宝生物工程(大连) PrimeScript Reverse Transcriptase 说明书

TaKaRa Code：D2680A

®

PrimeScript

Reverse

Transcriptase

说明书

宝生物工程(大连)有限公司

目 录

内 容

●制品说明

●包 装

●保 存

●酶贮存溶液

●起 源

●活性定义

●纯 度

●用 途

●添附Buffer组成

●1st-Strand cDNA合成的实验操作方法

页 码

1

1

1

1

1

1

1

1

1

2

2

●使用Mouse Heart Total RNA进行RT-PCR反应的实验例

●使用HL60 Total RNA进行Human TFR基因（4.4 kbp）的

RT-PCR反应的实验例

●使用本制品进行2 Step Real Time RT-PCR反应的实验例

4

5

●制品说明

PrimeScript Reverse Transcriptase是TaKaRa公司独自开发的一种新型RNase H

-

型反转录酶。本酶具

有极强的延伸能力，能够有效地合成1st-strand cDNA，即使对有复杂二级结构的RNA，在42℃条件下

也能得到良好的反应效果，无需进行高温反转录反应，高温的反转录反应会导致RNA的降解。本酶适合于

长链cDNA的合成及高比例的全长cDNA文库的构建等。本酶具有以下特性：

z 超强的延伸能力

本反转录酶可以对10kb以上的RNA模板进行良好的反转录反应。

z 良好的反转录效率

本反转录酶可以对极少量的RNA模板进行良好的反转录反应。

z 复杂结构RNA的反转录性能

本反转录酶在标准的反转录温度条件下（42℃）对高GC含量的RNA模板能够进行良好的反转录反

应。

●包 装：

PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）

5×PrimeScript Buffer

●保 存：

-20℃。

10,000 Units

500 μl

●酶贮存溶液

Tris-HCl（pH7.8）

NaCl

EDTA

DTT

Glycerol（V/V）

20mM

100mM

1.0mM

1.0mM

50%

●起 源：

Purified from an

strain expressing a recombinant enzyme

●活性定义

以Poly（rA）

·

Oligo（dT）为模板/引物，在37℃、10分钟条件下，掺入1 nmol的 [

3

H] dTTP所需要

的酶量定义为1个活性单位（U）。

●纯 度：

1） 200 U的本酶和1 μg的λDNA-

Hin

d III在37℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

2） 200 U的本酶和1 μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发

生变化。

3） 200 U的本酶和1 μg的16S，23S rRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳谱带不发生变化。

●用 途：

1） lst-Strand cDNA的合成。

2） cDNA Probe的制备。

3） 普通RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。

●添附Buffer组成（保存：-20℃）

5×PrimeScript Buffer（cDNA合成用）

Tris-HCl（pH8.3）

KCl

MgCl

2

-1-

250 mM

375 mM

15 mM

●1st-Strand cDNA合成的实验操作方法

1. 在Microtube管中配制下列混合液。

试剂名称

模板RNA

Oligo dT Primer（50 μM）

或Random Primers（50 μM）

或Specific Primer（2 μM）

dNTP Mixture (10 mM each)

