EHHADH是肝细胞癌脂肪酸代谢通路的关键基因:基于转录组分析

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doi10.12122/.1673-4254.2023.05.02JSouthMedUniv,2023,43(5):680-693

EHHADH是肝细胞癌脂肪酸代谢通路的关键基因：基于转录组

分析

谢思雨，李淼生，江峰乐，易茜，杨魏

南方医科大学基础医学院病理学教研室，广东广州510515

摘要：目的基于多数据库数据探索肝细胞癌（HCC）发生发展的驱动基因并挖掘HCC治疗的新生物靶点。方法采用从TCGA、

GEO和ICGC数据库中获取的858例HCC组织数据与493例癌旁组织数据（共1351例转录组和基因组数据），运用GSEA筛选

HCC与癌旁的差异通路，进而筛选差异通路中显著富集的基因，获得Hub基因3-hydroxyacylCoA脱氢酶（EHHADH）。基于

TCGA的HCC数据集分析与EHHADH转录组水平下调相关的基因突变，发现TP53突变最显著相关。利用相关性分析探究

TP53突变导致EHHADH表达下调的机制。基于Metascape数据库预测EHHADH参与HCC发展的信号通路，发现与铁死亡信

号通路显著相关。对30例HCC癌组织及配对的癌旁正常组织进行免疫组化染色，验证EHHADH的表达情况。结果三个

HCC数据集均显示EHHADH在癌组织中相对于癌旁组织显著低表达（P<0.05），且和肝细胞去分化程度显著相关（P<0.01）。

TCGA的HCC数据集体细胞突变景观分析显示HCC患者基因组中TP53突变率比例最高。EHHADH上游基因PPARGC1A转

录组水平在TP53突变的HCC患者组中较未突变组显著下调（P<0.05），并与EHHADH表达水平相关。GO和KEGG富集分析

结果显示EHHADH参与到肿瘤脂肪酸代谢通路中。免疫组化结果验证HCC组织中EHHADH表达水平下调，且其表达水平与

肝细胞去分化程度及铁死亡进程相关。结论HCC组织中TP53突变可能诱导EHHADH上游基因PPARGC1A表达异常从而下

调EHHADH表达。EHHADH在HCC癌组织中低表达与HCC癌组织的去分化程度加重及出现铁死亡逃逸现象密不可分，有

可能成为HCC潜在治疗靶点。

关键词：肝细胞肝癌；3-hydroxyacylCoA脱氢酶；TP53突变；去分化；铁死亡

EHHADHisakeygeneinfattyacidmetabolismpathwaysinhepatocellularcarcinoma:a

transcriptomicanalysis

XIESiyu,LIMiaosheng,JIANGFengle,YIQian,YANGWei

DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Abstract:ObjectiveToexplorethedrivinggeneofhepatocellularcarcinoma(HCC)occurrenceandprogressionandits

sThetranscriptomeandgenomicdataof858HCCtissuesand493

adjacenttissueswereobtainedfromTCGA,GEO,tEnrichmentAnalysis(GSEA)identified

EHHADH(encodingenoyl-CoAhydratase/L-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase)asthehubgeneinthesignificantlyenriched

nregulationofEHHADHexpressionatthetranscriptomelevelwasfoundtocorrelate

withTP53mutationbasedonanalysisoftheTCGA-HCCdataset,andthemechanismbywhichTP53mutationcaused

isofthedatafromtheMetascapedatabase

suggestedthatEHHADHwasstronglycorrelatedwiththeferroptosissignalingpathwayinHCCprogression,andtoverify

thisresult,immunohistochemicalstainingwasusedtoexamineEHHADHexpressionin30HCCtissuesandpairedadjacent

sAllthe3HCCdatasetsshowedsignficnatlyloweredEHHADHexpressioninHCCtissuesascomparedwith

theadjacenttissues(P<0.05)withaclosecorrelationwiththedegreeofhepatocytede-differentiation(P<0.01).Thesomatic

landscapeofHCCcohortinTCGAd

transcriptomiclevelofPPARGC1A,theupstreamgeneofEHHADH,wassignificantlydownregulatedinHCCpatientswith

TP53mutationascomparedwiththosewithoutthemutation(P<0.05),andwassignificantlycorrelatedwithEHHADH

EGGenrichmentanalysesshowedthatEHHADHexpressionwassignificantlycorrelatedwith

unohistochemicalresultsshowdthattheexpressionlevelofEHHADHin

HCCtissueswasdown-regulated,anditsexpressionlevelwasrelatedtothedegreeofhepatocytesde-differentiationandthe

sionTP53mutationsmayinduceabnormalexpressionofPPARGC1Atocausedownregulation

expressionofEHHADHiscloselyassociatedwithaggravationofde-differentiation

andferroptosisescapeinHCCtissues,suggestingthepotentialofEHHADHasatherapeutictargetforHCC.

