义［
，，，
面的功能得到了广泛的研究；有学者证实
ＡＬＤＯＡ
：［］，
能够促进上皮间质转化（
ＥＭＴ
），从而促进宫颈癌恶
，：
［］
性进程；
ＡＬＤＯＡ
的过表达增加了肺癌细胞系在体
［］，，，
ｃａｎｃｅｒｂｙｆｏｒｍｉｎｇａｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｌｏｏｐｗｉｔｈｍｉＲ８７３５ｐａｎｄ
ＭＹＣＪ．ＪＣａｎｃｅｒ２０２０１１２３１１３２３．
７
２ＴａｎｇＬＣｈｅｎＹＣｈｅｎＨｅｔａｌ．ＤＣＳＴ１ＡＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｓＴＧＦ
β
ｉｎ
ｄｕｃｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
版权声明：本文标题：LncRNA DCST1-AS1结合ALDOA促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://roclinux.cn/b/1710937655a580432.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
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