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2024年12月29日发(作者：python语言是由哪个人创造的)
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流
程】BENCH PROTOCOL
准备工作:
1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)
2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)
3.可选: 加 LyseBlue 试剂于 Buffer P1
4.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解
P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill
6.细菌扩增培养
1.
补充:
2.
准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液, 2个用于接下来
的菌块重悬和与buffer混合
3.
1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯, 因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离
心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA
4.
5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制
5.
准备1个冰浴盒用于步骤6
6.
准备室温下的异丙醇10.5ml
7.
4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳
步骤: peocedure
A.细菌培养、收获和裂解 bacterial culture,harvest & lysis
1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机
4摄氏度； 6000×g；15min
从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落, 2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化
约8小时（振荡300rpm, 注意孵化容器容积至少4倍于培养液）
抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。(高拷贝质粒100-200ul初始培养液
加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振
荡12-16小时。(孵化容器容积至少4倍于培养液, 培养至细菌密度约3-4×109/ml, 即离心后
菌块湿重约3g/L培养基)
培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠 溶于800ml蒸馏水, 用1 N NaOH 调pH值至
7.0, 用蒸馏水调整至1L。
可将离心后菌块-20摄氏度下冰冻保存暂时终止实验。
2.于10ml Buffer P1中重悬浮resuspend细菌沉淀bacterial pellet, 混匀
必须重悬彻底, 涡流振荡器或移液器反复吹打至没有菌块
3.加入10ml Buffer P2, 剧烈vigorously翻转invert4-6次混合, 置于incubate室温5min
在室温孵化期间准备QIAfilter 过滤筒cartridge: 在滤筒出水口outlet喷嘴nozzle拧
上screw帽子, 将滤筒置于管架备用
加入buffer P2后不要使用涡流振荡器(以免剪切细菌DNA), 裂解反应不要超过5分钟。
buffer P2用完要拧紧盖子以免酸化。
4.加10ml预冷的 Buffer P3, 剧烈翻转4-6次混合
加入buffer P3后析出绒毛样物质(细菌DNA, 蛋白, 细胞碎片和KDS), 裂解液粘性下降。如果
裂解液仍然粘稠度大, 说明混合不够。
很重要的是混合好后迅速倒入滤筒, 以防止扰动沉淀层。
B.细菌裂解清除 bacterial lysate clearing
5.将裂解液倒入pour滤筒内, 置室温(15-25摄氏度)10min, 不要套入滤筒活塞plunger！ 从
喷嘴处取掉滤筒的帽子, 缓慢轻柔的将活塞插入滤筒并滤过细菌裂解液于50ml试管中
在静置的10分钟里不要搅动滤筒内的裂解液。析出物会慢慢上浮于上层。如果过了10分
钟析出物未浮在上层, 可用消毒的移液器枪尖驱赶滤筒壁上的析出物。
取120ul过滤后裂解液样本(Sample1)用于实验后分析胶, 确定生长和裂解条件是否最佳。
6.加2.5ml Buffer ER 到过滤好的裂解液中, 翻转约10次使其混合, 冰浴30min
C.结合、洗涤和抽提质粒DNA bind,wash & elute plasmid DNA
7.用10ml Buffer QBT 平衡equilibrate QIAGEN-tip 500, 并保持重力流动gravity flow排
空柱筒empty column
8.使用第6步骤得到的过滤裂解液加入QIAGEN-tip柱中使其重力流动通过树脂resin
取120ul通过树脂后的裂解液样本(Sample2)用于实验后分析胶, 确定质粒DNA结合于树脂
的效率。
9.2×30ml Buffer QC洗涤QIAGEN-tip
第一步洗涤质粒准备过程中大多数污染物, 第二步洗涤特别针对培养液过多或所用菌种含
糖量较多的情况。
取240ul洗涤液样本(Sample3)用于实验后分析胶
注意: 以下步骤均为无内毒素操作, 需使用无内毒素的聚丙烯塑料管或预处理的玻璃器皿
(消毒后180摄氏度烘箱过夜)
10.15ml buffer QN 抽提DNA
用30ml的无内毒素管子收集。如果质粒DNA大于45-50kb, 将抽提缓冲液QN 65摄氏度预
热后使用会提高产量
取60ul洗提样本(Sample4)用于实验后分析胶
可将洗提液存于4摄氏度保存以暂停实验, 但时间不宜过夜。
D.沉淀、洗涤和再溶解质粒DNA precipitate,wash & redissolve plasmid DNA
11.加入10.5ml室温异丙醇(isopropanol)到抽提的DNA中并混合。4摄氏度冰冻离心机>=15,000
×g, 30min离心, 小心的去上清dacant the supernatant
尽管离心在4摄氏度离心机下以防止样本过热, 但所有溶液须为室温以减少盐沉淀。离
心前可在离心管上标记以明确离心后DNA斑块的位置。
12.用5ml 70％室温的去内毒素乙醇(去内毒素水中加入40ml 96-100％乙醇)洗涤DNA沉
淀, >=15,000×g, 10min离心。小心去上清避免扰动沉淀
13.空气中干燥air-dry沉淀5-10min, 重新溶解DNA到适量的去内毒素的 Buffer TE 中。
冲洗管壁以完全重新溶解所有DNA(特别是用玻璃管的话)。但不要用移液器吹打以免剪
切DNA。过于干燥的DNA斑块很难重新溶解。酸性环境有助于DNA溶解。
E.产量测定
14.260nm紫外分光光度计: A260 0.1-1.0之间
琼脂糖凝胶电泳
15.如果产量很低则将前述Sample用于电泳分析问题所在。
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