Keywords:hepatocellularcarcinoma;enoyl-CoAhydratase/L-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase;TP53mutation;de-

differentiation;ferroptosis

肝癌是我国一种常见的恶性肿瘤，恶性程度较高，

［1］

病情进展较快，也是60岁以下男性癌症死亡的主要原

收稿日期：2022-11-12

基金项目：科技部重点研发计划（2018YFA0800404）

作者简介：谢思雨，硕士，E-mail:*****************

通信作者：杨魏，博士，教授，E-mail:*****************；易茜，博士，

讲师，E-mail:*******************

因

［2］

。其中，肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的70%~

［3］

80%

。由于HCC通常被诊断为晚期，因此许多患者错

过了最佳的治疗方法。HCC的发生机制还未研究透

彻，且由于HCC是由多种致病因素引起的复杂疾病，有

必要阐明HCC发生发展的潜在分子机制，特别是寻找

潜在的分子生物学标记物来改善HCC患者的预后。既

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往研究鉴定了甲胎蛋白、Glypican-3等蛋白质为HCC

发生发展的重要生物标志物，但由于HCC的异质性，其

敏感性和特异度较低

［4］

。随着基因测序技术和生物信

息学数据的快速发展，人们将基因特征与临床参数相结

合，以期提高HCC患者的预后

［5］

。在生物信息学中，基

因表达总览（GEO）、肿瘤基因组图谱（TCGA）、基因表

达谱交互分析（GEPIA）、人类蛋白质图谱（HPA）等公共

数据库是常用的数据库，Kaplan-Meier绘图仪是分析基

因预后价值的工具。通过这些技术，既往研究发现了与

HCC的发生发展及预后相关的Hub基因

［6］

。本研究通

过运用GSEA筛选HCC组织与癌旁组织的差异通路，

分析发现Hub基因Enoyl-CoA水合酶和3-hydroxyacyl

CoA脱氢酶（EHHADH）作为重要分子参与到数条显著

改变的脂肪酸代谢相关通路中。

EHHADH是3-hydroxyacyl-CoA脱氢酶家族的成

员，是过氧化体β氧化途径的四种酶之一，催化长链二羧

酸降解，在肝细胞过氧化物酶脂肪氧化通路中起到重要

作用

［7］

。脂肪酸的β-氧化发生在线粒体和过氧化酶体

中。在线粒体中，脂肪酸分子被分解成乙酰辅酶A，后

者在柠檬酸循环中被氧化成二氧化碳以产生能量

［8,9］

。

在超长链脂肪酸的分解、胆汁酸的合成和髓鞘脂类的合

［10,11］

成中，都涉及到过氧化物酶的β-氧化。最近，过氧化

物体在人类健康方面受到了关注，它可能对许多疾病产

表1本研究中所使用的数据情况

Tab.1Datausedinthisstudy

Name

Source

Plat

Cancertissue

SampleNo-cancertissue

Total

Survivalstate

Gender

Alive

Dead

FEMALE

MALE

I

II

III

IIIA

TumorstageIIIB

IIIC

IVB

IV

IVA

G1

Grade

G2

G3

G4

HCC421

TCGA

Illumina

HiSeq

371

50

421

241

130

121

250

171

86

3

65

8

9

2

2

1

55

177

122

12

生影响，如神经退行性变、年龄相关疾病和癌症

［12］

。过

氧化物体功能障碍与HCC肿瘤细胞中多种代谢紊乱有

关

［13］

。既往研究表明EHHADH与多种肿瘤例如骨肉

［14-16］

瘤、卵巢癌等的发生发展及耐药相关。然而，该基因

在HCC中的表达与作用尚未被阐明。

本研究基于GEO数据库、TCGA数据库、ICGC数

据库等，初步探讨了HCC组织中EHHADH的表达水平

及对HCC的预后影响。推测TP53突变可能与

EHHADH上游基因PPARGC1A转录组水平异常相关，

进一步导致EHHADH转录组水平下调。并推测

EHHADH参与阻止HCC细胞去分化及调控HCC细胞

铁死亡进程。过表达EHHADH可能可以阻止HCC细

胞去分化进程以及可能可以促进HCC细胞铁死亡；索

拉菲尼治疗可能对高表达EHHADH的HCC有效。

1资料和方法

1.1数据来源及筛选（表1）

基于肿瘤基因组图谱数据库（TCGA，can-

/），本研究收集了HCC数据集（LIHC）

及癌旁组织的基因表达数据，同时整理了患者的临

床信息，共包括371例HCC患者数据，其中50例患者同

时含有癌旁组织和肿瘤组织，并将数据集命名为

HCC421。

HCC389

ICGC-LIHC-JP

HCC488

GSE14520

GPL571

GPL3921

240

202

442

189

43

61

171

36

106

247

241

488

146

96

31

211

96

78

3

29

15

4

0

71

19

Unknown

Unknown

Unknown

Unknown

0

0

Unknown

Unknown

Unknown

Unknown

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基于国际癌症基因组联合会数据库（ICGC，

/releases/current/Projects），本研究收集了

240个HCC肿瘤组织样本和202个癌旁样本（ICGC-LI-

HC-JP），并将数据集命名为HCC442。

基于高通量基因表达数据库（GEO，www.

