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2024年12月29日发(作者：rolton乐廷怎么使用)
ECL免疫发光试剂使用常见问题及解决方案
Q:
你公司生产的ECL与市场上的其他ECL产品相比，灵敏度如何？
A: 在最优条件下，我公司的ECL灵敏度比Pierce的SuperSignal West Pico Substrate高3-5
倍，发光时间也更长可持续约8小时。
Q:
你公司的ECL可检测到的最低抗原是多少？
A: 本公司的ECL可检测到低达1pg的抗原。
Q:
为什么与我用过的其他品牌的ECL相比，你公司的ECL会出来更多的条带？
A: 因为我公司的ECL比其他公司的化学发光试剂灵敏度更高，从而可以检测到低丰度的蛋
白。当遇到这种情况时，可优化封闭条件和抗体使用浓度。但当目的蛋白表达丰度很低时，
选择灵敏度合适的ECL就能得到理想的结果。
Q：
如何判断ECL是否失效？
A：准备ECL工作液1ml 到一个干净的Ep管中，加入1μl未稀释的HRP 酶标物（二抗）到
Ep管中，混匀后即可看到管内发出蓝光，并在随后的几分钟内持续发光，表示底物活性正
常。若不发光则说明
ECL失效了。
Q：
为什么Western Blot化学发光(ECL)会出现高背景？
A：
Western Blot发光经常有“背景太高”问题，导致“背景高”的原因有很多，主要有以下几个方面：
①. 抗体浓度过高，洗涤不充分，可以造成抗体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过
降低抗体稀释度，增加洗膜次数和Buffer用量，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%
的Tween-20加以改善。
②. 封闭不充分，会造成抗体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过4℃封闭过夜或增
加封闭液中的蛋白浓度加以改善。
③. 使用了不恰当的封闭剂，可尝试不同的封闭剂。
④. 曝光过度，可减少底物显色时间，缩短曝光时间。
⑤. 操作过程中膜干了。确保膜完全浸没于buffer中，始终杜绝膜干。
Q：
Western Blot发光时为什么会发生荧光“淬灭”？
A：
荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL后立刻可以看到很明显的亮光，但
亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个
方面:
①. 抗原浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可
降低抗原上样量。
②. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带，再压片就没有什么条
带都没有。
③. 操作时间过长，膜逐渐干掉。避免膜干掉。
④. 不良的实验习惯导致设备或试剂污染。例如铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，会造成荧光
淬灭，甚至直接导致无荧光；
Q：
Western Blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很浓怎么办？
A：可通过以下几个方面进行改进：
①. 可减少蛋白上样量；
②. 降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间；
③. 如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。
Q：
Western blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很弱，这是什么原因？
A：条带弱的原因可能有以下几个方面：
①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白
上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整。
②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、
用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。
③. 抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。可考虑更换
效
价更高的抗体，或
提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交
实验确定抗体活性。
④. 曝光时间太短。可适当延长曝光时间。
Q：
Western blot化学发光(ECL)时，出现非特异条带，应该怎么办？
A：出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面：
①. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。
②. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短
抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。
③. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓
度0.05%的Tween-20。
④. 目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等。可查阅文献，
用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。
⑤. 目的蛋白降解。重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。
Q：杂交膜与ECL工作液共孵育后，膜上出现褐色条带，或压片后出现空心条带是怎么回
事？
A：膜上出现褐色条带或胶片上出现空心条带，多是因为体系中的HRP含量过高，消耗底物
过快导致的烧膜和空心，可降低蛋白上样量和抗体浓度。
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