RNase free dH

2

O

1 μl

up to 10 μl

1 μl

使 用 量

1 μg*

* Total RNA的使用量一般为5 μg以下；mRNA的使用量一般为1 μg以下。

2. 65℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

3. 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

试剂名称

上述模板RNA/引物等的混合液

5×PrimeScript Buffer

RNase Inhibitor（40 U/μl）

PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）

RNase free dH

2

O

5. 30℃ 10 min*

42℃(～50℃) ** 30～60 min

* 以Random Primers作为反转录引物时应先进行30℃，10分钟反应。

** PrimeScript Reverse Transcriptase延伸能力强，通常情况下，即使模板RNA具有复杂的二级

结构，也可以在42℃下进行反转录反应。但当反转录引物使用PCR的下游引物时，由于引物错配

的原因等易发生非特异性反应，这时可以将反转录温度设为50℃。

6. 70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR

扩增等，PCR扩增时，cDNA溶液的使用量建议使用1～5 μl。

使 用 量

10 μl

4 μl

0. 5 μl

100～200 units

up to 20 μl

●使用Mouse Heart Total RNA进行RT-PCR反应的实验例

使用Mouse Heart Total RNA，分别进行RT-PCR反应，扩增了2 kbp、6 kbp、8 kbp和12 kbp的

目的DNA片段。

1．反转录反应

①

在Microtube管中配制下列混合液。

试剂名称

Mouse Heart Total RNA

Oligo dT

Primer（50 μM）

dNTP Mixture（10 mM each）

RNase free dH

2

O

② 65℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

③ 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

-2-

使 用 量

1 μl*

1 μl

1 μl

up to 10 μl

* Mouse Heart Total RNA使用量分别为1 μg、100 ng、10 ng。

④ 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

试剂名称

上述模板RNA/引物等的混合液

5×PrimeScript Buffer

RNase Inhibitor（40 U/μl）

PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）

RNase free dH

2

O

⑤ 42℃保温30分钟。

使 用 量

10 μl

4 μl

0.5 μl

0.5 μl

up to 20 μl

⑥ 70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

2．PCR反应

① 按下列组成配制PCR反应液，全量50 μl。

试剂名称

上述cDNA溶液

dNTP Mixture（2.5 mM each）

Forward Primer（10 μM）

Reverse Primer（10 μM）

10×LA PCR Buffer II（Mg

2＋

Plus）

使 用 量

2 μl

8 μl

1 μl

1 μl

5 μl

0.5 μl

up to 50 μl

TaKaRa LA Taq

（5 U/μl）

dH

2

O

② PCR反应条件如下：

2 kbp、6 kbp、8 kbp、12 kbp的PCR反应条件

94℃ 1 min

98℃ 20 sec

68℃ 2/6/8/12 min

30 Cycles

72℃ 10 min

3．RT-PCR扩增结果

PCR反应结束后，取5 μl的PCR反应液进行了琼脂糖凝胶电泳，结果如下。

2kbp

6kbp 8kbp 12kbp

M3M

M: λ-

Hin

d III digest DNA Marker

1 : Total RNA 1 μg的RT-PCR扩增结

果

2 : Total RNA 100 ng的RT-PCR

扩增结果

3 : Total RNA 10 ng的RT-PCR扩增

结果

-3-

● 使用HL60 Total RNA进行Human TFR基因（4.4 kbp）的RT-PCR反应的实验例

1．反转录反应

① 在Microtube管中配制下列混合液。

试剂名称

HL60 Total RNA（100 ng/μl）

Oligo dT Primer（50 μM）

dNTP Mixture(10 mM each)

RNase free dH

2

O

② 65℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

③ 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

④ 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

试剂名称

上述模板RNA/引物等的混合液

5×PrimeScript Buffer

RNase Inhibitor（40 U/μl）

PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）

⑤ 42℃保温30分钟。

RNase free dH

2

O

使 用 量

10 μl

4 μl

0.5 μl

0.5 μl

up to 20 μl

使 用 量

1 μl

1 μl

1 μl

up to 10 μl

⑥ 70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

2．PCR反应

① 按下列组成配制PCR反应液，全量50 μl。

试剂名称

上述cDNA溶液

dNTP Mixture（2.5 mM each）

Forward Primer（10 μM）

Reverse Primer（10 μM）

10×LA PCR Buffer II（Mg

2＋

Plus）

使 用 量

分别取1、2、5 μl

8 μl

1 μl

1 μl

5 μl

0.5 μl

up to 50 μl

94℃ 1 min

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec

72℃ 5 min

72℃ 10 min

30 Cycles

TaKaRa LA Taq

（5 U/μl）

dH

2

O

② PCR反应条件如下：

-4-

3．RT-PCR扩增结果

PCR反应结束后，取5 μl的PCR反应液进行了琼脂糖凝胶电泳，结果如下。

M 1 2 3 M

M: 1 kbp DNA Ladder（TaKaRa Code：D517A）

1 : 1 μl cDNA溶液扩增结果

2 : 2 μl cDNA溶液扩增结果

3 : 5 μl cDNA溶液扩增结果

●使用本制品进行2 Step Real Time RT-PCR反应的实验例

本实验以Mouse Liver Total RNA为模板，使用2 Step Real Time RT-PCR方法，扩增Mouse GAPDH

基因。实验时，首先以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应，然后将得到的cDNA溶液使用

EASY Dilution按10倍梯度稀释，再将相当于1 pg～100 ng Total RNA量的cDNA作为模板，进行Real

，制作标准曲线。具体实验过程如下：

Time PCR扩增（使用了SYBR

®

Green I嵌合荧光法）

1．反转录反应

以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应。

① 按下列组成配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。

试剂名称

5×PrimeScript Buffer

dNTP Mixture（10 mM each）

Random 6 mers (100 μM)*1

PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）

RNase Inhibitor（40 U/μl）

Total RNA

RNase Free dH

2

O

使 用 量

2 μl

0.5 μl

0.5 μl

0.25 μl

0.25 μl

500 ng

up to 10 μl*2

*1 反转录引物可使用以下三种引物，使用量分别如下：

Random 6 mers（100 μM） 0.5 μl（50 pmol）

Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol）

Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）

*2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系中Total RNA的最大使用量为500 ng。

② 反转录反应条件如下：

42℃ 10 min（反转录反应）

95℃ 2 min（反转录酶的失活反应）

2．Real Time PCR反应

Target：

Mouse GAPDH。

使用EASY Dilution（TaKaRa Code：D9160）将cDNA溶液按10

0

，10

1

，10

2

，10

3

，

10

4

，10

5

倍梯度稀释（10倍梯度稀释）后，各取2 μl进行Real Time PCR反应。此时

25 μl PCR反应液中的cDNA添加量分别相当于从100 ng，10 ng，1 ng，100 pg，10

pg，1 pg的Total RNA反转录得到的cDNA量。

Negative Control的模板使用了灭菌蒸馏水。

-5-

Template： Mouse Liver Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液。

扩增长度：

使用仪器：

检测方法：

108 bp。

Smart Cycler System。

SYBR

®

Green I嵌合荧光法。

① 按下列组成配制Real Time PCR反应液（反应液请在冰上配制）。

PCR反应使用了SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR041）。

试剂名称

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total Volume

释液。

* RT反应液(即各cDNA的梯度稀释液)的加入量不要超过Real Time PCR反应总体积的1/10（V/V）量。

③ 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：

95℃ 10 sec 1 Cycle

95℃ 5 sec

45 Cycles

60℃ 20 sec

④ Real Time PCR反应结果。

Real Time PCR扩增曲线图及融解曲线图如下：

使 用 量

12.5 μl

0.5 μl

0.5 μl

9.5 μl

23 μl

② 将上述PCR反应液加入至Real Time PCR用反应管中，然后再加入2 μl*的上述各cDNA的梯度稀

扩增曲线图 融解曲线图

反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准曲线。

-6-

2nd derivative 标准曲线图

⑤ 结果分析。

本实验检测到了Mouse Liver Total RNA 1 pg～100 ng相当量的cDNA。分析融解曲线可知，无论

哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好，在实验浓度范围

内能够进行准确定量。

-7-

MEMO

-8-

-9-

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8008909508，4006518769

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：******************.cn

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V2010.06

本制品仅供研究用。请勿用于人体及动物的医疗、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