.），本研究收集了247个HCC肿瘤组织样本和

241个癌旁样本的基因表达数据（GSE14250），并将数

据集命名为HCC488。

蛋白质表达谱来自临床蛋白质组学肿瘤分析联盟

（CPTAC，/programs/cp-

tac）和国际癌症蛋白质组联盟（ICPC，-

al）数据集的数据。

1.2组织标本

石蜡组织样本从南方医科大学南方医院获取。纳

入标准：术后病理明确诊断为HCC；手术时年龄≥18岁；

能从病历资料中获取完整的人口学资料、病理诊断结

果、肿瘤分期等信息，暂无随访信息。排除标准：调取蜡

块标本时，研究者判断认为可切片的组织量较少；经研

究者判断，存在其他可能影响存档样本完整性的情况；

术前接受过肝动脉化疗栓塞治疗。符合条件的病例共

30例。上述临床样本的获取由南方医科大学南方医院伦

理委员会审查并批准，伦理批件号为NFEC-2021-207。

1.3GSEA

为初步筛选HCC发生发展中的驱动基因，本研究

运用OmicShare（/tools）进

行GSEA分析。基于HCC488数据集与GSEA算法，探

索了HCC肿瘤组织相对于癌旁组织发生的通路改变。

P<0.05被认为差异具有统计学意义。

Hiplot（）是一款用于科学数据可

视化的综合Web平台。本研究基于Hiplot工具绘制了

显著改变的生物学通路及差异表达基因的韦恩图及渐

变柱状图，从而获得重复出现次数较多的Hub基因。

1.4基因转录组水平差异及生存曲线绘制

为确定EHHADH在HCC中的表达模式，本研究基

于工具UALCAN（/），分析

EHHADH在21种肿瘤、癌旁组织中的差异表达。同时

探讨了HCC细胞去分化程度、TP53突变与EHHADH

表达之间的联系。UALCAN是基于TCGA、CPTAC、

ICPC数据库的全面、用户友好和交互的网络数据资源

［17］

工具，可用于分析癌症OMICS数据。

为分析HCC421数据集与患者临床信息之间的相

关性，本研究在临床生信之家平台（）中，

基于Malta等人构建的OCLR算法来预测mRNAsi，基

［18,19］

于HCC421数据集数据与Spearman相关，并通过线

性变换，将预测的肿瘤细胞干性指数映射到[0,1]范围。

基于单变量Cox回归分析本研究分析了两组数据之间

的生存差异，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

为确定EHHADH独立危险因素，基于HCC421、

HCC488、HCC442数据集与R包“survminer”计算

EHHADH转录组水平最佳分箱值后，通过Hiplot在线可

视化工具展示EHHADH高低表达组之间的生存差异。

1.5基因突变瀑布图及相关性分析

为研究EHHADH在肿瘤基因组层面突变情况，本

研究基于HCC421数据集以及患者的临床信息，利用R

软件中的maftools软件包实现HCC患者的体细胞突变

情况可视化。

为观察上述研究推测的若干个基因与EHHADH

之间的关系，作多个基因与EHHADH相关性热图，基因

之间的相关性展示通过R软件包ggstatsplot与pheatmap

来实现，多基因相关性图通过R软件包pheatmap进行

展示。Spearman相关分析用于分析不符合正态分布的定

量变量之间的相关性，P<0.05为相关性具有统计学意义。

1.6差异基因的功能和通路富集分析

为观察EHHADH与全部基因组间的关联分析从

而探索EHHADH潜在的功能，基于HCC421数据集的

数据，根据各个基因转录组水平，采用Spearman相关性

分析评估两两基因间的相关性，分析获得基因列表。两

基因相关性图通过R软件包ggstatsplot进行实现。

在线工具数据库Metascape（/

gp/#/main/step1）是一个基于Web的门户网

站，旨在为实验生物学家提供全面的基因列表注释和分

析资源

［20］

。使用Metascape，基于上述分析所得到的基

因列表根据相关性从强到弱排序，选取前300个基因

（剔除10个假基因后，最后获得290个基因），将此290

个基因加上EHHADH，共291个基因进行基因本体论

（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书

KEGG通路富集分析，阈值为FDR<0.05。

1.7铁死亡标记基因表达差异

为了对高/低表达EHHADH的HCC样本进行铁死

亡的差异分析，本研究基于HCC421数据集，评估患者

肿瘤组织的铁死亡相关基因的表达与EHHADH表达

之间的联系。结果通过R（v4.0.3）软件包ggplot2和

［21］

pheatmap进行展示。铁死亡相关基因是由Liu等

发现

的一组在肿瘤细胞中发挥功能的基因集。

基于HCC421数据集以及患者的临床信息，

EHHADH基因与各铁死亡相关基因之间的相关性展示

通过R软件包ggstatsplot与pheatmap来实现Spearman

相关分析用于分析不符合正态分布的定量变量之间的

相关性，P<0.05具有统计学意义。

1.8免疫组化分析

首先将石蜡包埋的肝癌组织或远癌正常组织蜡块

以1.5μm连续切片及烤干，使用二甲苯溶液和配制好的

不同浓度的乙醇进行脱蜡，之后使用柠檬酸缓冲液或

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EDTA缓冲液和内源性过氧化物酶进行抗原热修复和

阻断，使用自配的PBS缓冲液冲洗两次，完成以上步骤

后再加入一抗4℃孵育过夜（EHHADH稀释比1∶100，

ShengonBiotechD222276），继续加入新型酶标羊抗兔

IgG聚合物Ⅲ，室温1h，接着使用DAB（中杉金桥有限

公司）显色1min，之后使用苏木精染核1min，最后梯度

脱水并进行封片镜检。

石蜡块用石蜡切片机以1.5μm连续切片。每1例

蜡块随机抽取一张切片进行HE染色，使用二甲苯溶液

和配制好的不同浓度的乙醇进行脱蜡，流水1min后，苏

木素浸泡8min，盐酸酒精分化3s，流水15min反蓝，伊

红3min，最后梯度脱水并进行封片镜检。

2结果

2.1脂肪酸氧化酶相关基因EHHADH下调在HCC最

显著下调信号通路中富集

基于HCC488数据集与GSEA分析，本研究在对

247个HCC组织与相对应的241个癌旁组织进行的差

异分析中共找到了61条KEGG通路（P<0.05）。本研究

分别选取上调与下调KEGG通路中NES值前20的通路

（图1A），并发现下调通路中，脂肪酸氧化酶相关基因

EHHADH基因出现于5条通路中（图1B），且其中4条

（脂肪酸代谢、丁酸代谢、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降

解、色氨酸代谢）与HCC发展相关，从而确定EHHADH

为下调通路中与脂肪酸氧化相关的Hub基因。

A

0123

-log10(Pvalue)

45

B

图1基于HCC488数据集的GSEA分析

Fig.1GSEAanalysisbasedonHCC488dataset.A:Gradienthistogramconsistingofthetop20up-

regulatedanddown-regulatedKEGGpathwaysinHCCtissuescomparedwithnon-tumor

tissuesbasedontheresultsofGSEAanalysis.B:Intersectionofthegenesofthetop20up/down-

regulatedKEGGpathwaysshowinvolvementofEHHADHin5down-regulatedpathways.

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基于上述研究支持，为确定EHHADH在HCC中的

表达模式，基于UALCAN数据库分析HCC组织中

EHHADH基因mRNA表达水平，UALCAN数据库中

TCGA数据库数据显示EHHADH转录组水平的中位数

在远癌正常肝组织以及HCC组织分别是119.136、

52.731每百万转录本（TPM），差异有统计学意义（P<

3.433，图2A）。同时，HCC488数据集和HCC442数据集

中，EHHADH的表达模式与HCC421一致（图2B、C）。

基于UALCAN数据库分析HCC组织中EHHADH

基因编码的蛋白质水平，UALCAN数据库中CPTAC数

据库数据显示，EHHADH的蛋白水平在HCC组相较

于远癌正常组显著下降，差异有统计学意义（P<9.183，

图2D）。此外，免疫组化结果显示，与远癌正常组织相比，

HCC组织中EHHADH的蛋白表达水平较低（图2E~H）。

2.2EHHADH表达下调与TP53移码缺失或错义突变

显著相关

本研究基于HCC421数据库数据，应用Oncoplot

显示HCC患者的体细胞突变景观（图3A）。结果表明

在HCC患者的基因组中TP53突变率最高（突变率为

28%）。在低表达EHHADH组中TP53基因发生移码缺

失或错义突变情况占本组TP53所有突变情况的80%，

在高表达EHHADH组中TP53基因发生移码缺失或错

义突变情况占本组TP53所有突变情况的60%，经卡方

检验，在低表达EHHADH组中TP53基因发生移码缺失

A

T

r

a

n

s

c

r

i

p

t

p

e

r

m

i

l

l

i

o

n

Normalvsprimarytumor

250

P<3.4E-10

200

150

100

50

0

NormalPrimarytumor

(n=50)(n=371)

TCGAsamples

=1.8e-46

****

10

B

=1.4e-19

****

6

4

2

0

E

H

H

A

D

H

e

x

p

r

e

s

s

i

o

n

NormalHCC

(n=202)(n=240)

ICGCHCCJPsamples

Normalvsprimarytumor

P<9.267E-36

C

D

3

2

E

H

H

A

D

H

e

x

p

r

e

s

s

i

o

n

Z

-

v

a

l

u

e

NormalHCC

(n=218)(n=226)

GSE14520samples

Tumor

8

6

1

0

-1

4

-2

NormalPrimarytumor

(n=165)(n=155)

CPTACsamples

NormalTumorNormal

E

×20×20

F

×40

G

×40

H

图2EHHADH在远癌正常组织和肝癌组织中的表达

Fig.2ExpressionofEHHADHinnon-tumortissuesandtumortissuesofHCC.A-C:EHHADHexpressioninHCCandnon-tumor

tissuesfromHCC421dataset,HCC442datasetandHCC488dataset.D:ProteinexpressionofEHHADHinHCCandnon-tumortissues

inCPTACdataset.E-H:RepresentativeresultsofimmunohistochemistryshowingEHHADHexpressioninnon-tumorandHCC

tissues.****P<0.0001.

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或错义突变较高表达组更为明显（P<0.05）。

基于UALCAN数据库中HCC421数据集分析，数

据显示EHHADH基因转录组水平的中位数在TP53突

变组患者HCC组织以及TP53未突变患者HCC组织分

别是44.222、56.033TPM，P<2.532，差异有统计学意义

（图3B）。EHHADH转录组水平在TP53突变组患者中

较TP53未突变患者显著下调。

由于EHHADH基因本身在HCC患者体细胞基因

突变中占比仅约为1%，其转录组水平降低与其本身发

生基因突变的关系不显著。且目前暂未有研究说明

TP53与EHHADH二者间有直接的相互作用关系，所以

我们推测EHHADH上游作用因子受TP53调控进而影

响EHHADH的转录组水平变化。

KEGG（/kegg/）中显示

EHHADH主要参与花生四烯酸代谢途径及PPAR信号

途径等。为了进一步探究EHHADH与PPAR家族的关

系，我们做了以下分析：

基于UALCAN数据库分析HCC组织中上述基因

mRNA表达水平，HCC421数据集显示PPARG、

PPARD、PPARGC1B基因转录组水平在TP53突变组患

者HCC组织较TP53未突变患者HCC组织中显著上

调，PPARGC1A基因转录组水平在TP53突变组患者

HCC组织较TP53未突变患者HCC组织中显著下调

（P<0.05，图3C~F）。基于相关性分析得出EHHADH与

PPARA、PPARGC1A、PPARGC1B在转录水平显著相

关R值分别为0.64、0.22、0.11，且PPARGC1A与

EHHADH的相关性比PPARGC1B与EHHADH相关性

更高（R=0.22>0.11，图3G）。

2.3EHHADH表达与HCC细胞去分化程度显著相关

基于HCC421数据集中EHHADHRNAseq数据和

临床信息进行整合发现，EHHADH的转录组水平差异

与患者年龄及肝细胞去分化程度高度相关（P<0.01，表2）。

UALCAN数据库中TCGA数据库数据也显示

EHHADH基因转录组水平的中位数在HCC细胞去分

化程度Grade1、Grade2、Grade3、Grade4中分别是

80.891、57.812、33.488、31.279TPM。基于HCC421数

据集数据，与Grade1（分化程度高）HCC患者相比，

EHHADH在Grade2（中度分化)、Grade3（分化不良）、

Grade4（未分化）HCC患者中转录组水平下降明显

（P<0.05，图4A）。与Grade2HCC患者相比，EHHADH

在Grade3HCC患者中转录组水平下降明显（P<

0.05）。EHHADH与促进肝细胞去分化相关基因脂肪

酸氧化酶3-羟基辅酶A脱氢酶(HADHA)、乙酰辅酶A

氧化酶（ACOX2）表达呈显著正相关关系，R值分别为

0.47、0.34（P<0.05，图4B、C）。经免疫组化实验验证

HCC癌组织EHHADH量随癌组织分化程度降低而降

低（图5A~X）。

2.4EHHADH低表达与铁死亡相关

利用HCC421数据集，进行全基因组与EHHADH

之间的关联性分析，根据各个基因转录组水平，采用

Spearman相关性分析评估两两基因间的相关性，选取

相关性最高的前300个基因，剔除10个假基因后对这

290个基因及EHHADH，即共291个基因进行GO及

KEGG富集分析（图6A~F）。GO分析结果显示此291

个基因分子功能及生物过程富集于氧化还原酶活性、有

机羟基化合物代谢过程、脂质分解代谢过程，线粒体基

质烯烃化合物代谢过程、脂质稳态、硫化合物代谢过程、

细胞氨基酸生物合成过程等。KEGG信号途径富集于

PPAR信号通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、甘氨

酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。其中大部分信号途径及富

集的生物功能与铁死亡相关，例如氧化还原酶活性、脂

质分解代谢过程、脂质稳态、硫化合物代谢过程、细胞氨

基酸生物合成过程、丙酮酸代谢、PPAR信号通路、氨基

酸代谢过程（图6G）。

基于HCC421数据集，将HCC患者以EHHADH转

录组水平中位数为分界线，分为高、低表达组，通过

wilcox检验分析两组间Ferroptosis分子的表达分布。

结果显示多个铁死亡的相关基因（HSPA5、EMC2、

SLC7A11、NFE2L2、HSPB1、FANCD2、CISD1、

FDFT1、SLC1A5、RPL8、NCOA4、LPCAT3、GLS2、

DPP4、CS、CARS1、ATP5MC3、ACSL4、ATL1）转录组

水平在两组间存在显著差异（图6H~J）。其中

EHHADH转录组水平与负调控铁死亡进程基因

HSPA5、SLC1A5转录组水平呈负相关关系，与正调控

铁死亡进程基因NCOA4、GLS2、DPP4转录组水平呈正

相关关系（P<0.05，R>0.2，图6K）。

免疫组化结果显示在HCC组织中EHHADH蛋白

质表达量与负调控铁死亡的标记基因FTH1蛋白表达

量呈负相关性，与正调控铁死亡的标记基因NCOA4蛋

白表达量呈正相关性（图6L~Q）。

2.5EHHADH低表达与高干性评分相关

使用逻辑回归机器学习算法（OCLR），基于

HCC421数据集中转录组数据，以HCC患者EHHADH

转录组水平中位数为分界线将样本分为EHHADH高

表达组和低表达组，计算干性指数来评估肿瘤细胞的干

性程度。结果显示低表达组的干性评分显著高于高表

达组，即低表达组肿瘤细胞的干性明显强于高表达组

（P=0.0063），低表达组肿瘤细胞增殖能力更强（图7A）。

2.6EHHADH低表达与HCC患者生存预后差相关

基于TCGA数据库，利用Kaplan-Meier生存曲线

分析患者生存率与EHHADH转录组水平的相关性，多

种肿瘤中EHHADH基因单因素Cox分析结果以森林图

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·686·

A

JSouthMedUniv,2023,43(5):680-693

Alteredin328(91.62%)of358samples

B

250

TP53-MutantvsTP53-NoMutantP<2.532E-02

C

TP53-MutantvsTP53-NoMutantP<4.12E-03

D

1.00

50

TP53-MutantvsTP53-NoMutantP<2.298E-02

T

r

a

n

s

c

r

i

p

t

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p

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l

l

i

o

n

200

150

100

50

0

Normal

(n=50)

TP53-MutantTP53-NoMutant

(n=105)(n=255)

TCGAsamples

T

r

a

n

s

c

r

i

p

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p

e

r

m

i

l

l

i

o

n

40

30

20

10

0

Normal

(n=50)

TP53-MutantTP53-NoMutant

(n=105)(n=255)

TCGAsamples

0.75

0.50

0.25

0

Normal

(n=50)

TP53-MutantTP53-NoMutant

(n=105)(n=255)

TCGAsamples

E

60

TP53-MutantvsTP53-NoMutantP<5.811E-04

F

35

TP53-MutantvsTP53-NoMutantP<7.943E-03

G

30

25

20

15

10

5

0

Normal

(n=50)

TP53-MutantTP53-NoMutant

(n=105)(n=255)

TCGAsamples

T

r

a

n

s

c

r

i

p

t

p

e

r

m

i

l

l

i

o

n

40

30

20

10

0

Normal

(n=50)

TP53-MutantTP53-NoMutant

(n=105)(n=255)

TCGAsamples

图3HCC队列的体细胞景观

Fig.3SomaticlandscapeofHCCcohort.A:reorderedbytheir

mutationfrequencies,samplesareorderedbydiseasehistology,asindicatedbytheannotationbar(bottom).Sidebarplotshows

the-log10-transformedq-values,allplotshowsmutationinformationforeachgenefor

plotabovethelegendshowsthenumber

ofmutationburden;B-F:EHHADH/PPARGC1B/PPARGC1A/PPARG/PPARDexpressioninTP53Mutanttumor,TP53Non-

Mutanttumorandnon-tumortissuesinTCGAdata;G:Aheatmapofthecorrelationbetweenmultiplegenesandmultiplegenes.

Bluerepresentspositivecorrelationwhereasredrepresentsnegativecorrelation,thedarkerthecolor,thestrongertherelation

的形式呈现，结果显示在KIRC、LGG、LIHC数据集中

的预后差异显著（P<0.05，图7B）。

利用Hiplot平台，基于HCC421数据集、HCC488

T

r

a

n

s

c

r

i

p

t

p

e

r

m

i

l

l

i

o

n

50

数据集、HCC442数据集进行Kaplan-Meier生存曲线分

析HCC患者生存率与EHHADH转录组水平的相关

性。选取每一数据集的EHHADH转录组水平最优分

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表2HCC421数据集中患者的临床信息

Tab.2ClinicalinformationofpatientsinHCC421datasets

Clinicalindicator

Alive

Dead

Mean(SD)

Median[MIN,MAX]

Female

Male

T1

T2

T3

T3a

T3b

T4

TX

T2a

T2b

I

II

III

IIIA

IIIB

IIIC

IVB

IV

IVA

G1

G2

G3

G4

36

96

47

4

96

39

2

26

3

3

1

EHHADHexp>mid

129

57

61.3(13.2)

64[16,90]

54

132

102

42

20

10

2

7

1

1

1

75

47

1

39

5

6

1

2

1

19

81

75

80.003

0.26

0.173

EHHADHexp≤mid

112

73

57.6(13.7)

59[17,85]

67

118

79

50

25

19

4

6

0.172

0.009

0.095

P

箱点为基线将患者分为高表达组(RHES)和低表达组

（RLES），结果显示预后差异显著，其中HCC421数据

集、HCC488数据集分析结果显示有显著的生存差异

（P<0.05），EHHADH高表达患者的生存时间显著长于

低表达EHHADH患者（图7C、D）；HCC442数据集分析

结果显示没有显著的生存差异（P>0.05，图7E）。

3讨论

本研究通过对HCC488数据集中HCC组织与癌旁

组织进行GSEA分析获得与HCC发展中脂肪酸氧化相

关的Hub基因EHHADH。此基因主要参与过氧化体β

氧化途径，起催化长链二羧酸降解作用，在肝细胞过氧

［7］

化物酶脂肪氧化通路中起到重要作用，且已有研究表

明脂肪酸合成、β氧化和细胞脂质组成的改变会促进

HCC的发生和发展

［22］

，所以本研究聚焦于探究基因

EHHADH在HCC发生发展中的表达和作用。本研究

发现HCC组织相对于癌旁组织，其EHHADH转录组水

平显著下调，EHHADH低表达组预后显著差于高表达

组。且EHHADH低表达组肿瘤细胞的干性明显强于

高表达组，表示低表达组肿瘤细胞增殖能力更强。综

上，EHHADH可作为HCC患者的独立预后因素。

为研究EHHADH低表达促进HCC发展的机制，本

研究通过分析HCC患者的体细胞突变景观发现TP53

的突变与EHHADH的表达相关，KEGG中显示

EHHADH主要参与PPAR信号途径。PPAR信号途径

具有调节细胞周期和新陈代谢的作用，并已报道其参与

［23,24］

多种癌症的发生发展。肝脏作为调控代谢的器官，

PPAR信号途径在HCC中的发生发展中起尤为重要的

作用

［25-27］

。在PPAR信号途径中EHHADH以PPAR家

［9］

族成员依赖的方式发挥其脂肪酸β氧化的功能，其上游

基因主要为PPAR家族基因，包括PPARA、PPARB、

［24］

PPARG、PPARGC1A、PPARGC1B

。本文进一步通过

研究HCC肿瘤细胞中EHHADH表达量与PPAR家族

基因表达量的相关性发现PPARGC1A转录组水平与

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JSouthMedUniv,2023,43(5):680-693

A

ExpressionofEHHADHinHCC421basedontumorgrade

250

200

150

100

50

0

T

r

a

n

s

c

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i

p

t

p

e

r

m

i

l

l

i

o

n

Normal

(n=50)

Grade1

(n=54)

Grade2

(n=173)

TCGAsamples

Grade3

(n=118)

Grade4

(n=12)

B

C

L

o

g

2

(

A

C

O

X

2

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x

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3

2

L

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g

2

(

H

A

D

H

A

e

x

p

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e

s

s

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o

n

)

1.01.52.02.53.0

Log2(EHHADHexpression)

3.3

3.1

2.9

1

2.7

1.01.52.02.53.0

Log2(EHHADHexpression)

图4EHHADH在不同分化程度的HCC组织中的表达

Fig.4ExpressionofEHHADHinHCCtissueswithdifferentdegreesofdifferentiation.A:

EHHADHexpressioninHCCtissueswithdifferentdegreesofdifferentiationfromHCC421

dataset.B,C:Spearmancorrelationanalysisoftheexpressionsofthetwogenes.

TP53突变及EHHADH转录组水平相关。

由于PPARGC1A定位于4号染色体上，最新研究

表明在卵巢癌中TP53突变导致4号染色体上发生显著

［28］

的片段缺失现象。抑癌基因TP53突变是HCC最常见

的基因突变，携带突变型TP53的HCC患者比携带野生

［29,30］

型TP53的患者总生存期（OS）和无复发生存期更短。

多项研究表明，TP53的缺失或错义突变导致线粒体功

［31-34］

能障碍，且TP53错义突变直接导致PPARGC1A编码

［35-37］

的蛋白质PGC-1α水平下降。线粒体功能是转化和

［34,38］

抑制肿瘤生长所必需的，PGC-1α的主要生理功能是

通过促进线粒体氧化磷酸化来控制能量代谢。由于目

前还没有针对PGC-1α本身作用的药物

［39］

，因此，识别

PGC-1α的下游分子从而抑制肿瘤生长至关重要。以往的

研究表明，EHHADH的下调与线粒体脂肪酸氧化途径的

［40］

抑制有关，同时EHHADH转录组水平与PPARGC1A

［41］

转录组水平相关，且低表达EHHADH组的HCC患者

较高表达EHHADH的HCC患者TP53错义突变率更

高。综上，我们猜测在HCC组织中TP53发生缺失或错

义突变导致PPARGC1A转录组水平下降，引发线粒体

功能障碍，最后导致EHHADH转录组水平下降。

在众多致病因素中，HCC肿瘤分化程度与肿瘤生

长速度、转移、血管侵袭以及患者预后密切相关

［3,42-44］

。

在分化良好的HCC中，肿瘤生长缓慢、转移率低，肿瘤

完全切除后复发率低，而肿瘤细胞去分化则促进其增

［45,48］

殖、侵袭，诱导肿瘤在肝内外转移。目前抗癌药物的

研究工作主要集中在开发识别刺激肿瘤细胞死亡的药

物上。然而抗癌的方式不仅于此，还可以尝试指引癌细

胞重新启动分化程序，从而抑制其自我更新复制的进

程。这种方法目前被成功地用于治疗携带PML/RARA

融合基因的急性早幼粒细胞白血病，其中全反式维甲酸

和三氧化二砷诱导白血病细胞向成熟粒细胞的终末分

化并阻止其自我更新

［47］

。成人上皮性肿瘤是否保持潜

在的分化能力，以及细胞调节中的不同结节是否可以被

识别为恢复这种分化潜力的靶点，还需要进一步的

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uthMedUniv,2023,43(5):680-693

HighdifferentiationMediumdifferentiation

·689·

×10

×20

×40

MediumdifferentiationLowdifferentiation

×10

×20

×40

图5不同分化程度的HCC组织切片免疫组化图及H&E图

Fig.5ImmunohistochemicalandHEstainingofHCCtissueswithdifferentdegreesofdifferentiation.A-F/M-R:

RepresentativeimageofimmunohistochemistryshowingEHHADHexpressioninHCCtissueswithdifferentdegrees

ofdifferentiation.G-L/S-X:HEstainingshowingEHHADHexpressioninHCCtissueswithdifferentdegreesof

differentiation.

研究

［48］

。HCC去分化过程中的代谢变化，尤其是脂肪

酸氧化抑制，是HCC去分化过程中的重要特征。在

HCC中，脂肪酸氧化功能障碍导致在去分化过程中过

［49,50］

氧化体的数量减少，脂肪堆积到肿瘤间质，肿瘤细胞

为避免由脂肪酸氧化所产生大量的活性氧物种堆积，其

脂肪酸氧化功能受抑制。因此本研究提出猜想，恢复脂

肪酸氧化代谢稳态可能可以通过恢复肝细胞良好的分

化状态从而改善HCC患者的预后。结合HCC421数据

集中临床数据信息及免疫组织化学结果推测EHHADH

低表达可能导致HCC细胞去分化程度加重相关。

近年来，索拉菲尼作为目前指南推荐晚期HCC患

者全身系统治疗的一线药物，一项纳入了3256例患者

信息的meta分析显示患者中位生存期为12.6（11.15~

［51］

13.8）个月

。已有研究阐明其涉及癌症相关蛋白激酶

靶点的作用机制，这些发现突显了优化索拉非尼与其他

治疗策略联合使用的重要性。既往研究表明索拉菲尼

［52］

是一种铁死亡诱导剂，氧化应激与索拉非尼诱导的肝

癌细胞线粒体功能障碍密切相关，半胱氨酸的耗竭可能

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JSouthMedUniv,2023,43(5):680-693

B

8

6

4

2

0

2.55.07.5

Log2(EHHADHexpression)

8

A

C

10

L

o

g

2

(

A

L

D

H

6

A

1

e

x

p

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s

s

i

o

n

)

L

o

g

2

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M

G

D

H

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)

L

o

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2

(

C

A

T

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n

)

2.55.07.5

Log2(EHHADHexpression)

6

8

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6

2

4

2.55.07.5

Log2(EHHADHexpression)

D

L

o

g

2

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B

1

0

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P

P

P

1

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1

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n

)

E

3.50

F

L

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g

2

(

M

F

S

D

1

0

e

x

p

r

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s

s

i

o

n

)

1.01.52.02.53.0

Log2(EHHADHexpression)

3.5

4.0

3.25

3.00

2.75

2.50

2.25

3.0

2.5

3.5

2.0

1.01.52.02.53.0

Log2(EHHADHexpression)

1.01.52.02.53.0

Log2(EHHADHexpression)

G

01020

-log10(p)

3040

H

15

I

***

**

*

***

***

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EHHADHhighexp

EHHADHlowexp

15

10

5

0

***

**

***

***

***

EHHADHhighexp

EHHADHlowexp

10

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0

C

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1

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2

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M

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H

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4

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1

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1

S

A

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R

R

8

P

L

N

C

O

A

4

图6基因EHHADH与全部基因组间的相关性分

析及EHHADH在HCC中功能和通路的富集分析

Fig.6CorrelationanalysisofEHHADHwiththe

wholegenomeandfunctionandpathway

enrichmentanalysesofEHHADHinHCC.A-C:

Thetop3geneswiththehighestpositive

correlationwithEHHADHinthewholegenome

werecorrelatedwithEHHADH,D-F:Thetop3

geneswiththehighestnegativecorrelationwith

EHHADHinthewholegenomewerecorrelated

withEHHADH;G:Bargraphofenrichedterms

acrossthefirst290genesassociatedwith

EHHADH,coloredbyp-values,H-J:The

expressiondistributionofferroptosis-related

mRNAinEHHADHhighexpressionHCCtissues

andEHHADHlowexpressionHCCtissues.(*P<

0.05,**P<0.01,***P<0.001),K:Aheatmapofthe

correlationbetweenmultiplegenesandEHHADH.

(**P<0.01,*P<0.05),L-M:Representativeimageof

immunohistochemistryshowingEHHADH

expressioninHCCtissue,N-O:Representative

imageofimmunohistochemistryshowingFTH1

expressioninHCCtissue,P-Q:Representative

imageofimmunohistochemistryshowingNCOA4

expressioninHCCtissue.

J

F

e

r

r

o

p

t

o

s

i

s

g

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n

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12

9

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3

0

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***

***

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***

******

**

EHHADHhighexp

EHHADHlowexp

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*P<0.01

**π<0.01

Correlation

C

L

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A

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C

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A

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B

1

A

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C

1

L

S

EHHADHFTH1NCOA4

×20

×20

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B

**

CancerPvalueHazardratio(95%CI)

·691·

A

1.00

=0.0063

0.75

m

R

N

A

s

i

s

c

o

r

e

0.50

0.25

EHHADHhighexp

EHHADHlowexp

0.00

EHHADHhighexpEHHADHlowexp

C

D

E

图7EHHADH表达与HCC患者预后的关系

Fig.7AssociationbetweenEHHADHexpressionandprognosisofHCCpatients.A:Thedistributionof

OCLRscoresinEHHADHhigh/lowexpressiongroups.B:Forestplot:Thep-value,riskcoefficient(HR)

andconfidenceintervalofEHHADHinmultipletumoursareanalyzedbyunivariatecoxregression;C-

E:Kaplan-MeiersurvivalcurveforHCCpatientsinthehigh-andlow-expressionEHHADHgroups.

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·692·

JSouthMedUniv,2023,43(5):680-693

通过诱导铁死亡，从而与索拉非尼发挥协同作用

［53,54］

。

因此，促进肝癌细胞铁死亡可能可以改善肝癌对索拉非

尼的耐药性。铁死亡是一种独特的细胞死亡程序，由依

赖铁的磷脂过氧化驱动，主要特征包括铁堆积、脂质过

［55］

氧化和GSH耗竭。有报道认为脂质过氧化是铁死亡

最后一步的关键因素，脂肪酸代谢和铁死亡之间相互作

用的异常与肿瘤的发生发展、转移和放射治疗抵抗有

关。靶向脂肪酸代谢途径可能可以通过触发铁死亡来

抑制肿瘤的发生和转移

［56］

。本研究通过GO和KEGG

富集分析，发现EHHADH参与的大部分信号途径及富

集的生物功能与铁死亡相关，例如氧化还原酶活性、脂

质分解代谢过程、脂质稳态、硫化合物代谢过程、细胞氨

基酸生物合成过程、丙酮酸代谢、PPAR信号通路、氨基

［57-62］

酸代谢过程。结合铁死亡相关基因的差异分析及免

疫组织化学结果，我们推测EHHADH可能参与细胞铁

死亡调控，并与肿瘤细胞铁死亡逃逸相关。

综上所述，我们猜测由于HCC中发生TP53突变造

成EHHADH转录组水平下调，进而促进了HCC细胞去

分化，并且抑制HCC细胞铁死亡。过表达EHHADH是

否可以阻止并逆转HCC细胞去分化进程，以及是否可

以促进HCC细胞铁死亡，仍需进一步研究。

参考文献：

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metabolism-relatedgenesignatureanditscorrelationwithimmune

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（编辑：孙昌朋）

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